福建省首例人感染H5N6禽流感病例實(shí)驗(yàn)室診斷與病毒序列初步分析

流感病毒屬于正粘病毒科,為分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA病毒,其基因包括8個(gè)節(jié)段。甲型流感病毒根據(jù)血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的抗原性的不同,可以分為H1-H18和N1-N11［1］。目前發(fā)現(xiàn)能感染人的禽流感亞型有:H4N8、H5N1、H5N6、H6N1、H7N2、H7N3、 H7N4、 H7N7、 H7N9、 H9N2、H10N7和H10N8［2-3］,自1996年中國(guó)南方省份報(bào)道鵝群發(fā)生高致病性H5N1禽流感病毒初次暴發(fā)以來(lái)［4-5］,在東半球其他國(guó)家和地區(qū)的鳥(niǎo)和禽類(lèi)中持續(xù)傳播著此類(lèi)高致病性H5亞型禽流感病毒并偶爾感染到人,且H5亞型禽流感病毒隨著時(shí)間推移進(jìn)行了不斷重組和進(jìn)化,產(chǎn)生了多種分枝和基因型別。自2014年四川省首次報(bào)道人感染H5N6禽流感病例以來(lái)［6］,截止2018年2月28日,全球累計(jì)報(bào)告人感染H5N6禽流感病例19例［7］,共計(jì)死亡14例,病死率高達(dá)73.7%,所有病例均來(lái)自中國(guó),呈散發(fā)態(tài)勢(shì),至今尚未有證據(jù)表明具有人傳人的特征。福建省本次發(fā)現(xiàn)的人感染H5N6禽流感病例是最新報(bào)道事件,該患者來(lái)自于流感監(jiān)測(cè)哨點(diǎn)醫(yī)院中的流感樣監(jiān)測(cè)病例(ILI),經(jīng)中國(guó)疾病預(yù)防控制中心復(fù)核確認(rèn)。進(jìn)一步認(rèn)識(shí)人感染H5N6禽流感疫情特點(diǎn),有助于探索科學(xué)有序的防控策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來(lái)源:患者,女,4歲,2017年12月19日發(fā)病,最高體溫39.8℃,就診于三明市流感監(jiān)測(cè)哨點(diǎn)醫(yī)院。采集上呼吸道咽拭子標(biāo)本,低溫冷藏送至三明市疾病預(yù)防控制中心進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí),采集患者家禽圈和相關(guān)活禽A市場(chǎng)外環(huán)境標(biāo)本。標(biāo)本采集獲得患者家屬知情同意。

1.1.2 試劑儀器:病毒RNA提取試劑盒購(gòu)置于QIAgen公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit(批號(hào):52906),熒光定量PCR試劑盒購(gòu)置于上海之江生物技術(shù)有限公司,一步法RT-PCR試劑盒為T(mén)aKaRa公司的PrimeScirptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2(批號(hào):RR057A)。主要儀器有:ABI7500熒光PCR檢測(cè)儀,Bio-Rad PCR儀和電泳儀,Eppendorf高速離心機(jī)。

1.1.3 引物:由福建省疾控中心自行設(shè)計(jì)并提供,見(jiàn)表1。

1.2 方法

1.2.1 核酸提取:標(biāo)本以280 μl裂解,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行核酸提取,終以 50 μl洗脫 RNA,-70℃保存。

1.2.2 熒光定量 PCR:對(duì)標(biāo)本進(jìn)行流感 A、B、H1N1、H3N2、H7N9、H5N6 和 H9 型別的熒光定量PCR檢測(cè),按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.3 病毒分離:標(biāo)本送至福建省疾病預(yù)防控制中心BSL-3實(shí)驗(yàn)室,采用9～11日齡雞胚進(jìn)行病毒分離。

1.2.4 一步法RT-PCR與測(cè)序:按照TaKaRa試劑盒說(shuō)明書(shū)配制50 μl反應(yīng)體系如下:2×one step buffer(Dye plus)25 μl,PrimeScript one step Enzyme Mix 2 μl,上下游引物各 2 μl(10 μmol/L),病毒RNA 5 μl,RNase Free dH2O 14 μl。 反應(yīng)條件為:50 ℃ 30 min,94 ℃ 2 min；94℃30 s＼60℃30 s＼72℃90 s,循環(huán)35次；72℃ 10 min,4℃保溫。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)鑒定后送鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

表1 流感病毒HA和NA基因擴(kuò)增通用引物Tab.1 Universal primers of HA and NA gene of influenza virus used in RT-PCR

1.2.5 序列拼接與分析:用DNAStar 7.1和MEGA 5.1軟件對(duì)序列進(jìn)行拼接,將病毒基因序列在GenBank中作BLAST比對(duì)。從GenBank和GISAID中下載相關(guān)HA和NA基因序列,繪制基因進(jìn)化樹(shù)圖。初步分析HA基因切割位點(diǎn)氨基酸基因特征。

2 結(jié)果

2.1 熒光定量PCR結(jié)果 按時(shí)間順序,一共采集5次病例咽拭子標(biāo)本,前3次咽拭子標(biāo)本流感A型通用、H5和N6熒光定量PCR檢測(cè)均陽(yáng)性,而B(niǎo)、H1N1、H3N2、H7N9和H9型流感均未檢出；后2次采集的咽拭子標(biāo)本A型通用、H5和N6項(xiàng)目檢測(cè)均陰性,見(jiàn)表2。采集43份外環(huán)境相關(guān)標(biāo)本,共計(jì)檢出16份H5陽(yáng)性標(biāo)本,外環(huán)境標(biāo)本檢測(cè)情況詳見(jiàn)表3。2017年12月29日,福建省疾病預(yù)防控制中心復(fù)核標(biāo)本為H5N6陽(yáng)性,2018年1月5日經(jīng)中國(guó)疾病預(yù)防控制中心復(fù)核和確認(rèn),結(jié)合病例臨床表現(xiàn)和流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果,報(bào)告為福建省首例確診人感染H5N6禽流感病例,病毒被命名為:A/Fujian-Sanyuan/21099/2017(H5N6)。

2.2 病毒分離與測(cè)序結(jié)果 標(biāo)本經(jīng)雞胚培養(yǎng)72 h,收獲病毒,采用血凝試驗(yàn)鑒定病毒滴度為1∶64；提取病毒RNA,經(jīng)一步法RT-PCR擴(kuò)增獲得病例標(biāo)本病毒的HA和NA基因片段,各片段經(jīng)雙向測(cè)序和拼接后,獲得HA和NA基因全長(zhǎng)序列(HA:1 704 bp,NA:1 380 bp)。與此同時(shí),還獲得病例家禽圈一份外環(huán)境標(biāo)本HA基因全長(zhǎng)序列,病毒被命名為:A/Environment/Fujiansanyuan/08/2017。

2.3 BLAST比對(duì)與同源性分析 將HA和NA全長(zhǎng)序列輸入NCBI網(wǎng)站的GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì),發(fā)現(xiàn)HA基因序列與A/Cygnus atratus/Hubei/2Z2-O/2016(H5N8)病毒序列同源性最高,達(dá)99.6%；NA基因序列與A/chicken/Hubei/ZYSJF16/2016(H5N6)病毒序列同源性最高,達(dá)99.0%；可證實(shí)該患者感染H5N6流感病毒,見(jiàn)圖1。通過(guò)繪制基因進(jìn)化樹(shù)發(fā)現(xiàn),A/Fujian-Sanyuan/21099/2017病毒的HA基因與患者家養(yǎng)禽場(chǎng)所外環(huán)境中檢測(cè)的一份病毒序列同源性最高,達(dá)100%,其序列高度同源于2015—2016年H5N8病毒株,也高度同源于2017年禽間H5N6病毒株；與我國(guó)人感染H5N6病毒株序列比較發(fā)現(xiàn)和2014年的四川病毒株更接近,處同一分枝中,而與其他地區(qū)的人感染H5N6病毒株在不同分枝中。A/Fujian-Sanyuan/21099/2017病毒的NA基因與人感染H5N6的四川病毒株在不同分枝中,而與其他地區(qū)的人感染H5N6病毒株同處在一個(gè)分枝中。

2.4 切割位點(diǎn)氨基酸分析 通過(guò)酶作用HA將被切割為HA1和HA2兩段,本次實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)A/Fujian-Sanyuan/21099/2017病毒的HA基因切割位點(diǎn)具有多個(gè)堿性氨基酸R,氨基酸序列為PLREK RRKR﹡GLF。

3 討論

根據(jù)臨床表現(xiàn)、流行病學(xué)特征和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)可以判定該事件是一起人感染H5N6禽流感病毒疫情,為全球第19例確診病例,系福建省首例確診病例。該患者來(lái)自流感監(jiān)測(cè)哨點(diǎn)醫(yī)院ILI監(jiān)測(cè)病例,臨床表現(xiàn)為輕癥流感樣癥狀,因患者母親為醫(yī)務(wù)工作者,在2017年12月19日患者發(fā)病的當(dāng)天即給予了奧司他韋(達(dá)菲)進(jìn)行治療,至12月22日后患者未再出現(xiàn)發(fā)熱癥狀,但通過(guò)表2可知患者體內(nèi)帶毒一直持續(xù)到12月29日,提示人感染H5N6病毒患者癥狀消失后仍可繼續(xù)攜帶病毒一段時(shí)間,這段時(shí)間仍需隔離病例防止進(jìn)一步傳播。從既往文獻(xiàn)報(bào)道來(lái)看［6,8-10］,人感染H5N6病毒患者大多數(shù)為重癥病例,且病死率高,他們往往在發(fā)病早期忽視就診或就診于鄉(xiāng)村、社區(qū)衛(wèi)生診所,未及時(shí)給予抗流感病毒藥物治療,導(dǎo)致病情惡化甚至死亡,本次疫情案件中的患者在第一時(shí)間就給予抗流感病毒藥物治療,及時(shí)控制了病情的進(jìn)一步發(fā)展,患者很快康復(fù),提示:在有活禽或活禽場(chǎng)所暴露史前提下出現(xiàn)流感樣癥狀的輕癥患者一定要早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療。

表2 病例咽拭子標(biāo)本流感H5N6亞型熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果Tab.2 Real-time PCR results of influenza A(H5N6)virus in the throat-swab specimens from the patient

圖1 A/Fujian-Sanyuan/21099/2017病毒HA和NA基因進(jìn)化樹(shù)分析Note:The sequence of the H5N6 virus in our study is marked by▲,and the sequences of H5N6 viruses isolated from the other H5N6 cases in China are marked by●.All viral strains are influenza H5N6 viruses,which are not marked with subtype behind them.Fig.1 Phylogenetic analysis of HA and NA genes from A/Fujian-Sanyuan/21099/2017 virus

表3 病例相關(guān)外環(huán)境標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Tab.3 Detection results of the specimens from patients’surrounding environment

從外環(huán)境標(biāo)本監(jiān)測(cè)和測(cè)序發(fā)現(xiàn),三明市活禽交易市場(chǎng)中存在H5亞型禽流感病毒,與此同時(shí)在患者家中養(yǎng)禽場(chǎng)所檢測(cè)出1份H5亞型禽流感病毒陽(yáng)性標(biāo)本,經(jīng)測(cè)序獲得其序列,與患者感染的H5N6病毒HA基因保持100%同源,從生物信息學(xué)角度證明患者感染的來(lái)源為家禽或養(yǎng)禽的外環(huán)境場(chǎng)所。所以,推行集中養(yǎng)殖、集中屠宰、冰鮮上市、減少活禽接觸或活禽環(huán)境暴露可以有效地防止人感染禽流感。通過(guò)對(duì)福建省首例人感染H5N6禽流感病毒HA和NA基因分析發(fā)現(xiàn),HA基因與湖北省天鵝中分離到的H5N8病毒高度同源,而NA也與湖北省雞中分離的H5N6病毒高度同源,與既往報(bào)道的人感染H5N6禽流感病毒基因來(lái)源存在不同,也提示H5N6病毒在不斷地進(jìn)化和重組過(guò)程(圖1)。在基因進(jìn)化樹(shù)中,A/Fujian-Sanyuan/21099/2017病毒HA基因與2014年四川人感染H5N6病毒株處同一分枝,而NA基因卻處另一分枝,也說(shuō)明H5N6病毒的表面基因存在重排的情況,我國(guó)禽和畜間流感病毒錯(cuò)綜復(fù)雜,還需進(jìn)一步結(jié)合分析病毒的內(nèi)部基因來(lái)明確基因重組的過(guò)程,為科學(xué)防控奠定基礎(chǔ)。本次研究的A/Fujian-Sanyuan/21099/2017病毒HA基因切割位點(diǎn)具備多個(gè)堿性氨基酸R,符合高致病性禽流感特征［11］,與既往人感染H5N6禽流感病毒HA基因切割位點(diǎn)大體一致。

綜上所述,福建省首次發(fā)現(xiàn)人感染高致病性H5N6禽流感病例,病毒HA和NA基因存在一定的變異變遷,加上福建地處長(zhǎng)三角和珠三角之間,水網(wǎng)發(fā)達(dá)、候鳥(niǎo)遷徙和禽間流感病毒錯(cuò)綜復(fù)雜等因素,研究人員需密切關(guān)注H5N6禽流感病毒基因的分子演化和重組情況,加快研發(fā)抗病毒藥物和疫苗,為人感染H5N6禽流感疫情防控奠定基礎(chǔ)。

利益沖突 無(wú)