普通小麥–大賴草易位系T5AS-7LrL·7LrS分子細(xì)胞遺傳學(xué)鑒定

王林生 張雅莉 南廣慧

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普通小麥–大賴草易位系T5AS-7LrL·7LrS分子細(xì)胞遺傳學(xué)鑒定

王林生*張雅莉 南廣慧

河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院 /洛陽(yáng)市作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 河南洛陽(yáng) 471023

大賴草對(duì)赤霉病具有較好的抗性, 將大賴草赤霉病抗性基因轉(zhuǎn)入普通小麥, 對(duì)拓寬小麥赤霉病抗性基礎(chǔ)有重要意義。本研究在獲得抗赤霉病普通小麥–大賴草異附加系基礎(chǔ)上, 采用60Co-γ射線(1200 Rad, 劑量率100 Rad min?1)處理小麥–大賴草二體附加系DA7Lr, 并用處理后的花粉授給去雄的普通小麥中國(guó)春, 對(duì)其M1代種子根尖細(xì)胞有絲分裂中期染色體進(jìn)行GISH分析, 獲得1株具有一條普通小麥–大賴草易位染色體的植株, 對(duì)其自交后代中具有2條易位染色體植株的花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中期I觀察發(fā)現(xiàn), 2條易位染色體形成了穩(wěn)定的環(huán)狀二價(jià)體, 表明該植株為純合體。利用順序GISH–雙色FISH分析, 結(jié)合C-分帶、小麥D組?；结極ligo-pAs1-2和B組?；结極ligo-pSc119.2-2, 進(jìn)一步鑒定出該易位系為T(mén)5AS-7LrL·7LrS, 同時(shí)篩選出可追蹤該易位系的3個(gè)EST-STS分子標(biāo)記, 即BE591127、BQ168298和BE591737。該易位系的育成也為小麥赤霉病遺改良提供了新種質(zhì)。

普通小麥–大賴草易位系; 分子細(xì)胞遺傳學(xué); 赤霉病抗性;60Co-γ射線

赤霉病是世界小麥主要病害之一, 隨著全球氣候的變暖, 在我國(guó)由南向北有逐漸蔓延加重趨勢(shì), 近幾年黃淮麥區(qū)的赤霉病大發(fā)生已得到證實(shí), 僅河南省年發(fā)生面積超過(guò)100萬(wàn)公頃。2017年國(guó)審?fù)ㄟ^(guò)的20個(gè)半冬性小麥品種及河南省審定通過(guò)的27個(gè)小麥品種全部感赤霉病, 且多為高感, 究其原因是遺傳基礎(chǔ)狹窄。目前, 生產(chǎn)上使用的赤霉病抗源局限于蘇麥3號(hào)、Frontana等少數(shù)品種及其衍生系, 致使我國(guó)小麥主產(chǎn)區(qū)存在巨大的安全隱患。尋找與拓寬赤霉病抗性資源, 選育和利用抗赤霉病小麥品種是一條經(jīng)濟(jì)有效的措施, 越來(lái)越受到重視。

大賴草()是一種與小麥親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的多年生植物, 具有耐鹽、抗旱、抗多種病害等多種優(yōu)良特性[1-2], 尤其高抗赤霉病, 是一種具有潛在應(yīng)用價(jià)值的基因源。自Mujeeb-Kazi和Rodriguez[3]報(bào)道大賴草抗小麥赤霉病以來(lái), 許多遺傳育種工作者開(kāi)展了大量的研究工作。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞研究所通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交、回交獲得并鑒定出3個(gè)高抗赤霉病的普通小麥一大賴草附加系A(chǔ)ddLr.2、AddLr.7和AddLr.14[4], 其中Lr.2和Lr.14分別屬于小麥第7和第5部分同源群[5]。由于異附加系攜帶的是整條大賴草染色體, 在導(dǎo)入有益基因的同時(shí)也伴隨帶入對(duì)產(chǎn)量、品質(zhì)等農(nóng)藝性狀不利的冗余基因。為此研究者利用電離輻射、殺配子染色體誘導(dǎo)和遺傳控制體系等方法創(chuàng)造易位系, 以減少不利基因?qū)ζ胀ㄐ←溤斐傻牟涣加绊?。劉文軒等[6-8]通過(guò)輻射Lr.14 (5Lr)二體附加系和Lr.2 (7Lr)、Lr.7單體附加系, 選育了純合易位系T6BL·6BS-L.14L、T4BS·4BL- 7Lr#1S-1、T02和T08。楊寶軍等[9]通過(guò)輻射Lr.2和Lr.7單體異附加系獲得易位系NAU618和NAU601。袁建華等[10]采用殺配子染色體誘導(dǎo)方法得到3個(gè)易位系, 分別為T(mén)1DS·Lr7L、T4AL·4AS-Lr7S和T1BL-Lr2S。王林生等[11]通過(guò)60Co-γ射線處理小麥–大賴草二體附加系DA5Lr雌配子, 獲得普通小麥–大賴草染色體相互易位系T7DS·5LrL/T5LrS·7DL; 崔承齊等[12]通過(guò)電離輻射, 得到T7BS·7Lr#1S和T2AS·2AL-7Lr#1S易位系。Wang和Chen[13]證實(shí)7Lr#1S上存在抗赤霉病的主效基因, 后人把7Lr#1S攜帶的抗赤霉病基因定位在該染色體的近端部[12,14]。

本研究利用染色體C-分帶、熒光原位雜交、分子標(biāo)記技術(shù)和赤霉病抗性鑒定等技術(shù), 對(duì)抗赤霉病的普通小麥–大賴草異附加系DA7Lr成熟花粉輻射的后代進(jìn)行鑒定, 篩選出抗赤霉病的普通小麥–大賴草易位系, 為小麥抗赤霉病育種提供新的基因資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

DA7Lr為普通小麥–大賴草二體異附加系[5], 用60Co-γ射線照射其開(kāi)花期麥穗, 照射劑量為1200 Rad, 劑量率100 Rad min?1。普通小麥中國(guó)春去雄, 用上述輻照處理材料的花粉授粉, 其后代種子自交, 獲得M2代, 從中鑒定出純合易位系?？钩嗝共?duì)照品種蘇麥3號(hào)和感赤霉病品種綿陽(yáng)85-45均由河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院小麥遺傳育種研究室引進(jìn)保存。

1.2 染色體制片

1.2.1 根尖細(xì)胞有絲分裂中期 將小麥種子放入墊有濕濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)發(fā)芽(23℃), 待根長(zhǎng)至1.0~2.0 cm時(shí), 剪取1~2條種子根在冰水中處理20~24 h。用無(wú)水乙醇∶冰醋酸(v:v)為3︰1的固定液固定, 4℃冰箱中保存3 d, 然后于45%醋酸中進(jìn)行根尖壓片, 相差顯微鏡下觀察染色體, 放入?70℃冰箱或液氮中冷凍揭去蓋玻片, 脫水備用。

1.2.2 花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中期I 挑取處于減數(shù)分裂中期I的花藥, 用上述固定液固定, 按根尖細(xì)胞有絲分裂中期制片方法壓片備用, 用于易位系花粉母細(xì)胞染色體配對(duì)分析。

1.3 染色體C-分帶和熒光原位雜交

參照Gill和Friebe[15]的方法進(jìn)行染色體C-分帶。參照Mukai等[16]描述的熒光原位雜交方法, 并稍加修改。參照Z(yǔ)hang等[17]的方法順次原位雜交, 首先以熒光素Fluorescein-l2-dUTP標(biāo)記的大賴草基因組DNA為探針進(jìn)行GISH (genomichybridization), 通過(guò)SPOT CCD (charge coupled device)獲取FISH (fluorescencehybridization)圖像, 參照Pedersen和Linde-Laursen[18]描述的方法將信號(hào)洗脫, 再以紅色熒光素TAMRA (6-carboxytetra-methylrhodamine)標(biāo)記的B組?；结極ligo- pSc119.2-2 (其寡核苷酸重復(fù)序列為6-TAMRA-5′- TTCCA CGATT GACGA TTCCG GGGGT GCGTT TACGT GTCCG TCGTC-3′)和綠色熒光素FAM (6-carboxyfluorescein)標(biāo)記的D組?；结極ligo-pAs1-2 (其寡核苷酸重復(fù)序列為FAM-5′- CATTT CATCC ACATA GCATG TGCAA GAAAT TTGAG AGGGT TACGG CAAAA ACTGGAT-3′)進(jìn)行雙色熒光原位雜交, 用DAPI (4’,6-diamidino-2- phenylindole)染色; 單色熒光原位雜交用碘化丙錠(propidium iodide, PI)染色。SPOT CCD獲取圖像, 參考Tang等[19]的標(biāo)準(zhǔn)FISH圖譜分析圖像結(jié)果。所用綠色熒光素和兩種?；结樉缮虾ＳⅡE生物科技有限公司合成。

1.4 分子標(biāo)記鑒定

利用SDS法[20]提取植物基因組DNA。PCR反應(yīng)體系總體積10 μL, 含1× buffer 10mL, 1.5 mmol L?1MgCl2, 模板DNA 20 ng, 200 mmol L?1dNTP, 終濃度為0.2 μmol L?1的左右引物, 0.5 UDNA聚合酶。反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性3 min; 94℃變性30 s, 50~60℃退火40 s, 72℃延伸50 s, 34個(gè)循環(huán); 72℃延伸10 min, 4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳, 硝酸銀染色后照相。

從小麥SNP數(shù)據(jù)庫(kù)(https://wheat.pw.usda.gov/ SNP/new/pcr_primers.shtml)選擇位于小麥第7同源群上的81對(duì)EST-STS引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 篩選出可追蹤易位系的3對(duì)特異引物(表1)。

表1 鑒定易位染色體的特異性引物

1.5 赤霉病抗性鑒定

在河南科技大學(xué)開(kāi)元校區(qū)農(nóng)場(chǎng)進(jìn)行抗性鑒定, 按照隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì), 每個(gè)處理3次重復(fù), 每個(gè)小區(qū)播種20行, 行長(zhǎng)2 m, 行距21 cm, 株距5 cm, 開(kāi)溝點(diǎn)播。采用王裕中等[21]的單花滴注法接種禾谷鐮刀菌(由河南科技大學(xué)林學(xué)院植物病理學(xué)系徐建強(qiáng)博士提供菌種), 接種后早、晚2次噴霧, 保證發(fā)病濕度。2015—2017年連續(xù)3年均使用編號(hào)為L(zhǎng)HLY-2的高強(qiáng)毒菌株分生孢子懸浮液接種, 每小區(qū)接種10穗, 接種21 d后調(diào)查接種穗的發(fā)病小穗數(shù)和總小穗數(shù)。病小穗率(%) = (病小穗數(shù)/總小數(shù)) × 100。采用SPSS20.0軟件分析不同材料間的抗病性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 易位系T5AS-7LrL·7LrS的分子細(xì)胞遺傳學(xué)鑒定

用DA7Lr經(jīng)輻射處理的花粉, 授給已去雄的中國(guó)春, 獲得11粒種子, 發(fā)現(xiàn)其中編號(hào)為NGH-01的單株具有1條普通小麥–大賴草易位染色體。從該材料自交后代(M2代)種子中得到一株含有2條易位染色體的單株, 有絲分裂中期染色體制片觀察結(jié)果顯示2= 44 (圖1)。

以綠色熒光標(biāo)記的大賴草基因組DNA作為探針, 對(duì)NGH-01純合單株根尖染色體制片進(jìn)行GISH分析。在450~490 nm激發(fā)光波長(zhǎng)下觀察到易位染色體的大賴草片段有彌散的黃綠色熒光雜交信號(hào), 且染色體末端的熒光雜交信號(hào)明顯強(qiáng)于其他部分, 小麥染色體的易位片段大約占易位染色體短臂的1/2, 而大賴草染色體易位片段占整個(gè)易位染色體的長(zhǎng)臂及短臂的1/2區(qū)段, 約占易位染色體全長(zhǎng)的80%, 屬于染色體大片段易位(圖1-A)。

圖1 易位系T5AS-7LrL·7LrS熒光原位雜交(2n=44)

有絲分裂中期的順次GISH-FISH, A圖中綠色信號(hào)為Fluorescein-l2-dUTP標(biāo)記的大賴草基因組DNA, B圖中的紅色信號(hào)為T(mén)ARAM標(biāo)記的Oligo-pSc119.2-2, 綠色信號(hào)為6-FAM標(biāo)記的Oligo-pAs1-2, 箭頭指示易位染色體。

Sequential GISH–FISH of mitotic metaphase chromosomes. In panel A,genomic DNA was labeled with fluorescein-12-dUTP and visualized with green signals. In panel B, Oligo-pSc119.2-2 was labeled with TARAM and visualized with red signals ,and Oligo-pAs1-2 was labeled with 6-FAM and visua-lized with green signals. The arrows show translocation chromosomes.

將上述片子的信號(hào)洗脫干凈, 再以紅色熒光標(biāo)記的小麥B組?；结樄丫酆塑账酧ligo-pSc119.2-2和綠色熒光標(biāo)記的小麥D組?；结樄丫酆塑账酧ligo-pAs1-2為探針進(jìn)行雙色FISH分析, 發(fā)現(xiàn)在易位染色體短臂頂端(小麥染色體片段)有兩個(gè)比較明顯的紅色點(diǎn)狀雜交信號(hào), 但在小麥染色體片段上沒(méi)有發(fā)現(xiàn)綠色雜交信號(hào)。參照Tang等[19]的標(biāo)準(zhǔn)圖譜, 符合這一熒光雜交信號(hào)特征的小麥染色體有5A、2B、4B、6B、2D、3D和4D, 而小麥染色體2D、3D和4D端部或近端部除了有Oligo-pSc119.2-2雜交信號(hào)同時(shí)還應(yīng)具有Oligo-pAs1-2熒光信號(hào)。該易位染色體小麥片段上只有Oligo-pSc119.2-2的雜交信號(hào), 因此可排除2D、3D和4D染色體(圖1-B)。結(jié)合C-分帶結(jié)果, 2B、4B和6B染色體短臂的端部和近端部都有較強(qiáng)的C帶, 而易位染色體小麥片段上只有較弱的C帶(圖2), 故可排除2B、4B和6B染色體, 發(fā)生易位的應(yīng)為5A染色體, 且為5A短臂的端部片段。

圖2 易位染色體T5AS-7LrL·7LrS的C-分帶及熒光原位雜交

從左至右依次為C-分帶的5A、C-分帶的T5AS-7LrL·7LrS、熒光原位雜交的T5AS-7LrL·7LrS、Oligo-pSc119.2-2 (紅色)雜交的T5AS-7LrL·7LrS、Oligo-pSc119.2-2 (綠色)雜交的5A、熒光原位雜交的7Lr和C分帶的7Lr。

Chromosomes from left to right are C-banded 5A, C-banded T5AS-7LrL·7LrS, FISH T5AS-7LrL·7LrS, T5AS-7LrL·7LrS with red Oligo-pSc119.2-2, 5A with green Oligo-pSc119.2-2, FISH 7Lr, and C-banded 7Lr.

C-分帶熒光原位雜交對(duì)比發(fā)現(xiàn), 大賴草7LrL頂端有很強(qiáng)的熒光原位雜交信號(hào), 易位的大賴草7Lr染色體片段包含了整個(gè)7LrS短臂和一部分7LrL長(zhǎng)臂, 熒光原位雜交結(jié)果該易位染色體與7Lr相符(圖2)。對(duì)其花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中期I染色體配對(duì)行為觀察, 發(fā)現(xiàn)其易位染色體正常配對(duì), 形成穩(wěn)定的環(huán)狀二價(jià)體(圖3)。綜上所述, 將該易位系命名為T(mén)5AS-7LrL·7LrS。

2.2 易位系T5AS-7LrL·7LrS的分子標(biāo)記鑒定

利用位于小麥第7部分同源群不同區(qū)段的81對(duì)EST-STS引物進(jìn)行多態(tài)性分析, 發(fā)現(xiàn)BE591127、BQ168298和BE591737在大賴草、DA7Lr和易位系T5AS-7LrL·7LrS上有特異擴(kuò)增。這3個(gè)標(biāo)記分別定位在7AS、7BS和7DS上, 可用于追蹤大賴草染色體片段, 特異擴(kuò)增條帶大小分別為1000、1733和398 bp (圖4)。

2.3 易位系T5AS-7LrL·7LrS的赤霉病抗性鑒定

經(jīng)過(guò)連續(xù)3年的赤霉病接種鑒定結(jié)果表明, 易位系T5AS-7LrL·7LrS的病小穗率顯著低于感病親本中國(guó)春和感病對(duì)照綿陽(yáng)8545, 但稍高于抗病對(duì)照蘇麥3號(hào)(表1和圖5), 表現(xiàn)出較好的赤霉病抗性。

圖3 易位系T5AS-7LrL·7LrS花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中期I染色體的熒光原位雜交

圖中綠色信號(hào)為熒光素Fluorescein-l2-dUTP標(biāo)記的大賴草基因組DNA, 箭頭指示配對(duì)的二價(jià)體易位染色體T5AS-7LrL·7LrS。

genomic DNA was labeled with Fluorescein-l2-dUTPand visualized with green signals. The arrow shows the ring bivalent formed by a pair of translocation chromosomes T5AS-7LrL·7LrS.

圖4 引物BE591127、BQ168298和BE591737的PCR擴(kuò)增結(jié)果

1: 中國(guó)春; 2: 大賴草; 3: DA7Lr; 4: T5AS-7LrL·7LrS。

1: Chinese Spring; 2:(Lr); 3: DA7Lr; 4: T5AS-7LrL·7LrS.

表1 不同材料赤霉病抗性(病小穗率)的田間鑒定

**表示與中國(guó)春在0.01概率水平上有顯著差異。

**indicate significant difference at< 0.01 compared with Chinese Spring.

圖5 易位系T5AS-7LrL·7LrS的赤霉病抗性鑒定

A: T5AS-7LrL·7LrS; B: 中國(guó)春; C: 綿陽(yáng)85-45; D: 蘇麥3號(hào)。

A: T5AS-7LrL·7LrS; B: Chinese Spring; C: Mianyang 85-45; D: Sumai 3.

3 討論

通過(guò)電離輻射將外源遺傳物質(zhì)導(dǎo)入普通小麥已成為拓寬小麥育種遺傳基礎(chǔ)的有效途徑。自從1956年Sears[22]獲得小麥–小傘山羊草易位系以來(lái), 采用電離輻射創(chuàng)造了許多具有外源有益基因的小麥新種質(zhì)[23-28], 為小麥育種開(kāi)拓了新視野。但由于電離輻射造成染色體斷裂重接完全是隨機(jī)的, 產(chǎn)生的易位染色體補(bǔ)償性往往較差, 直接利用還存在一定困難, 因此, 創(chuàng)造攜帶外源有益基因的補(bǔ)償性易位, 尤其是中間插入小片段易位, 已成為研究者追求的目標(biāo)。

Chen等[29]通過(guò)電離輻射選育的小麥一簇毛麥T6AL/6VS補(bǔ)償性易位系, 目前已經(jīng)成為我國(guó)小麥抗白粉病育種的重要親本, 以此易位系為親本, 已選育出20 余個(gè)小麥新品種并在生產(chǎn)上大面積推廣[30]。本研究利用C-分帶結(jié)合順序GISH–FISH, 從普通小麥–大賴草7Lr二體異附加系輻射后代中選育出的易位系T5AS-7LrL·7LrS, 屬于非補(bǔ)償性易位, 且易位染色體具有較長(zhǎng)的大賴草染色體片段, 超過(guò)整條染色體的80%, 攜帶大賴草許多冗余基因, 對(duì)小麥的農(nóng)藝性狀造成一定的負(fù)面效應(yīng), 主要表現(xiàn)為植株偏高、晚熟、穗部頂端有禿尖、千粒重低、結(jié)實(shí)性差等問(wèn)題。但該易位系經(jīng)鑒定對(duì)赤霉病有較高的抗性, 3年的病小穗率分別為8.70%、11.22%和9.67%, 顯著低于感病品種中國(guó)春和綿陽(yáng)85-45, 表明其具有抗赤霉病的主效基因, 可以作為抗赤霉病的新資源。本課題組正在以該易位系為材料, 采用輻射、殺配子染色體誘導(dǎo)等手段創(chuàng)造小片段易位系, 同時(shí)與當(dāng)前黃淮海主推骨干品種回交, 以期選育出農(nóng)藝性狀優(yōu)良, 在生產(chǎn)上可利用的抗赤霉病小麥新品系。

本研究分析了易位染色體5AS-7LrL·7LrS的配子傳遞特性, 發(fā)現(xiàn)該易位染色體具有花粉的優(yōu)先傳遞性, 但對(duì)其易位系所產(chǎn)生的花粉育性觀察發(fā)現(xiàn), 沒(méi)有大量的不育花粉, 育性基本正常, 表明該易位染色體具有與殺配子染色體不同的花粉優(yōu)先傳遞基因。

Subbarao等[29]研究發(fā)現(xiàn)大賴草第7部分同源群染色體上攜有生物硝化抑制基因, 將其導(dǎo)入栽培小麥, 可延緩銨態(tài)氮(NH4+-N)向硝態(tài)氮(NO3－)的轉(zhuǎn)化,減少土壤中氮的損失, 改善作物氮素營(yíng)養(yǎng), 提高氮素利用率。同時(shí)也減少地表水和地下水的污染。本研究創(chuàng)造的易位系T5AS-7LrL·7LrS, 是大賴草第7部分同源群染色體與普通小麥染色體發(fā)生的易位, 因此, 在易位系獲得抗赤霉病的同時(shí)有可能又具有生物硝化抑制特性, 成為有雙重利用價(jià)值的種質(zhì)資源, 在小麥生產(chǎn)中發(fā)揮更大的作用。

4 結(jié)論

采用電離輻射的方法創(chuàng)造普通小麥大賴草易位系, 利用C-分帶、GISH–FISH雙色熒光原位雜交技術(shù)鑒定出易位系T5AS-7LrL·7LrS, 并篩選出3個(gè)在易位系T5AS-7LrL·7LrS上有特異擴(kuò)增的EST-STS多態(tài)性標(biāo)記, 可用于追蹤大賴草染色體片段。

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Molecular and Cytogenetic Identification of–Translocation Line T5AS-7LrL·7LrS

WANG Lin-Sheng*, ZHANG Ya-Li, and NAN Guang-Hui

Key Laboratory of Crop Genetic Improvement and Germplasm Innovation / College of Agriculture, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, Henan, China

is highly resistant to wheat scab. The transfer of resistance genes fromto common wheat () is important for broadening the resistant sources against scab in common wheat. In this study, the pollen of DA7Lr, a–disomic addition line with scab resistance, was irradiated with60Co-γ ray at 1200 Rad (100 Rad min?1) before pollinating to emasculatedcv. Chinese Spring. One plant with one translocation chromosome was detected in the M1generation by GISH. This plant was then self-pollinated and the pollen mother cells (PMCs) of the offspring plants with two translocation chromosomes were cytologically observed, and one ring bivalent was found at meiotic metaphase I, indicating that the plant with two translocation chromosomes was one translocation homozygote. The translocation line was proved to be T5AS-7LrL·7LrS by C-banding, and sequential GISH–FISH using Oligo-pAs1-2 and Oligo-pSc119.2-2 as probes. Three EST-STS markers (BE591127, BQ168298, and BE591737)were identified to be able to track theT5AS-7LrL·7LrSline. The translocation line also serves as an resistant source against wheat scab in wheat breeding programs.

–translocation line; molecular cytogenetics; scab resistance;60Co-γ ray

2018-03-07;

2018-06-12;

2018-07-17.

10.3724/SP.J.1006.2018.01442

王林生, E-mail: 964965931@qq.com

本研究由國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31501301), 河南省國(guó)際合作項(xiàng)目(172102410052)和河南省教育廳自然科學(xué)研究項(xiàng)目(2011A180011)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31501301), the International Cooperation Program of Henan Pro-vince (172102410052), and the Natural Science Research Program of Henan Education Department (2011A180011).

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20180717.1355.002.html