膽汁在法醫(yī)毒物學中的應(yīng)用研究進展

紀佼佼，嚴 慧，沈 敏

（1.華東政法大學，上海200042；2.司法鑒定科學研究院 上海市法醫(yī)學重點實驗室上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺，上海200063）

鑒定結(jié)果的可靠性、科學性是法醫(yī)毒物鑒定中最為重要的要求，而生物檢材的選擇對于鑒定結(jié)果有著重要的影響。目前法醫(yī)毒物鑒定實踐中，通常采用血液和尿液檢材來證明近期毒物的攝入情況，判斷是否攝毒、中毒以及確定死因。在死后毒物學領(lǐng)域，當毒物半衰期短，以及血液檢材不可獲得或可靠性存疑時，探尋毒物和代謝物濃度高、定性認定能力強的生物檢材或血液的替代檢材顯得尤為重要。

膽汁排泄是毒物及其代謝物的重要消除途徑之一，較傳統(tǒng)生物檢材膽汁，具有毒物和代謝物濃度高、檢測時限長等特性，這在死后毒物學領(lǐng)域具有優(yōu)勢和潛力。目前國外仍將膽汁作為常規(guī)生物檢材采集并檢測[1]，并有大量的應(yīng)用研究報道，而在國內(nèi)的鑒定實踐中膽汁并未受到應(yīng)有的關(guān)注和重視。本文回顧了近20余年的文獻報道，綜述了膽汁構(gòu)成和毒物的轉(zhuǎn)運消除，膽汁中毒物分析的研究成果，提供了300余例案件中100多個毒藥物的膽汁和血液定量結(jié)果數(shù)據(jù)，探討了膽汁毒物定性、定量分析的特點、價值及其問題，并對其應(yīng)用前景進行了展望。

1 膽汁概述

1.1 膽汁的構(gòu)成

膽汁是人體中一種不含有消化酶的消化液，儲存于膽囊之中。人體中75%的膽汁由肝細胞分泌產(chǎn)生，25%由膽管細胞產(chǎn)生，成人每日的分泌量大約在600～1 000 mL，膽汁中約95%的成分為水，同時還含有膽汁酸和膽紅素，膽汁的顏色由膽紅素的含量所決定。此外，膽汁中含有卵磷脂、膽固醇、鈉、鉀、鈣、磷酸鹽和碳酸鹽等，以及少量蛋白質(zhì)等成分，其pH約為7.4。膽汁的分泌是一個連續(xù)的不間斷的過程，其分泌量會隨著人體的運動、飲食情況而發(fā)生變化，在不進行消化時，人體所分泌的膽汁儲存在膽囊之中并進行濃縮，而當人體需要進行消化時，在受到刺激的情況下儲存在膽囊中的膽汁進入十二指腸幫助消化作用。

1.2 肝腸循環(huán)

毒藥物在體內(nèi)的排泄主要是通過腎臟、膽汁、乳腺等渠道進行。毒藥物經(jīng)肝臟轉(zhuǎn)化，以代謝物或原藥的形式進入膽汁，后經(jīng)過膽汁總管進入十二指腸，其中一部分被小腸吸收，由門靜脈流回肝臟，然后再經(jīng)膽汁進入腸道，如此往復(fù)，形成肝腸循環(huán)。肝腸循環(huán)存在兩種方式：一種是通過胃腸道的重吸收，另一種是結(jié)合型代謝物經(jīng)腸道中細菌和酶（如β-葡萄糖醛酸酶）水解釋放出毒藥物原體進而在小腸內(nèi)重新吸收。肝腸循環(huán)可使毒藥物反復(fù)循環(huán)于肝臟、膽汁、腸道之間，延長毒藥物的半衰期，從而延緩排泄而使血藥濃度維持時間延長。肝腸循環(huán)提高了藥物的利用效率，但對于毒性物質(zhì)而言則增強了對人體的損害，如嗎啡、秋水仙堿、勞拉西泮或地高辛等物質(zhì)都受肝腸循環(huán)作用的影響，在藥動學上表現(xiàn)為藥時曲線出現(xiàn)多峰現(xiàn)象，半衰期延長，從而延長毒藥物對機體的作用時間[2]。

1.3 膽汁排泄及其影響因素

膽汁排泄是外源性毒藥物的重要消除途徑之一。雖然膽汁排泄是毒藥物原體的次要排泄途徑，但卻是多數(shù)代謝物尤其是水溶性代謝物的主要排泄途徑。在肝細胞內(nèi)的毒藥物滲透可以通過被動擴散或通過轉(zhuǎn)運體的主動轉(zhuǎn)運，一般而言，化合物的分子量或親水性越高，其擴散就越依賴于主動轉(zhuǎn)運。外源性物質(zhì)的膽汁排泄需要穿過兩個細胞膜:在血竇側(cè)的肝細胞的基底外側(cè)膜，以及形成膽汁管的頂膜。

毒藥物及其代謝物經(jīng)膽汁排泄往往是主動過程，膽汁排泄的影響因素一直是多年來研究的熱點。早在20世紀70年代就有研究報道膽汁排泄分子量的閾值：大鼠約為 325 g/mol，人類約為500～600 g/mol[3-4]。該研究認為分子量低于上述數(shù)值的化合物不太可能在膽汁中被排出，但筆者認為隨著分析方法及分析水平的不斷進步該閾值會有所降低。最近的研究表明，分子量不足以預(yù)測膽汁中藥物的濃度，因此以位阻效應(yīng)、滲透性、溶解度、極化性等理化性質(zhì)為基礎(chǔ)的更為復(fù)雜的定量結(jié)構(gòu)-藥代動力學參數(shù)關(guān)系或基于生理的藥代動力學模型得以建立[1]。還有報道提出膽汁排泄的另一個決定性因素是位于肝細胞竇和小管膜上的轉(zhuǎn)運體的親和力[5-6]，而這些研究主要聚焦于內(nèi)源性的物質(zhì)，涉及藥物間的相互作用或某些治療類的抑制劑，如抗癌、抗生素和抗病毒藥物，而在法醫(yī)毒理方面關(guān)注較少。

腎和肝膽是人體重要的排泄器官，兩者的排泄能力存在相互代償現(xiàn)象，這對于腎功能或肝功能不全者的毒物分析結(jié)果解釋具有一定的指導意義。

2 膽汁毒物分析研究現(xiàn)狀及進展

定性篩選分析是法醫(yī)毒物分析中最重要、最基本的環(huán)節(jié)，1972年Hoffman等[7]首次報道了利用凍干法關(guān)聯(lián)薄層色譜對膽汁中常見未知毒藥物進行篩選。之后高效液相色譜/二極管陣列檢測器（HPLC-DAD）、氣相色譜/質(zhì)譜（GC-MS）、液相色譜/質(zhì)譜（LC-MS）等篩選分析方法不斷應(yīng)用，對膽汁中毒藥物的研究和應(yīng)用逐漸增多。

表1總結(jié)了300多個案例中血液和膽汁中毒物濃度，以供比較分析和結(jié)果解釋。值得關(guān)注的是，約80%的毒藥物膽汁/血液濃度比大于1。Vanbinst等[121]報道了膽汁及血液中36種濫用藥物的篩查情況，結(jié)果顯示膽汁中檢出可卡因、2-乙基-1，5-二甲基-3，3-苯基吡咯烷（EDDP）、 MDMA、美沙酮、嗎啡和可待因等物質(zhì)而血液中上述物質(zhì)的檢出率僅為63.7%（n=44），提示了膽汁可以應(yīng)用于毒藥物的大規(guī)模篩查。

然而，有部分研究中也出現(xiàn)血液檢出毒藥物而膽汁未檢出的情形。如Vanbinst等[121]對44個案例進行血液和膽汁的比較研究，結(jié)果有6例（13.6%）膽汁中未檢出氯巴占、可卡因、可待因、3，4-甲氧基苯丙胺（MDA）等成分，而血液中檢出。作者認為可能是死者攝毒后快速死亡，或血液檢材分析方法靈敏度優(yōu)于膽汁。

同時，研究表明不同的毒物在膽汁中的存在情況及其與血液濃度之間的關(guān)系上有所不同。

表1 涉毒死者血液和膽汁中毒藥物濃度

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

2.1 乙醇

血液中乙醇含量鑒定是最為常見的法醫(yī)毒物鑒定項目。由于尸體腐敗、死后再分布、死后生成、血液缺失等因素可致無法準確獲得血液乙醇濃度，故在20世紀末膽汁作為可替代檢材成為人們研究的熱點。Winek、Budd等人研究結(jié)果顯示膽汁乙醇濃度與血液乙醇濃度存在良好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為 r=0.927，n=37[122]；r=0.9107，n=189[24]；r=0.94，n=100[123]。盡管如此因受攝入到死亡時間間隔、乙醇濃度等因素的影響，不能簡單使用膽汁乙醇濃度來推算血液乙醇濃度。Gilliland等[124]對55例腐敗尸體研究結(jié)果顯示：在膽汁和血液中檢出乙醇，而在尿液及玻璃體液中僅檢出低濃度乙醇或未檢出。對此作者認為膽汁類似其他生物基質(zhì)，細菌污染可能導致死后生成乙醇，篩查乙醇代謝物乙醛葡萄糖醛酸苷有助于鑒別乙醇來源。乙基葡萄糖醛酸苷主要通過膽汁排泄，膽汁濃度遠高于血液是其優(yōu)勢。另外，也有報道將膽汁中乙醇濃度與其他基質(zhì)的分析結(jié)果進行關(guān)聯(lián)性分析用于研究死亡環(huán)境以及評估乙醇是否系死后生成。

2.2 阿片類

嗎啡在體內(nèi)與葡萄糖醛酸結(jié)合形成代謝物嗎啡-3-葡糖苷酸（M3G）和嗎啡-6-葡糖苷酸（M6G），嗎啡及其結(jié)合型代謝物主要通過膽汁排泄并存在肝腸循環(huán)，故以較高濃度分布于膽汁并有較長的檢出時限。Crump等[125]對膽汁及血液中嗎啡及可待因的濃度進行對比分析，結(jié)果顯示兩種物質(zhì)在血液及膽汁中存在良好的相關(guān)性（r≥0.99）。 Tassoni等[126]報道了一起海洛因中毒案例，在末次注射海洛因后144h，膽汁中仍可檢出（21.3μg/mL嗎啡）而血液中呈陰性，為攝入海洛因后較長時間內(nèi)的鑒定提供了方法及依據(jù)。丁丙諾啡及其代謝物去甲丁丙諾啡表現(xiàn)為大量通過膽汁排泄，平均膽汁/血液濃度比達9638（n＝12）。

2.3 大麻類

Fabritius等[25]報道四氫大麻酚（THC）的膽汁/血液濃度比較低，但其代謝物11-羥基-四氫大麻酚（11-OH-THC）、11-去甲-9-羧基-四氫大麻酚（THCCOOH）、THC和 THCCOOH葡萄糖醛酸苷等則有較高的膽汁/血液濃度比。Lin等[127]報道了在50例涉大麻死亡的交通事故案例中，總THCCOOH（包括游離THCCOOH及THCCOOH葡萄糖醛酸苷）膽汁/血液濃度比范圍為17.2～888，同時作者提出膽囊中存在的THCCOOH葡萄糖醛酸苷易被腸道菌群水解并且被重吸收，這也提示肝腸循環(huán)對于延長大麻類物質(zhì)的檢測時限具有一定的效能。Gronewold等[128]對大麻類物質(zhì)在人體的分布情況進行了研究，結(jié)果顯示THCCOOH葡萄糖醛酸苷和THCCOOH在膽汁中存在較高的濃度，峰值濃度分別為11 160和990 ng/mL，且膽汁與血液中THCCOOH葡萄糖醛酸苷呈現(xiàn)出良好的相關(guān)性（r＞0.99）。 在膽汁中同時檢出了四氫大麻酚（THC）、大麻酚（CBN）、大麻二酚（CBD）和 11-羥基-四氫大麻酚（11-OH-THC）等物質(zhì)，而在心血、股靜脈血及尿液中則無法檢出較低濃度的大麻類物質(zhì)。Fabritius等[25]證實了上述結(jié)果，并且提出CBD/THC比值較高可以作為藥用大麻攝入的反映，同時得出膽汁與血液中上述物質(zhì)存在良好的相關(guān)性且相關(guān)系數(shù)均大于0.997，由此作者認為膽汁可以作為一種良好的生物檢材用于較低濃度的大麻類代謝物的分析及其在人體分布情況的考察。

2.4 可卡因

Fernández等[129]應(yīng)用放射免疫法測定了 20例可卡因中毒案件，其中膽汁/血液濃度比為 2.15～107.53（＝30.79）。 Agarwal等[130]報道了 50 例案件中可卡因及其代謝物膽汁/血液濃度比值為5～7。兩項研究在數(shù)值上存在的差異可能與放射免疫法不能有效區(qū)分可卡因及其代謝物有關(guān)。Fernández等[131]還通過了對30例案件中膽汁可卡因及其代謝物苯甲酰愛康寧進行分析，結(jié)果顯示可卡因陽性90%、苯甲酰愛康寧陽性100%，膽汁中苯甲酰愛康寧濃度高于可卡因的占83%。同時膽汁中可卡因濃度顯著高于血液，濃度比為 2.2～470.6（＝64.8）。 作者還報道了20例可卡因中毒死者的血液及膽汁結(jié)果，膽汁中可卡因濃度高于血液，濃度比范圍為2.15～107.53（＝30.76），但呈弱相關(guān)性（r＝0.48）。 對此，作者認為膽汁僅可作為血液的替代檢材，證明是否攝入過可卡因，而不能準確地用于推算血藥濃度。

2.5 苯二氮卓類

Hasegawa等[132]報道了一例服用過量氟硝西泮而致死的案例，對其13種體液和組織中氟硝西泮及其代謝物7-氨基氟硝西泮的濃度進行分析。結(jié)果顯示除脂肪組織外，其余人體體液和組織中7-氨基氟硝西泮的濃度均高于原體氟硝西泮且在膽汁中尤為顯著，同時膽汁與血液氟硝西泮、7-氨基氟硝西泮呈現(xiàn)良好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為0.9996和0.9995。其他研究也給出了膽汁與血液良好相關(guān)性的發(fā)現(xiàn)，如地西泮（r＝0.9983）、去甲地西泮（r＝1）、溴西泮（r＝0.9896）。 由此可見，膽汁可以作為有價值的檢材應(yīng)用于涉苯二氮卓類及其代謝物中毒等案件。Robertson等[133]比較了19例涉苯二氮卓類藥物（硝基苯二氮平、氟硝西泮、氯硝西泮）死者血液和膽汁中母體藥物及其7-氨基代謝物的濃度，結(jié)果顯示母體藥物的相關(guān)系數(shù)為0.695，代謝物相關(guān)系數(shù)為0.829。作者還對其他可供選擇的檢材（玻璃體液、肝臟、尿液）進行了比較分析并認為：通過不同種類的生物檢材分析，可相互補充，客觀地評價苯二氮卓類藥物的中毒案件。

2.6 其他物質(zhì)

Fanton[134]報道了128例甲丙氨酯使用過量死亡的案例，分析結(jié)果表明膽汁中甲丙氨酯的濃度較血液低，但兩者間具有顯著的相關(guān)性（r＝0.994），據(jù)此作者認為膽汁可以作為檢測甲丙氨酯的替代檢材。同時研究也表明，當血液濃度較高時（≥100 mg/L），膽汁濃度結(jié)果較為分散，但兩種檢材之間仍存在一定的相關(guān)性（r＝0.66），故作者認為膽汁和血液中甲丙氨酯濃度的相關(guān)性與個體的藥代動力學的消除模式有關(guān)，同時也受毒物的相互作用、甲丙氨酯攝取到死亡的時間間隔等因素的影響，故血液甲丙氨酯濃度不能從膽汁推算。Bevalot等[135]也提出了同樣的觀點，其研究認為對于甲丙氨酯膽汁/血液濃度比較低（接近于1），雖然兩種檢材之間存在著顯著的相關(guān)性，但也存在著不可忽略的分散度，因此作者建議使用統(tǒng)計學的方法由膽汁推算血液中的濃度，從而估計不確定性。

Tennakoon[136]報道了8例卡巴呋喃中毒案件，膽汁中檢出率為20%。Hopenwasser等[58]報道的喹硫平中毒案件，膽汁中檢出率為62.5%（n=8）。Tominaga等[137]考察了2009—2014年中毒死亡案件，對尸體膽汁及血液中毒物濃度的相關(guān)性進行分析，結(jié)果顯示，撲爾敏、雙氫可待因、苯海拉明、氯丙嗪等存在相關(guān)性，而唑吡坦、帕羅西汀、咖啡因等則顯示出弱相關(guān)性及分散性結(jié)果。但上述具有相關(guān)性的物質(zhì)能否從膽汁濃度推算血液濃度還需進行大量的研究來證明。

Bevalot等[135]將動物實驗與系列案例結(jié)合起來，以6種目標物（甲丙氨酯，嗎啡，氰美馬嗪，咖啡因，地西泮和西酞普蘭）評估膽汁作為血液的替代檢材定性和定量分析的可行性。膽汁定性分析可檢出血液中檢出的所有目標物，動物實驗顯示膽汁較血液有更寬的時間檢測窗口。定量結(jié)果解釋較為有限，具有高膽汁/血液濃度比值的嗎啡、西酞普蘭、氰美馬嗪的兩者相關(guān)性較差。地西泮動物實驗血液與膽汁濃度的相關(guān)性良好（r=0.961，n=20），但案例數(shù)據(jù)相關(guān)性較差 （r=0.447， n=23）。

3 膽汁毒物分析結(jié)果評價

3.1 膽汁與血液毒物分析的相關(guān)性

法醫(yī)毒物鑒定的主要目的在于評估毒物的攝入量及其與死亡之間的關(guān)系，根據(jù)生物檢材中毒物的定性及定量結(jié)果可以對此提供信息并做出解釋，而這通常是基于血液濃度來進行的。然而當毒物暴露水平較低或中毒延緩死亡、毒物半衰期較短時，以及血液檢材不可獲得或可靠性存疑時，膽汁可以作為一種較為理想的替代檢材。有學者認為膽汁由于其自身的成分（膽汁鹽等）及堿性，不易滋生細菌，不易造成檢材的污染[2]。大量案例報告及研究表明，膽汁中毒物濃度通常高于血液且濃度比可能達到較高數(shù)值。膽汁較血液的優(yōu)勢尤其表現(xiàn)在檢測時限方面，采用同樣的分析方法膽汁較血液通常具有更寬的檢測窗口，對于定性篩查具有明顯優(yōu)勢。雖然關(guān)于膽汁中毒藥物濃度的定量解釋的研究較少，但部分研究顯示膽汁和血液濃度之間存在著顯著的相關(guān)性，因此，膽汁可以為血液中毒物濃度分析提供補充與驗證。

毒藥物在血液和膽汁中的不同存在情況及濃度差異表明膽汁具有較長的檢測窗口，對于毒物暴露水平較低、攝毒延緩死亡和毒物半衰期較短的情形尤其具有優(yōu)勢，如海洛因（6-單乙酰嗎啡）（半衰期 6～25 min）、嗎啡（半衰期 2～3 h）、秋水仙堿（半衰期20 min）等。此外，膽汁中毒藥物代謝物的存在可為陽性結(jié)果確認提供可靠證據(jù)。因此，有學者認為僅依據(jù)血液篩查陰性結(jié)果而無膽汁篩查進一步補充確認時，其毒藥物陰性結(jié)論的可靠性存疑。

3.2 死后再分布

對于死后再分布現(xiàn)象，通常認為通過尸體心血與外周血之間的毒藥物濃度比可以評估是否有死后再分布發(fā)生[138]。目前文獻報道的死后再分布研究主要集中在二個層面：一是膽囊膽汁作為死后再分布的可能來源。MDMA的家兔實驗研究結(jié)果顯示[139]，死亡時膽汁濃度高于肝臟濃度，死亡后膽汁濃度隨時間延長下降，而肝臟濃度則呈升高的趨勢，表明膽囊膽汁中的毒藥物可向低濃度的鄰近組織擴散。另有海洛因靜脈注射后根據(jù)胃嗎啡濃度的檢出結(jié)果提出膽汁釋放、腸胃反流的假設(shè)。二是認為胃可能是膽汁死后再分布的主要來源[2]。De Letter等[139]通過將MDMA注入胃或氣管（模擬胃食管反流）的方法模擬了這一過程。還有研究對死后的家兔用氯胺酮進行灌胃，取灌胃后96 h內(nèi)的膽汁進行分析[140]。上述研究結(jié)果顯示當胃內(nèi)存在高濃度的外源性毒藥物時，膽囊會受到輕微的污染，胃內(nèi)的毒藥物會向左側(cè)肝臟和膽囊擴散，但對膽囊的擴散程度要小于肝臟，同時研究顯示隨著時間的推移胃內(nèi)毒藥物向較低濃度的鄰近組織中擴散呈現(xiàn)降低的趨勢。研究結(jié)果表明，如死亡時胃內(nèi)毒藥物處于吸收相或吸收不完全，則可能構(gòu)成毒藥物的儲備源。

3.3 局限性

相較于血液及尿液，膽汁的局限性首先體現(xiàn)在采樣較為復(fù)雜。膽汁的可獲得性取決于膽囊的完整性，取樣時不僅要考慮進餐時間與死亡時間的關(guān)系，還需考慮膽汁可能會受到肝膽疾病或死亡過程的影響，例如因肝病變、膽囊炎、膽結(jié)石等疾病而造成膽汁分泌物的改變或因膽囊損傷后血管周圍擴散或脫水情況而造成膽汁成分的改變[2]。其次膽汁排泄途徑與毒藥物分子量、親脂性和對肝細胞膜轉(zhuǎn)運體的親和力有關(guān)，適用范圍仍需進一步考察。再者部分目標物膽汁與血液中的濃度顯示出弱相關(guān)性及分散性結(jié)果，故無法僅依據(jù)膽汁濃度外推血液濃度?，F(xiàn)有研究表明膽汁與血液濃度的相關(guān)性會受到死亡時間、藥物間的相互作用等因素的影響，因此，在依據(jù)膽汁濃度進行解釋時，必須謹慎或使用統(tǒng)計學的方法來由膽汁外推血液中的濃度，從而估計不確定性。

4 展望

在毒物鑒定實踐中，當血液檢材缺失、污染或因受其他因素影響（毒物暴露水平較低、毒物半衰期較短）導致鑒定結(jié)果可靠性存疑時，需要尋找適宜的替代檢材。膽汁較血液具有較長的檢測窗口，對半衰期較短的毒物有明顯的檢測優(yōu)勢。同時，因其自身成分的性質(zhì)決定了膽汁不易滋生細菌，產(chǎn)生污染。另外，部分研究顯示，膽汁與血液濃度之間存在著顯著的相關(guān)性且其受死后再分布影響較小。綜上，膽汁可以作為較為理想的替代檢材為血液中毒物濃度分析提供補充及質(zhì)量控制，其在死后毒物學領(lǐng)域具有優(yōu)勢和潛在的應(yīng)用價值。

目前，部分國家仍將膽汁作為法醫(yī)毒物鑒定的常規(guī)檢材，而國內(nèi)關(guān)于膽汁中毒物分析的研究還較少。因此，對于膽汁在鑒定實踐中的研究及應(yīng)用尚有待深入與推廣。