α1,3-D-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因425C→T突變導(dǎo)致B3亞型分析

崔文燕，王鈺菁，鄒 緯，王學(xué)鋒，蔡曉紅

1)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院輸血科 鄭州 450014 2)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院輸血科 上海 200025

ABO血型亞型是紅細(xì)胞膜上ABO血型抗原決定簇?cái)?shù)量或性質(zhì)發(fā)生改變所致，具有明確的血清學(xué)特點(diǎn)，并且具有遺傳基礎(chǔ)。ABO血型亞型產(chǎn)生的主要原因是ABO基因第6或第7外顯子發(fā)生了點(diǎn)突變或者ABO基因內(nèi)發(fā)生了交換或重組，降低或改變了糖基轉(zhuǎn)移酶的活性，導(dǎo)致抗原弱表達(dá)或變異，致使血型血清學(xué)表現(xiàn)為紅細(xì)胞抗原凝集減弱，混合視野凝集，血清中出現(xiàn)不規(guī)則抗A、抗B抗體或抗A、抗B抗體凝集減弱，從而給血型鑒定工作帶來(lái)了困擾[1-4]。作者通過(guò)手術(shù)備血發(fā)現(xiàn)一例B3亞型，ABO血型鑒定正反定型不一致，對(duì)其家系采集標(biāo)本并進(jìn)行DNA突變位點(diǎn)研究，進(jìn)一步探討B(tài)3亞型的分子機(jī)制及遺傳特性。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象先證者為瑞金醫(yī)院患者，男，92歲，漢族，既往無(wú)特殊病史，無(wú)輸血獻(xiàn)血史，家族中無(wú)遺傳病史。因膽囊結(jié)石行手術(shù)切除，ABO血型鑒定正反定型不一致，并用試管法進(jìn)行復(fù)檢。采集其兒子、女兒血標(biāo)本進(jìn)行分析，家系圖見(jiàn)圖1。所有標(biāo)本均為EDTA 抗凝外周靜脈血5 mL。

□：男性；○：女性； ■：B3亞型者；→：先證者圖1 家系圖譜

1.2試劑與儀器單克隆抗A、抗B試劑(批號(hào)：20161015)，ABO反定型標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞(批號(hào):20175335)，不規(guī)則抗體篩檢號(hào)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ細(xì)胞(批號(hào)：20170737)，抗H試劑(批號(hào)：20160707)均由上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司提供；全自動(dòng)血型分析儀(強(qiáng)生公司，型號(hào)：AutoVueInnova)；血液基因組DNA抽提試劑盒(德國(guó)QIGEN公司，批號(hào)：148039042)；TaKaRa LA Tap酶(日本TaKaRa公司，批號(hào)：RR02MA)；PCR儀(美國(guó)ABI公司，貨號(hào)：4483636)；DNA測(cè)序儀(美國(guó)ABI公司，型號(hào)：PRISM377)；離心機(jī) (日本久保田公司，型號(hào)：KA-2200)。

1.3血清學(xué)檢測(cè)將EDTA抗凝外周全血離心取紅細(xì)胞做ABO血型正定型，血漿做反定型，并做自身對(duì)照。紅細(xì)胞H抗原檢測(cè)中取B細(xì)胞和O細(xì)胞為對(duì)照細(xì)胞，抗體篩查細(xì)胞檢測(cè)血清中有無(wú)不規(guī)則抗體。

1.4α1,3-D-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性檢測(cè)①指示紅細(xì)胞的制備：挑選3人份O型獻(xiàn)血者紅細(xì)胞，用生理鹽水洗3遍，取壓積紅細(xì)胞10 μL，加入100 μL反應(yīng)液[0.05 mol/L咪唑緩沖液(pH 6.5)10 μL，25 mmol/L氯化鎂10 μL，0.15 mol/L氯化鈉10 μL，0.5 mmol/L UDP-Gal 10 μL，體積分?jǐn)?shù)0.5% BSA 10 μL，待檢血漿50 μL]中，總體積110 μL，37 ℃ 水浴4 h后用生理鹽水洗3遍，再配制成體積分?jǐn)?shù)5%紅細(xì)胞懸液待用。②標(biāo)準(zhǔn)血清的稀釋：將單克隆抗B抗體用生理鹽水按體積比11、12、14、18、116、132、164、1128進(jìn)行倍比稀釋后待用。③酶活性檢測(cè)：取50 μL的指示紅細(xì)胞懸液與50 μL不同稀釋度的單克隆抗B混和后置室溫反應(yīng)20 min，1 000 r/min離心30 s，通過(guò)肉眼和顯微鏡觀察凝集強(qiáng)度，血漿酶活性強(qiáng)度以發(fā)生凝集的抗體最高滴度來(lái)表示，并選取B型和O型各3人份獻(xiàn)血者血漿做陽(yáng)性和陰性對(duì)照。

1.5基因測(cè)序①DNA提取和PCR擴(kuò)增。取200 μL白膜層血樣，用QIAamp試劑盒提取全基因組DNA，具體操作步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。每個(gè)標(biāo)本的反應(yīng)液為50 μL：TaKaRa LA Taq酶(5 U/μL)0.5 μL，10×LA Taq PCR反應(yīng)緩沖液Ⅱ5 μL，dNTP 混合液(2.5 mmol/L)8 μL，第6、7外顯子上下游引物各2 μL，DNA 4 μL，ddH2O 28.5 μL。使用的引物根據(jù)ABO基因序列(GenBank序列號(hào)：N_000009)參考文獻(xiàn)[5]設(shè)計(jì)。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s,72 ℃延伸50 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。取3 μL PCR產(chǎn)物用于瓊脂糖凝膠電泳，剩余47 μL送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行檢測(cè)，并用Chromos軟件比對(duì)，分析測(cè)序結(jié)果。②基因測(cè)序及克隆。采用DNA瓊脂糖凝膠純化試劑盒純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，正反雙向測(cè)序，在ABI PRISM377測(cè)序儀上對(duì)第6和第7外顯子及其側(cè)翼序列進(jìn)行測(cè)序。第7外顯子的PCR產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體(TaKaRa公司產(chǎn)品)，PCR插入片段在ABI PRISM377測(cè)序儀上進(jìn)行序列分析。

2 結(jié)果

2.1家系成員ABO血型血清學(xué)鑒定結(jié)果先證者術(shù)前備血時(shí)自動(dòng)血型檢測(cè)系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)ABO血型正定型抗B有混合視野凝集，反定型正常，自身對(duì)照陰性，見(jiàn)圖2，不規(guī)則抗體篩查陰性。立即進(jìn)行試管法復(fù)驗(yàn)，試管法發(fā)現(xiàn)正定型抗B顯示有混合視野凝集，反定型正常，鑒定為B3亞型。先證者兒子、女兒血型血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

1：抗A抗體；2：抗B抗體；3：抗D抗體；4：自身對(duì)照；5：A1細(xì)胞；6：B細(xì)胞

圖2 先證者自動(dòng)血型檢測(cè)系統(tǒng)結(jié)果表1 B3亞型家系成員血型血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果

2.2α1,3-D-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性測(cè)定結(jié)果先證者及其兒子的血漿α1,3-D-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性均<1；陽(yáng)性對(duì)照為1∶64，陰性對(duì)照為<1。

2.3DNA測(cè)序及克隆分析結(jié)果先證者第6外顯子測(cè)序顯示：261缺失G雜合，297G→A。第7外顯子測(cè)序顯示： 425C→T，526G→C，657T→C，681A→G，703A→G，771T→C，796C→A，803C→G，930A→G。等位基因的命名遵循ISBT命名法。患者ABO基因第7外顯子存在c.425C→T雜合突變，克隆后的PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果顯示：c.425C→T突變位于患者的B等位基因上，即先證者ABO基因型為B305/O102(圖3)。425C→T突變導(dǎo)致α1,3-D-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的第142位氨基酸由甲硫氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)樘K氨酸。先證者之子與先證者堿基突變位點(diǎn)一致，也存在425C→T突變，基因型鑒定為B305/O102；先證者之女為O102。

方框內(nèi)的堿基為425突變位點(diǎn)圖3 先證者B3等位基因測(cè)序結(jié)果

3 討論

ABO血型基因定位于9q34.1-34.2[6]，基因多態(tài)性多位于第6和第7外顯子，錯(cuò)位突變引起的氨基酸替換是導(dǎo)致ABO抗原表達(dá)減弱的主要原因[1]。目前對(duì)亞型基因判定最直接的方法是對(duì)ABO基因的第6和第7外顯子進(jìn)行測(cè)序[7-8]。本研究通過(guò)對(duì)先證者家系基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)，先證者血漿中α1,3-D-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性很弱，存在c.425C→T位點(diǎn)突變，其兒子遺傳了該突變，最終確定為B305/O102亞型，符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律。這說(shuō)明B3亞型除了具有明確的血清學(xué)特點(diǎn)外，還具有遺傳特性。與B101序列相比，425位點(diǎn)這一突變導(dǎo)致多肽鏈第142位甲硫氨酸被蘇氨酸替換。甲硫氨酸是含硫的兩性氨基酸，在代謝中起著重要作用，可以反應(yīng)生成S-腺苷-I-甲硫氨酸，在反應(yīng)中是甲基供體的服務(wù)器。蘇氨酸是含有羥基的親水分子氨基酸，替換甲硫氨酸可造成α1,3-D-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性部分喪失，致使D-半乳糖通過(guò)糖基化作用與前體H物質(zhì)的連接發(fā)生部分失活，使得B抗原合成量減少，出現(xiàn)了混合視野。先證者紅細(xì)胞與抗H抗體作用后增強(qiáng)也佐證了這一點(diǎn)。

ABO亞型具有相對(duì)特殊的血清學(xué)特征，混合視野凝集是B3亞型紅細(xì)胞的明顯特征，顯微鏡下觀察，B3亞型紅細(xì)胞與抗B或抗AB血清孵育后出現(xiàn)一些被絕大部分游離的非凝集紅細(xì)胞包圍的數(shù)個(gè)紅細(xì)胞形成的凝集塊[9]。若將凝集細(xì)胞去除，剩余的游離細(xì)胞再與抗B血清反應(yīng)，仍然出現(xiàn)混合視野凝集。對(duì)先證者進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，紅細(xì)胞與抗B抗體作用出現(xiàn)混合視野凝集、反定型一致，不規(guī)則抗體篩查陰性，鑒定為B3亞型；采集其兒子、女兒血標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，兒子與父親血型一致，正定型抗B出現(xiàn)混合視野凝集，反定型B型，鑒定為B3亞型，女兒為O型。

B基因編碼α1,3-D-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶，其功能是轉(zhuǎn)移一個(gè)D-半乳糖到H物質(zhì)的巖藻糖化半乳糖殘基上，形成B抗原。ABO基因位點(diǎn)突變可導(dǎo)致相應(yīng)糖基轉(zhuǎn)移酶的異常，從而出現(xiàn)ABO亞型。本文通過(guò)α1,3-D-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性測(cè)定顯示先證者血漿中α1,3-D-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性<1，提示先證者血漿中α1,3-D-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性很弱，B3亞型等位基因編碼的糖基轉(zhuǎn)移酶運(yùn)轉(zhuǎn)能力差，這可能與亞型血型本身紅細(xì)胞上的B抗原量少、糖基轉(zhuǎn)移酶活性低有關(guān)。

目前發(fā)現(xiàn)[10]，425堿基突變C→T存在于2種等位基因上：在A等位基因上突變導(dǎo)致Ael表型，在B等位基因上突變導(dǎo)致B3表型。許先國(guó)等[11]報(bào)道的2例B305等位基因與A1(A101或A102)等位基因組合遺傳表現(xiàn)為B3變異型，出現(xiàn)混合外觀凝集現(xiàn)象；李歸冀等[12]報(bào)道B305與O101等位基因組合在一起，血清學(xué)表現(xiàn)為比正常B抗原凝集稍弱，未出現(xiàn)B3血型特異性的混合外觀表現(xiàn)。而在本例樣本中發(fā)現(xiàn)，B305與O102組合在一起，表現(xiàn)出混合視野凝集。這表明B305與不同等位基因組合，血清學(xué)表現(xiàn)會(huì)有所不同，這還需要進(jìn)一步的群體調(diào)查或者體外表達(dá)去驗(yàn)證。

ABO 系統(tǒng)是人類發(fā)現(xiàn)最早的血型系統(tǒng)，也是最常用最重要的血型系統(tǒng)，在臨床輸血、新生兒溶血病和器官移植中具有很重要的臨床意義[13]，但是在ABO血型系統(tǒng)中存在一部分亞型，導(dǎo)致血型正反定型不符，對(duì)鑒定血型造成了一定的干擾[14]。鑒于ABO血型抗原表達(dá)的復(fù)雜性，采用血型血清學(xué)檢測(cè)與基因分型相結(jié)合的方法，對(duì)血型的正確定型以及臨床安全輸血具有重要意義。