放置不同時(shí)間果核微量生物物證的提取

（廣州市番禺區(qū)公安司法鑒定中心，廣東 廣州 511400）

近年來，犯罪分子反偵察意識(shí)增強(qiáng)，留下的常規(guī)生物物證越來越少，DNA檢驗(yàn)的主要對(duì)象逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橐恍┐嬖谛问教厥?、類型多樣的非常?guī)生物檢材，即接觸DNA。目前，接觸DNA檢驗(yàn)是法醫(yī)DNA檢驗(yàn)的難點(diǎn)和熱點(diǎn)，其中接觸DNA的發(fā)現(xiàn)和提取是影響檢驗(yàn)成功率的主要因素之一[1]。本研究將蘋果果核在自然環(huán)境下放置不同時(shí)間，采用擦拭法收集果核不同部位的微量DNA樣本，對(duì)各樣本的STR分型結(jié)果進(jìn)行分析比較，旨在為基層單位微量生物物證的提取檢驗(yàn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

KingFisherTMFlex自動(dòng)純化系統(tǒng)（美國Thermo Fisher Scientific公司），9700型 PCR 儀、3130xl基因分析儀（美國AB公司），生物檢材采集與保存套管（廣州浩源實(shí)驗(yàn)器材科技有限公司），翻轉(zhuǎn)式過濾管（長春市博坤生物科技有限公司）。ML-超微量磁珠法DNA提取試劑盒（長春市博坤生物科技有限公司），PowerPlex?21試劑盒（美國Promega公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)樣本

樣本準(zhǔn)備：已知DNA分型的實(shí)驗(yàn)人員3名。第1周每人每天9時(shí)各啃食一個(gè)蘋果，把果核置于自然環(huán)境（溫度 18～26℃，濕度 40%～80%）下。1周后，每天獲取的3枚果核相當(dāng)于分別放置了1～7d。

樣本采集：第2周周一9時(shí)對(duì)上述果核的咬痕部位和果皮部位（圖1）用生物檢材采集與保存套管內(nèi)的棉簽進(jìn)行擦拭提取。每個(gè)部位提取兩處，分為甲乙兩組，同時(shí)保證每處的采集質(zhì)量。

樣本處理：甲組樣本在采集后立即進(jìn)行DNA檢驗(yàn)；乙組樣本置于套管中在自然環(huán)境（溫度18～24℃，濕度43%～72%）下放置1周，于第3周周一進(jìn)行DNA檢驗(yàn)。

圖1 放置4d的果核

1.3 檢驗(yàn)方法

DNA提?。杭羧「鳂颖久藓灥募舛?，置于0.5mL翻轉(zhuǎn)式過濾管中，加入160 μL消化液和14 μL蛋白酶K，顛倒混勻5次，置于56℃溫浴1h，漩渦振蕩混勻，以離心半徑6cm，12000r/min，離心2min，將上清液加入KingFisherTMFlex自動(dòng)純化系統(tǒng)中，DNA洗脫體積為20μL，運(yùn)行“BKHFZ160_ML”程序提取上述檢材的DNA。

STR復(fù)合擴(kuò)增及檢測分析：使用PowerPlex?21試劑盒在9700型PCR儀上對(duì)21個(gè)STR基因座進(jìn)行擴(kuò)增。采用10μL擴(kuò)增體系，包含：DNA模板3μL，去離子水3μL，反應(yīng)混合物2μL，引物混合物2μL。所有擴(kuò)增產(chǎn)物均取1 μL，使用3130xl基因分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳分離，GeneMapperTMID v3.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。完整的21個(gè)STR基因座包括20個(gè)常染色體STR基因座及Amelogenin基因座，本研究以檢出11個(gè)及以上STR基因座和Amelogenin基因座為“有效檢出”。分型成功的圖譜要求獲得的等位基因峰高大于100RFU，雜合子兩個(gè)等位基因峰的峰面積比值大于70%[2]，無或少雜峰等干擾因素。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件對(duì)檢出的果核咬痕部位和果皮部位甲乙兩組的等位基因峰高均值分別進(jìn)行單因素隨機(jī)區(qū)組的方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 果核形態(tài)學(xué)改變

隨著放置時(shí)間的延長，果核咬痕部位顏色逐漸變深，果皮部位逐漸皺縮。放置2d后可見霉變、長出菌絲并散發(fā)果酸味，咬痕中間位置腐敗較邊緣位置嚴(yán)重。放置5d后腐敗加劇并開始液化。

2.2 STR分型結(jié)果

放置不同時(shí)間果核不同部位DNA檢出情況和等位基因峰高均值見表1～2。放置1～3d，果核咬痕部位均能檢出21個(gè)基因座分型，但峰值逐漸降低，果皮部位也能檢出21個(gè)基因座分型，但峰高均值較咬痕部位低。放置4～5d，咬痕部位部分基因座丟失，但仍能檢出14～19個(gè)基因座分型（圖2），果皮部位均能檢出17～20個(gè)基因座分型（圖3）。放置6～7d，咬痕部位未能檢出有效基因型，果皮部位丟失基因座數(shù)量增加，可檢出12～16個(gè)基因座分型，峰值較低。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：果核咬痕部位和果皮部位在甲乙兩組的等位基因峰高均值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

表1 果核咬痕部位STR分型結(jié)果 （n=3）

表2 果核果皮部位STR分型結(jié)果 （n=3）

圖2 放置4d果核咬痕部位STR分型結(jié)果

圖3 放置4d果核果皮部位STR分型結(jié)果

3 討 論

物質(zhì)轉(zhuǎn)移理論指出，凡是與人體接觸過的各類客體都可能留下接觸者的脫落細(xì)胞[3]?？幸O果等水果時(shí)，口腔黏膜和水果相互擠壓摩擦，脫落細(xì)胞會(huì)留在果核上。由于口腔黏膜細(xì)胞多為有核的鱗狀上皮細(xì)胞，含有完整的二倍體的核DNA基因組，因此果核完全可以作為生物檢材用于DNA多態(tài)性檢測分析[4]。

果核微量物證的采集質(zhì)量決定其檢驗(yàn)成功率的高低。蘋果被啃咬后隨著在空氣中暴露時(shí)間的延長，植物細(xì)胞氧化分解作用加劇，果膠物質(zhì)在酶的催化作用下進(jìn)一步分解為果膠酸和甲醇。同時(shí)潮濕環(huán)境和水果含糖量高等因素，有利于細(xì)菌和霉菌生長繁殖，微生物分泌核酸酶，進(jìn)一步加速了脫落細(xì)胞DNA的降解[5]，從而導(dǎo)致檢驗(yàn)成功率低。本研究觀察到：果核咬痕位置較邊緣位置濕潤，且果肉損傷較大，導(dǎo)致其腐敗速度快，脫落細(xì)胞DNA降解也更嚴(yán)重；果皮由于含有膠質(zhì)成分，且位于邊緣，易風(fēng)干，不易腐敗，脫落細(xì)胞DNA降解相對(duì)慢。同時(shí)，咬痕部位與唇黏膜接觸時(shí)間長，脫落細(xì)胞留存的較多，而果皮表面光滑，口腔黏膜脫落細(xì)胞遺留相對(duì)少。上述可以解釋果核放置相同時(shí)間咬痕部位的等位基因平均峰高高于果皮部位，而果皮在放置7d后仍能有效檢出。馬秀梓等[6]報(bào)道，果核上脫落細(xì)胞的采集使用棉簽擦拭法提取檢出率高。使用棉簽擦拭果核時(shí)，應(yīng)選取合適的部位旋轉(zhuǎn)擦取，力度適中，范圍適中，確保黏附盡量多的脫落細(xì)胞在棉簽的某一點(diǎn)上，避免粘取到較多色素、果膠等雜質(zhì)。

楊電等[7]研發(fā)的生物檢材采集與保存套管內(nèi)含有干燥劑，擦拭提取的棉簽懸空密閉置于套管內(nèi)，可有效防止檢材霉變。本實(shí)驗(yàn)中果核同一部位采集的樣本，采集后立即行DNA檢驗(yàn)和在套管中保存1周后進(jìn)行檢驗(yàn)的STR分型結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明套管在自然環(huán)境下能較好地保存果核微量DNA。這適合基層單位現(xiàn)場果核微量DNA的提取保存，避免提取的檢材因保存不當(dāng)、送檢不及時(shí)等造成污染、耗損及腐敗等問題。

綜上所述，基層單位現(xiàn)場勘驗(yàn)發(fā)現(xiàn)果核時(shí)，可根據(jù)其腐敗程度選擇提取部位，直接使用棉簽擦拭法提取微量DNA并套管保存后送檢，可改善DNA采集和保存質(zhì)量，提高DNA檢驗(yàn)效率。