HMGB1在創(chuàng)傷引起大鼠肺組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的作用

（南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，江蘇 南通 226001）

外傷并發(fā)癥，如急性肺損傷和外傷性多器官功能障礙綜合征引起死亡并非罕見。然而，由于傷者外傷之后可能經(jīng)歷了臨床搶救治療、繼發(fā)性感染等，致使這類案件的死亡方式或案件性質(zhì)難以判斷。外傷發(fā)生后，機體各個器官可繼發(fā)非特征性的時序性損傷變化，這些變化均屬于外傷引起的一系列病理生理過程，揭示這些病理生理變化有助于查明死亡原因，確定案件性質(zhì)。前期研究[1]已發(fā)現(xiàn)大鼠雙后肢軟組織擠壓傷能引起遠隔器官損傷，其發(fā)生機制可能與創(chuàng)傷引起遠隔器官發(fā)生氧化應(yīng)激有關(guān)[1-2]。已有研究[3]表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）參與介導(dǎo)急性肺損傷發(fā)生。高遷移率族B1（high mobility group B1，HMGB1）蛋白屬于典型的損傷相關(guān)模式分子，可誘發(fā)促炎細胞因子表達上調(diào)，是引起實質(zhì)細胞損傷的關(guān)鍵因素[4]。本研究擬通過復(fù)制大鼠雙后肢擠壓致創(chuàng)傷應(yīng)激引起的急性肺損傷模型，初步探討創(chuàng)傷應(yīng)激引起大鼠肺組織ERS相關(guān)蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白 78（glucose-regulated protein 78，GRP78）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12（caspase-12）、CHOP、肌醇需求酶 1α（inositol-requiring enzyme 1α，IRE1α）以及HMGB1的表達變化，為判斷外傷后延遲性死亡案例的死亡性質(zhì)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

HMGB1兔抗大鼠多克隆抗體購自Abcam公司，GRP78、caspase-12、CHOP、IRE1α 和 β-actin 兔抗大鼠多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，HRP標(biāo)記羊抗兔IgG二抗、BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強型）、蘇木素-伊紅染液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，HMGB1 抑制劑正丁酸鈉（sodium butyrate，SB）購自美國Sigma公司，多聚甲醛、水合氯醛購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，黏附載玻片購自江蘇世泰實驗器材有限公司，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 急性肺損傷大鼠模型的建立與實驗分組

選擇健康SD大鼠48只，雌雄不限，體質(zhì)量約200g，SPF級，由南通大學(xué)實驗動物中心提供。本實驗符合實驗動物使用管理的有關(guān)規(guī)定。

本研究實驗分為兩個部分。各部分實驗中，大鼠隨機分配，每組6只。

第一部分實驗分為擠壓組和體位對照組，其中擠壓組分為3個時間點亞組。擠壓組大鼠制作急性肺損傷模型：大鼠用10%水合氯醛溶液（4 mL/kg）腹腔注射麻醉，麻醉滿意后采取俯臥位，將雙后肢固定于自制帶槽木板上，于雙后肢肌肉豐富處壓15 kg標(biāo)準(zhǔn)重物，持續(xù)擠壓3 h后解壓30 min，再擠壓30 min、解壓30min，其中擠壓30min、解壓30min共重復(fù)3次，最后大鼠解除擠壓放置適當(dāng)時間放血處死。于最后一次解壓結(jié)束后6 h、18 h和30 h放血處死，分別記錄為擠壓后6h、18h和30h組。體位對照組大鼠除不給予標(biāo)準(zhǔn)重物擠壓雙后肢外，麻醉、固定等處理與擠壓組相同。預(yù)實驗結(jié)果顯示，麻醉大鼠給予仰臥位固定3～6h、解除固定后6～30h不能引起肺組織ERS和明顯損傷。因此，體位對照組大鼠于最后一次解壓后18 h放血處死。

第二部分實驗分為體位對照組、擠壓后18h組、HMGB1抑制劑SB組（簡稱“抑制劑組”）和擠壓后18h+抑制劑組。體位對照組和擠壓后18h組按照第一部分實驗操作；擠壓后18 h+抑制劑組于連續(xù)擠壓3 h后腹腔注射SB 500mg/kg，其余處理與擠壓后18h組相同；抑制劑組按照體位對照組操作，于擠壓后18h+抑制劑組中相應(yīng)時間點腹腔注射相同劑量的SB。

1.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測蛋白表達

大鼠放血處死后，迅速開胸提取100 mg右肺組織，經(jīng)液氮凍存后置于-80℃冰箱中保存。按100mg肺組織中加入RIPA中性裂解液1mL［預(yù)先復(fù)溫并含1%苯甲磺酰基氟化物（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）］，于冰上用高壓滅菌的眼科剪將大鼠肺組織剪碎，靜置10 min后，使用電動組織勻漿器進行勻漿，勻漿完成后，靜置30min，隨后在4℃下，以12 000×g離心15min，取上清液進行蛋白定量。蛋白定量使用BCA蛋白濃度測定試劑盒，定量后加入5×上樣緩沖液，于沸水中煮沸5min，隨即置于-80℃冰箱中凍存。對各組蛋白進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，濃縮膠電壓80V，分離膠電壓120V，電泳結(jié)束后進行轉(zhuǎn)印，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，轉(zhuǎn)印條件為100V 1h。轉(zhuǎn)印結(jié)束后，室溫下用5%脫脂牛奶對PVDF膜封閉2 h，洗去殘余的牛奶后，于孵育盒中加入相應(yīng)的兔抗大鼠多克隆抗體作為一抗，HMGB1、GRP78、caspase-12、CHOP 和 IRE1α 稀 釋比例 為 1∶500 或1∶1000，4℃搖床孵育過夜。次日棄去一抗，TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min，隨后在孵育盒中孵育相應(yīng)二抗，室溫下孵育1～2h，TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min，用增強化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）法顯影，采用Bio-Rad成像系統(tǒng)計算灰度值，以 HMGB1、GRP78、caspase-12、CHOP 和 IRE1α與內(nèi)參β-actin的灰度值比值表示目的蛋白的相對表達水平。

1.4 組織病理學(xué)變化

大鼠放血處死后，迅速開胸提取左肺組織置于4%多聚甲醛溶液中固定24～48h，進行常規(guī)石蠟切片制作和HE染色，在生物顯微鏡下觀察肺組織的病理學(xué)變化。同時，觀察大鼠雙后肢大體病理變化。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 創(chuàng)傷應(yīng)激引起大鼠肺組織相關(guān)蛋白的表達變化

2.1.1 HMGB1蛋白

蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示：體位對照組大鼠肺組織存在一定的HMGB1基礎(chǔ)性蛋白表達；與體位對照組比較，擠壓后6 h組大鼠肺組織HMGB1蛋白表達明顯上調(diào)，增加了43.75%（P＜0.05），擠壓后 18h組達到高峰，較體位對照組增加了93.75%（P＜0.05），擠壓后30 h組表達有所降低但仍明顯高于體位對照組（P＜0.05）。 詳見圖1、表1。

圖1 擠壓大鼠后肢后不同時間點肺組織HMGB1蛋白的表達變化

表1 擠壓大鼠后肢后不同時間點肺組織HMGB1和ERS相關(guān)蛋白的相對表達變化 （n=6，±s）

表1 擠壓大鼠后肢后不同時間點肺組織HMGB1和ERS相關(guān)蛋白的相對表達變化 （n=6，±s）

注：1）與體位對照組比較，P＜0.05；2）與相鄰上組比較，P＜0.05

組別 HMGB1 GRP78 caspase-12 CHOP IRE1α體位對照 0.32±0.09 0.46±0.16 0.43±0.10 0.36±0.09 0.45±0.05擠壓后 6h 0.46±0.121） 0.78±0.091） 0.64±0.061） 0.52±0.121） 0.73±0.051）擠壓后 18h 0.62±0.131）2） 1.10±0.011）2） 0.86±0.101）2） 0.73±0.041）2） 0.48±0.162）擠壓后 30h 0.40±0.131）2） 0.74±0.211）2） 0.69±0.101） 0.52±0.121）2） 0.45±0.12

2.1.2 ERS相關(guān)蛋白

蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示：體位對照組大鼠肺組織存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78基礎(chǔ)性表達。與體位對照組比較，擠壓后大鼠肺組織中GRP78、caspase-12、CHOP和IRE1α蛋白表達均明顯上調(diào)，其中，GRP78、caspase-12和CHOP蛋白表達在擠壓后6 h、18 h組呈時序依賴性上調(diào)（P＜0.05），擠壓后30h組有所降低但仍明顯高于體位對照組（P＜0.05），而IRE1α蛋白表達在擠壓后6h組明顯上調(diào)（P＜0.05），擠壓后18h和30h組降低且接近體位對照組水平。詳見圖2、表1。

2.2 HMGB1介導(dǎo)創(chuàng)傷應(yīng)激引起的大鼠肺組織ERS相關(guān)蛋白的表達變化

與擠壓后18h組比較，擠壓后18h+抑制劑組大鼠肺組織HMGB1蛋白表達明顯降低，下調(diào)了45.92%（P＜0.05），GRP78、caspase-12、CHOP 和 IRE1α 蛋白表達分別下調(diào)了 28.75%、36.47%、45.45%、29.33%（P＜0.05）。與體位對照組比較，抑制劑組caspase-12表達明顯降低（P＜0.05），而 GRP78、CHOP、IRE1α 和HMGB1未見明顯變化。與擠壓后18 h+抑制劑組比較，抑制劑組前述各指標(biāo)未見明顯變化。詳見圖3、表2。

圖2 擠壓大鼠后肢后不同時間點肺組織ERS相關(guān)蛋白的表達變化

圖3 HMGB1抑制劑SB對大鼠后肢擠壓后肺組織ERS相關(guān)蛋白表達變化的影響

表2 HMGB1抑制劑SB對大鼠后肢擠壓后肺組織ERS相關(guān)蛋白表達變化的影響 （n=6，±s）

表2 HMGB1抑制劑SB對大鼠后肢擠壓后肺組織ERS相關(guān)蛋白表達變化的影響 （n=6，±s）

注：1）與體位對照組比較，P＜0.05；2）與擠壓后 18h 組比較，P＜0.05

組別 HMGB1 GRP78 caspase-12 CHOP IRE1α體位對照 0.40±0.10 0.62±0.02 0.68±0.01 0.37±0.08 0.53±0.03擠壓后 18h 0.98±0.081） 0.80±0.071） 0.85±0.021） 0.66±0.051） 0.75±0.041）擠壓后 18h+抑制劑 0.53±0.082） 0.57±0.072） 0.54±0.051）2） 0.36±0.072） 0.53±0.062）抑制劑 0.48±0.09 0.59±0.09 0.54±0.041） 0.35±0.01 0.56±0.08

2.3 創(chuàng)傷應(yīng)激引起的大鼠肺組織病理學(xué)變化

體位對照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常。

擠壓組大鼠隨著擠壓和反復(fù)3次間斷擠壓、解壓后，肺組織的病變隨時間遷延逐漸加重，肺泡壁增厚，炎癥細胞數(shù)量增多。與擠壓各亞組比較，擠壓18h+抑制劑組大鼠肺組織病變明顯減輕（如肺泡壁變薄、細胞數(shù)量變少），抑制劑組大鼠肺組織呈現(xiàn)輕度病變。詳見圖4。

2.4 大鼠雙后肢擠壓傷的病理變化

體位對照組大鼠雙后肢、鼠爪大體結(jié)構(gòu)正常。擠壓組大鼠雙后肢經(jīng)過3 h標(biāo)準(zhǔn)重物擠壓及反復(fù)3次間斷擠壓、解壓后，雙后肢明顯壓扁，之后隨著時間延長而明顯增粗，呈紫紅色，橫斷面切開時切面有清亮的液體流淌。與體位對照組比較，抑制劑組大鼠雙后肢無明顯變化。與擠壓后18h組比較，擠壓后18h+抑制劑組大鼠的雙后肢病變無明顯改變。

3 討 論

肺是重要的生命器官之一，肺死亡也是人體死亡的重要標(biāo)志。貌似輕微的局部外傷能夠誘發(fā)體內(nèi)過度的全身性炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等成為導(dǎo)致包括肺在內(nèi)的遠隔器官損傷的重要發(fā)生機制[1-2，5]。急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合征是創(chuàng)傷、燒傷后較為常見的并發(fā)癥，并成為導(dǎo)致肺死亡發(fā)生的主要病理環(huán)節(jié)。研究外傷后急性肺損傷發(fā)生的分子機制，有助于闡明外傷后死亡發(fā)生過程中在分子層次上的因果關(guān)系鏈，具有十分重要的意義。本研究的主要發(fā)現(xiàn)為創(chuàng)傷應(yīng)激能啟動HMGB1-ERS通路導(dǎo)致急性肺損傷。

GRP78是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中重要的分子伴侶，協(xié)助內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)折疊和修飾，其表達明顯上調(diào)是公認(rèn)的ERS標(biāo)志[6]；caspase-12和CHOP蛋白是ERS相關(guān)細胞凋亡的特異性蛋白[6]；IRE1α為ERS啟動后激發(fā)的下游信號分子之一[7]。本研究結(jié)果顯示，連續(xù)擠壓大鼠雙后肢3 h及反復(fù)3次間斷性短暫的擠壓和解壓引起了大鼠肺組織 GRP78、caspase-12、CHOP 和 IRE1α 蛋白表達明顯上調(diào)，說明創(chuàng)傷應(yīng)激導(dǎo)致了大鼠肺組織ERS。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細胞重要的細胞器，承擔(dān)著蛋白質(zhì)合成、加工和修飾，負有蛋白質(zhì)質(zhì)量控制功能，也是細胞內(nèi)Ca2+儲存、維持細胞Ca2+內(nèi)穩(wěn)態(tài)及脂質(zhì)合成代謝的重要場所。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)連核膜、外連細胞膜，成為連接細胞外和細胞核之間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要途徑。然而，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對于細胞內(nèi)外環(huán)境的改變非常敏感。在創(chuàng)傷應(yīng)激過程中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成蛋白質(zhì)過多或加工修飾異常以及轉(zhuǎn)運障礙等均可破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致大量的錯誤折疊或未折疊蛋白質(zhì)聚集于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)，引起ERS[6-7]。杜澍金等[8]研究發(fā)現(xiàn)，擠壓后肢合并浸水束縛應(yīng)激能引起大鼠肝組織ERS。小鼠腸道缺血致急性肺損傷模型中，ERS誘導(dǎo)中性粒細胞顆粒釋放，可促進急性肺損傷的發(fā)生[9]。ERS可能是脂多糖引起的急性肺損傷和肝損傷的重要發(fā)病途徑[10-11]。 研究[6-7]證實，過度的ERS介導(dǎo)細胞凋亡。本課題組最新研究[12]發(fā)現(xiàn)，ERS誘導(dǎo)劑能啟動多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶-1依賴的調(diào)節(jié)性細胞壞死。在本研究中，擠壓大鼠雙后肢引起了ERS相關(guān)的細胞凋亡關(guān)鍵蛋白caspase-12、CHOP表達上調(diào)，表明創(chuàng)傷應(yīng)激引起了肺組織細胞凋亡。ERS及其介導(dǎo)的細胞死亡可能是創(chuàng)傷應(yīng)激引起急性肺損傷的分子機制之一。

本研究探討了創(chuàng)傷應(yīng)激引起大鼠肺組織ERS的途徑，初步揭示HMGB1為創(chuàng)傷應(yīng)激啟動肺組織ERS發(fā)生的上游分子。研究發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷應(yīng)激之后大鼠肺組織HMGB1蛋白表達明顯上調(diào)，18 h達高峰，之后HMGB1蛋白表達呈現(xiàn)下調(diào)趨勢。SHIMAZAKI等[5]報道，大鼠雙后肢受到擠壓結(jié)束后3h血液中HMGB1含量達高峰，之后含量逐漸降低。大鼠燙傷延遲復(fù)蘇后，肺組織HMGB1基因和蛋白表達于傷后8 h開始增高，24h達到峰值[13]。HMGB1表達差異可能與大鼠類型、實驗條件不同有關(guān)。鑒于HMGB1的來源既有激活免疫細胞的主動釋放，又有壞死細胞的被動釋放，肺組織HMGB1蛋白表達上調(diào)的主要原因可能為受損的肺組織細胞HMGB1釋放增多、激活的肺組織巨噬細胞及其他炎癥細胞HMGB1被誘導(dǎo)表達增加，受損的肺外其他器官（尤其是遭受擠壓和缺血再灌注損傷的大鼠雙后肢）釋放的HMGB1也可能經(jīng)過循環(huán)到達肺組織。本研究發(fā)現(xiàn)：SB抑制了創(chuàng)傷應(yīng)激誘導(dǎo)的大鼠肺組織HMGB1蛋白表達的上調(diào)，同時大鼠肺組織ERS相關(guān)蛋白表達明顯下調(diào)，肺組織病理學(xué)變化明顯減輕。這表明HMGB1參與介導(dǎo)了創(chuàng)傷應(yīng)激引起的大鼠肺組織ERS和急性肺損傷。HMGB1是細胞核非組蛋白類蛋白分子，在細胞核中發(fā)揮DNA分子伴侶作用，一旦表達明顯上調(diào)、釋放出胞，主要發(fā)揮損傷相關(guān)模式分子功能，成為放大炎癥級聯(lián)反應(yīng)信號、啟動細胞損傷的重要因素[4]。HMGB1導(dǎo)致細胞和器官損傷的研究早有報道：腹腔注射脂多糖誘導(dǎo)急性肺損傷過程中，NF-κB激活并介導(dǎo)HMGB1表達上調(diào)參與急性肺損傷的發(fā)生發(fā)展過程[14]；使用HMGB1中和抗體可以阻斷HMGB1的作用，減輕創(chuàng)傷引起的炎癥反應(yīng)，提高擠壓后大鼠的存活率[5，15]。本研究結(jié)果顯示，創(chuàng)傷應(yīng)激后大鼠肺組織的主要變化是肺泡壁明顯增厚、細胞數(shù)量顯著增多甚至局灶性肺實變。預(yù)先使用HMGB1抑制劑SB后肺泡壁變薄、細胞數(shù)量減少，有理由推斷，肺泡壁細胞數(shù)增多很可能為表達上調(diào)的HMGB1引起炎癥細胞聚集所致，這也從形態(tài)學(xué)變化角度詮釋了HMGB1參與介導(dǎo)了創(chuàng)傷應(yīng)激引起的大鼠急性肺損傷。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，擠壓大鼠雙后肢創(chuàng)傷應(yīng)激能引起急性肺損傷，而HMGB1介導(dǎo)了創(chuàng)傷應(yīng)激引起的肺組織ERS進而引起急性肺損傷，表明創(chuàng)傷應(yīng)激啟動HMGB1-ERS通路是導(dǎo)致急性肺損傷的分子機制。