6種酚類化合物及胡桃醌的體外抑菌活性

楊 光 包曉瑋 陳 勇* 吳 瑩 馬菁菁

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊830052；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，烏魯木齊830052)

作為生產(chǎn)和使用抗生素的大國，我國每年有近一半的抗生素被用于畜牧業(yè)，由此引發(fā)的耐藥性威脅也越發(fā)受到公眾關(guān)注。畜牧業(yè)減用乃至停用飼用抗生素已是大勢所趨，各國畜牧科技工作者致力于尋找抗生素的理想替代品。有機酸、酶、益生菌、益生元和植物提取物均具有一定地替代抗生素的潛力[1]。植物提取物，特別是藥用植物提取物，具有抗菌、抗氧化的作用，常被用于改善人類健康和治療疾病[2]。隨著對植物提取物中活性成分的分離、鑒定以及對其作用機理的認(rèn)識，越來越多的研究認(rèn)為植物提取物具有替代飼用抗生素的作用[3]。

核桃(JuglansregiaLinn)是胡桃科胡桃屬多年生落葉喬木，其樹皮、果皮、枝葉和根部均可入藥，具有消除自由基、抗腫瘤、抗氧化及殺蟲等作用[4-5]。本實驗室的研究也表明，以25%乙醇提取8 h獲得的核桃青皮提取物對大腸桿菌(Escherichiacoli，E.coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis，B.subtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，S.aureus)具有良好的抑制作用[6]。核桃青皮提取物中的化合物主要是植物酚類化合物、黃酮類化合物和胡桃醌；在酚類化合物中又以對羥基苯甲酸、丁香酸、鞣花酸和單寧酸含量較高，黃酮類化合物則以蘆丁含量最高[7-8]。這些活性成分是否是核桃青皮提取物具有抑菌活性的主要原因尚不清楚。本研究選用核桃青皮和葉片中7種含量相對較高的活性成分進行抑菌活性研究，為解析核桃青皮提取物的抑菌活性及開發(fā)新的飼用抗生素替代品提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

本試驗采用K-B法(Kirby-Bauer test)即濾紙片擴散法[9]，以大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌為受試菌，分別以1.000 0、0.500 0、0.250 0、0.125 0和0.062 5 mg/mL的綠原酸、鞣花酸、丁香酸、蘆丁、單寧酸、對羥基苯甲酸和胡桃醌為研究對象，以抑菌圈直徑大小反映其體外抑菌活性。

1.2 試劑與菌種

綠原酸(純度≥98%)、鞣花酸(純度≥95%)、丁香酸(純度>98%)、蘆丁(純度>95%)、單寧酸(純度>98%)和對羥基苯甲酸(純度>98%)為BBI Life Science公司產(chǎn)品；胡桃醌(純度>97%)為Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；氨芐青霉素鈉(純度≥96%)為Genview公司產(chǎn)品；大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌為新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)實驗室保存菌種。

1.3 活化菌種及菌懸液的制備[10]

挑取待活化菌種在LB固體培養(yǎng)基上劃線，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，至長出菌落。挑取單菌落接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基，于37 ℃、170 r/min培養(yǎng)過夜后用無菌LB液體培養(yǎng)基將細(xì)菌濃度調(diào)為108CFU/mL的菌懸液備用。

1.4 供試樣品的制備

準(zhǔn)確稱取待測植物次生代謝物2.0 mg，用相應(yīng)溶劑溶解使?jié)舛葹?.000 0 mg/mL后備用。綠原酸和對羥基苯甲酸用無菌生理鹽水配制，鞣花酸和蘆丁用0.2 mol/L氫氧化鈉(NaOH)配制，單寧酸、丁香酸和胡桃醌分別用25%乙醇、50%乙醇和無水乙醇配制。取母液用相應(yīng)溶劑進行2倍稀釋，稀釋終濃度分別為0.500 0、0.250 0、0.125 0和0.062 5 mg/mL。

1.5 藥敏片的制備

用打孔器將定性濾紙制成藥敏片(直徑=6 mm)，藥敏片在相應(yīng)溶劑中室溫浸泡10 min后備用。

1.6 抑菌活性的測定

取0.1 mL濃度為108CFU/mL的菌懸液均勻涂布在LB固體培養(yǎng)基上，待培養(yǎng)基將菌液吸收完全后用無菌鑷子夾取藥敏片置培養(yǎng)基表面并使藥敏片完全貼服，將培養(yǎng)皿倒置放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后用十字交叉法測量抑菌圈直徑。試驗以相應(yīng)溶劑作為空白對照，以0.10 mg/mL氨芐青霉素鈉為陽性對照。所有樣本均重復(fù)3次。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)用SPSS 18.0軟件進行分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。當(dāng)因素水平達到顯著后采用Duncan氏法進行多重比較，顯著水平為P≤0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度綠原酸的抑菌活性

綠原酸對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌具有較強的抑制作用，對金黃色葡萄球菌的抑制作用較弱(圖1)。從表1可以看出，綠原酸對供試菌的抑制作用由強至弱依次為枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌。不同濃度的綠原酸對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑均顯著小于氨芐青霉素鈉(P<0.05)；而對枯草芽孢桿菌，綠原酸濃度為1.000 0 mg/mL時的抑菌圈直徑與氨芐青霉素鈉無顯著差異(P>0.05)，表明綠原酸對枯草芽孢桿菌具有極強的抑制作用。

2.2 不同濃度對羥基苯甲酸的抑菌活性

在0.062 5～1.000 0 mg/mL濃度范圍內(nèi)對羥基苯甲酸對大腸桿菌無抑制作用，對枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌具有一定的抑制作用，其中枯草芽孢桿菌對對羥基苯甲酸較敏感(圖2)。由表2可知，在對羥基苯甲酸濃度為1.000 0 mg/mL時，對枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別為10.58和8.50 mm，但都顯著小于氨芐青霉素鈉的抑菌圈直徑(P<0.05)。隨著濃度的降低，對羥基苯甲酸對枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑均顯著下降(P<0.05)。

2.3 不同濃度鞣花酸的抑菌活性

鞣花酸對3種受試菌均具有一定的抑制作用(圖3)。由表3可知，鞣花酸對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌具有較強的抑制作用，在0.062 5～1.000 0 mg/mL濃度范圍內(nèi)均具有抑制作用。相比之下，鞣花酸對枯草芽孢桿菌的抑制作用強于對大腸桿菌的抑制作用，且當(dāng)濃度達到0.250 0 mg/mL后，鞣花酸對枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑均顯著大于氨芐青霉素鈉(P<0.05)，說明對枯草芽孢桿菌的抑制作用強于氨芐青霉素鈉。鞣花酸濃度達到1.0 mg/mL后對金黃色葡萄球菌才具有抑制作用，且其對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑顯著小于氨芐青霉素鈉(P<0.05)，說明鞣花酸對金黃色葡萄球菌的抑制作用弱于氨芐青霉素鈉。

圖1 綠原酸對大腸桿菌(A)、枯草芽孢桿菌(B)、金黃色葡萄球菌(C)的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of chlorogenic acid on E. coli (A), B. subtilis (B) and S. aureus (C)表1 不同濃度綠原酸的抑菌圈直徑Table 1 Diameter of inhibition zone of chlorogenic acid in different concentrations mm

—：無抑制作用。同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

—: no inhibitory effect. Values in the same column with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

圖2 對羥基苯甲酸對大腸桿菌(A)、枯草芽孢桿菌(B)、金黃色葡萄球菌(C)的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of p-hydroxybenzoic acid on E. coli (A), B. subtilis (B) and S. aureus (C)

2.4 不同濃度蘆丁的抑菌活性

在3種受試菌中，相比于枯草芽孢桿菌，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌對蘆丁更為敏感(圖4)。由表4可知，蘆丁濃度為1.0 mg/mL時，對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別為10.83、8.75和10.67 mm。由此可以看出，蘆丁對供試菌的抑制作用順序為大腸桿菌=金黃色葡萄球菌>枯草芽孢桿菌。不同濃度的蘆丁對3種供試菌的抑菌圈直徑均顯著低于氨芐青霉素鈉(P<0.05)，隨著濃度的降低，蘆丁對3種受試菌的抑菌圈直徑均顯著下降(P<0.05)。

表2 不同濃度對羥基苯甲酸的抑菌圈直徑

圖4 蘆丁對大腸桿菌(A)、枯草芽孢桿菌(B)、金黃色葡萄球菌(C)的抑制作用Fig.4 Inhibitory effect of rutin on E. coli (A), B. subtilis (B) and S. aureus (C)表4 不同濃度蘆丁的抑菌圈直徑Table 4 Diameter of inhibition zone of rutin in different concentrations mm

2.5 不同濃度單寧酸的抑菌活性

單寧酸對3種受試菌的抑制作用均較弱(圖5)。由表5可知，單寧酸對大腸桿菌無抑制作用。濃度為1.0 mg/mL時，單寧酸對枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別為9.42、8.83 mm，顯著小于氨芐青霉素鈉對上述受試菌的抑菌圈直徑(P<0.05)，并且隨著濃度的降低，單寧酸對枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑顯著下降(P<0.05)，當(dāng)濃度低于0.5 mg/mL后，單寧對枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌不再具有抑制作用。

圖5 單寧酸對大腸桿菌(A)、枯草芽孢桿菌(B)、金黃色葡萄球菌(C)的抑制作用Fig.5 Inhibitory effect of tannic acid on E. coli (A), B. subtilis (B) and S. aureus (C)表5 不同濃度單寧酸的抑菌圈直徑Table 5 Diameter of inhibition zone of tannic acid in different concentrations mm

2.6 不同濃度丁香酸的抑菌活性

丁香酸對3種受試菌均具于具有一定的抑制作用(圖6)。由表6可知，丁香酸濃度為1.0 mg/mL時，3種受試菌均對丁香酸表現(xiàn)出不同的敏感性，其中枯草芽孢桿菌對丁香酸最敏感，抑菌圈直徑最大，并顯著大于陽性對照(P<0.05)，說明1.0 mg/mL丁香酸對枯草芽孢桿菌具有較強的抑制作用。但當(dāng)丁香酸的濃度低于0.5 mg/mL后，對枯草芽孢桿菌不產(chǎn)生抑制作用。與大腸桿菌相比，丁香酸對金黃色葡萄球菌具有更強的抑制作用。

圖6 丁香酸對大腸桿菌(A)、枯草芽孢桿菌(B)、金黃色葡萄球菌(C)的抑制作用Fig.6 Inhibitory effect of syringic acid on E. coli (A), B. subtilis (B) and S. aureus (C)表6 不同濃度丁香酸的抑菌圈直徑Table 6 Diameter of inhibition zone of syringic acid in different concentrations mm

2.7 不同濃度胡桃醌的抑菌活性

胡桃醌對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌均表現(xiàn)出不同程度的抑制作用(圖7)。由表7可知，對枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑，1.000 0 mg/mL胡桃醌與空白對照及陽性對照均無顯著差異(P>0.05)，因胡桃醌中有1個濾紙片無抑菌圈，導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)差較大，原因可能是試驗操作較慢，無水乙醇揮發(fā)過快。對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，在0.062 5～1.000 0 mg/mL濃度范圍內(nèi)，胡桃醌對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑菌圈的出現(xiàn)，顯示出較高的敏感性；當(dāng)胡桃醌濃度為1.000 0 mg/mL時，抑菌圈直徑與陽性對照無顯著差異(P>0.05)，其抑菌圈直徑甚至顯著高于陽性對照(P<0.05)，表明胡桃醌對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有較強的抑制作用。

圖7 胡桃醌對大腸桿菌(A)、枯草芽孢桿菌(B)、金黃色葡萄球菌(C)的抑制作用Fig.7 Inhibitory effect of juglone on E. coli (A), B. subtilis (B) and S. aureus (C)表7 不同濃度胡桃醌的抑菌圈直徑Table 7 Diameter of inhibition zone of juglone in different concentrations mm

3 討 論

3.1 酚類化合物的抑菌活性及其機制

核桃青皮提取物對細(xì)菌、真菌都有較好的抑制作用[5-6]，引起抑菌作用的主要活性物質(zhì)尚不清楚。酚酸、黃酮類化合物和胡桃醌是核桃青皮的主要植物次生代謝物。Nour等[7]利用反相高效液相色譜(RP-HPLC)測定了核桃葉片甲醇提取物中17種酚類化合物的含量，其中主要是酚酸、黃酮和胡桃醌，發(fā)現(xiàn)在黃酮類化合物中楊梅素、兒茶素和蘆丁的含量均較高，每100 g鮮重中分別達到141.05、212.81和99.08 mg，鞣花酸是核桃葉片中含量最高的酚酸，每100 g鮮重中達到84.62 mg，綠原酸含量并不高，每100 g鮮重中僅為5.21 mg，丁香酸和沒食子酸則更低，每100 g鮮重中僅分別為0.66和0.30 mg，每100 g鮮重中胡桃醌含量為88.73 mg。然而，Chrzanowski等[8]以80%甲醇提取核桃青皮提取物，并測定了其中的酚酸含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對羥基苯甲酸、綠原酸、單寧酸和丁香酸含量較高，分別達到618.8、306.7、237.4和427.0 μg/g DM，而沒食子酸含量最低，在葉片提取物中僅為12.6 μg/g DM，在核桃青皮提取物中未檢出。因此，本研究選取了核桃次生代謝物中含量較高的7種化合物進行獨立抑菌活性研究，為闡明核桃青皮提取物的抑菌活性以及開發(fā)新的飼用抗生素替代品提供參考。

從分子結(jié)構(gòu)來看，綠原酸、單寧酸、鞣花酸和蘆丁為多酚化合物，對羥基苯甲酸是苯甲酸的單取代酚酸，丁香酸則是對羥基苯甲酸的衍生物，胡桃醌屬萘醌類化合物。大量研究表明，植物酚類化合物和黃酮類化合物對細(xì)菌具有一定的抑制作用。鞣花酸可抑制表皮葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、克氏肺炎桿菌、傷寒沙門氏桿菌，并且其抑制作用強于慶大霉素和鏈霉素[11]。蘆丁對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157、阪崎腸桿菌具有一定的抑制作用[12]，綠原酸可抑制肺炎雙球菌、痢疾桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌等生長，其最小抑菌濃度(MIC)分別為20、20、40、40、80 μg/mL[13]。大腸桿菌、變形鏈球菌和銅綠假單胞菌對縮合單寧敏感，而大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等對可水解單寧敏感[14]。有關(guān)對羥基苯甲酸和丁香酸抑菌活性的研究還鮮見報道。Cho等[15]從稻殼中提取的對羥基苯甲酸在濃度為200～400 μg/mL時可抑制包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌在內(nèi)的17種細(xì)菌和2種酵母的生長。丁香酸可抑制產(chǎn)乙醇大腸桿菌LY01和阪崎腸桿菌的生長[16]。在本研究中，除大腸桿菌對羥基苯甲酸和單寧酸不敏感外，其他植物次生代謝物對3種受試菌均有不同程度的抑制作用。

通過改變微生物細(xì)胞膜通透性、干擾酶活性、改變細(xì)胞代謝、抑制核酸合成等途徑，這些植物源活性成分起到抑菌和殺菌的作用[14,17]。綠原酸和鞣花酸能破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁和膜結(jié)構(gòu)，增加細(xì)胞的通透性，一方面影響細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，另一方面導(dǎo)致金屬離子、蛋白質(zhì)的滲漏，使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)和能量代謝水平降低，進而起到抑菌作用[18-20]。丁香酸可使阪崎腸桿菌細(xì)胞活力和細(xì)胞內(nèi)ATP水平快速降低，這主要是由于膜通透性降低后導(dǎo)致鉀離子(K+)和氫離子(H+)濃度梯度消失，ATP合成減少[16]。黃酮類化合物通過抑制DNA解旋酶、拓?fù)洚悩?gòu)酶、二氫葉酸還原酶活性從而抑制細(xì)菌DNA的合成[17]。蘆丁是非常強的拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ抑制劑，可選擇性促進大腸桿菌拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ依賴的DNA切割，抑制依賴拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的DNA連接[21]。除此以外，黃酮類化合物還通過抑制細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的合成起到抑菌活性[22]。

3.2 胡桃醌的抑菌活性及機制

胡桃醌具有多種生物活性，如抗腫瘤、抗氧化、抑菌、殺蟲等，目前的研究主要集中在化感作用、抑制植物病原真菌和抗腫瘤等領(lǐng)域[23]，而有關(guān)其對細(xì)菌抑制作用的研究較少。吳朝霞等[24]報道，與青霉等真菌相比，胡桃醌可較好地抑制大腸桿菌等細(xì)菌，對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的最小抑菌濃度約為75 μg/mL，對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度約為37.5 μg/mL。本研究中，胡桃醌的濃度稀釋至0.062 5 mg/mL時對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具有一定的抑制作用，而當(dāng)胡桃醌的濃度稀釋至0.500 0 mg/mL時已對枯草芽孢桿菌沒有抑制作用。這種差異可能與受試菌的濃度、溶解活性成分的溶劑、生長的培養(yǎng)基及pH有關(guān)[17]。胡桃醌的抑菌作用機理與植物多酚相似，也是通過破壞大腸桿菌細(xì)胞膜完整性，增強通透性使蛋白質(zhì)及K+、鈉離子(Na+)等帶電離子外漏，降低細(xì)胞對葡萄糖的攝入及ATP合成酶活性等[25-26]。Wang等[27-28]利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，胡桃醌可提高金黃色葡萄球菌氧化還原酶的表達，誘導(dǎo)過氧化的發(fā)生；抑制參與蛋白質(zhì)合成、三羧酸循環(huán)、DNA和RNA合成的蛋白質(zhì)表達，并直接與DNA結(jié)合降低DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。

3.3 不同植物次生代謝物抑菌活性的差異及原因

在本研究中，根據(jù)抑菌圈直徑的大小可以看出，對大腸桿菌抑制作用的順序為鞣花酸>胡桃醌>蘆丁=丁香酸>綠原酸>對羥基苯甲酸=單寧酸；對枯草芽孢桿菌抑制作用的順序為鞣花酸>綠原酸=對羥基苯甲酸>丁香酸>單寧酸>蘆丁>胡桃醌；對金黃色葡萄球菌抑制作用的順序為胡桃醌>丁香酸>蘆丁>單寧酸>鞣花酸>對羥基苯甲酸>綠原酸。由此可見，7種植物次生代謝物對受試菌均具有一定的抑制作用，但不同化合物的抑菌活性又存在明顯不用。這種差異可能與化合物的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、受試菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)有關(guān)。分子結(jié)構(gòu)中的官能團是影響抑菌活性的重要因素之一。如黃酮類化合物中的焦酚結(jié)構(gòu)是強抑菌活性的指針；另外，具有抑菌活性的黃酮類化合物在其A環(huán)的C-5和C-7位上均有羥基[12]。Kabir等[29]報道綠原酸及其衍生物的解離常數(shù)(pKa)和分配系數(shù)(LogP)不同，其抑菌活性存在明顯差異，并發(fā)現(xiàn)在中性pH條件下，pKa值越大，抑菌活性也越大；LogP值與抑菌活性呈顯著的相關(guān)關(guān)系。Yang等[2]認(rèn)為，革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁含大量肽聚糖，酚類化合物等疏水性分子易穿透細(xì)胞，作用于細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)，在低濃度時可干擾能量產(chǎn)生的酶，高濃度時可導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性；而革蘭氏陰性菌的肽聚糖含量要少的多并且有一層外膜，因此，革蘭氏陽性菌對植物源性化合物更敏感，這也是導(dǎo)致同一種化合物對不同細(xì)菌抑制作用不同的原因之一。

4 結(jié) 論

綠原酸、鞣花酸、丁香酸、蘆丁、單寧酸、對羥基苯甲酸和胡桃醌這7種植物次生代謝物對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌具有不同的抑菌活性，其中鞣花酸對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌具有較強的抑制作用，胡桃醌對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有較強的抑制作用。