大豆油和月桂酸制備MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)工藝優(yōu)化及其性質(zhì)分析

王 博，鞠興榮*，周潤松，何 榮，季圣陽

（南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023）

大豆油是中國人最常用的食用油脂之一，目前中國大豆油的進(jìn)口量居世界首位[1]。大豆油原料比較豐富，獲取途徑比較容易且價(jià)廉。月桂酸屬于飽和脂肪酸，其心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)比其他飽和脂肪酸要低，在椰子油、棕櫚仁油這些天然油脂中大量含有[2]。月桂酸單甘油酯具有較強(qiáng)的抗原蟲、抗菌、抗病毒、抗感染的能力，廣泛應(yīng)用于嬰幼兒奶粉、米粉等產(chǎn)品中。Li Qingsheng等[3]在以雌猴為研究對象的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，月桂酸單甘油酯可以有效幫助雌猴避免感染猴免疫缺陷病毒。

結(jié)構(gòu)脂質(zhì)是指采用一定的方法[4-5]對天然油脂進(jìn)行改性，進(jìn)而甘油三酯骨架上的脂肪酸種類和含量發(fā)生變化，使其具有特定生理功能和營養(yǎng)價(jià)值[6-9]。甘油三酯s,n-1,3位上含有中鏈脂肪酸（medium chain fatty acids，MCFA）（C6:0～C12:0）[10]，s,n-2位置含有必需長鏈脂肪酸所形成的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)稱為中長碳鏈（middle-longmiddle，MLM）型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)[11-12]。消化過程中，油脂先與膽汁、胰汁混合，乳化形成微粒結(jié)構(gòu)，再被水解成脂肪酸、2-單甘酯和少量甘油[13]。然而，MCFA在消化時(shí)不需要與其他脂類物質(zhì)形成乳糜微粒[14]，也不易與蛋白質(zhì)結(jié)合形成脂蛋白，不會增加血液中膽固醇的含量，具有一定調(diào)節(jié)血脂作用[15-16]。Ifeduba等[17]用高硬脂酸大豆油和辛酸合成結(jié)構(gòu)脂質(zhì)，改善了其結(jié)構(gòu)與性能。Moreira等[18]使用大豆油和橄欖油得到富含必需脂肪酸的油脂。此外，辛酸或癸酸作為底物合成MLM結(jié)構(gòu)脂質(zhì)研究也有諸多報(bào)道[17,19]。由此可見，提高油脂中MCFA含量，開發(fā)具有特定生理功能和營養(yǎng)價(jià)值的MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)成為研究熱點(diǎn)[20-22]。

本研究以大豆油和月桂酸作為反應(yīng)底物，采用Lipozyme RM IM催化合成MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)，并通過響應(yīng)面試驗(yàn)分析底物（月桂酸∶大豆油）物質(zhì)的量比、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、脂肪酶添加量4 個(gè)因素對生成的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)中月桂酸插入率的影響，明確最佳制備工藝，并分析在該條件下合成的MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)理化性質(zhì)，為開發(fā)抗肥胖、降血脂的優(yōu)質(zhì)油脂提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

固定化1,3位置特異性脂肪酶Lipozyme RM IM丹麥Novozyme公司；精煉大豆油 鎮(zhèn)江中儲糧油脂有限公司；月桂酸（純度＞98%） 麥克林生化科技有限公司；脂肪酸甲酯混標(biāo) 美國Sigma公司；所有實(shí)驗(yàn)用有機(jī)溶劑均為分析純或色譜純。

1.2 儀器與設(shè)備

6890N氣相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司；SHA-B恒溫水浴振蕩器 常州華冠儀器有限公司；N-1100D-WD旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海珂淮儀器有限公司；PE DSC8000差示掃描量熱儀 美國珀金埃爾默有限公司；BSA223S-CW電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；J6冷凍離心機(jī) 美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶法制備MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)工藝流程

取1 mmol精煉大豆油置于25 mL錐形瓶，按一定物質(zhì)的量比例加入月桂酸顆粒，3 mL正己烷，適量脂肪酶，以及酶質(zhì)量8%的去離子水，在一定反應(yīng)溫度條件下，以180 r/min攪拌速率反應(yīng)一定時(shí)間后，離心（4 000 r/min，10 min）去除脂肪酶，得到的反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶液中正己烷，得到制備MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的混合物。

1.3.2 結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的分離純化

采用堿性萃取脫酸法除去1.3.1節(jié)制備的MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)混合物中游離脂肪酸[23-24]。具體操作如下：先在上述混合物中加入10 mL 95%乙醇溶液和1 滴1%酚酞的乙醇溶液，混合均勻，逐滴加入0.7 mol/L KOH溶液直至溶液出現(xiàn)粉紅色且在30 s內(nèi)不褪色，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加入15 mL正己烷劇烈振蕩后靜置分層，收集上層（正己烷與MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)）溶液，通過無水硫酸鈉柱除去溶液中殘留水，轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中除去正己烷，并用氮吹儀除去多余有機(jī)溶劑，即獲得制備MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 氣相色譜分析

SP-2560毛細(xì)管柱（100 m×0.25 mm，0.25 μm）；氫離子化檢測器；進(jìn)樣口溫度240 ℃；分流比50∶1；進(jìn)樣量1.0 μL；載氣N2流速2 mL/min；升溫程序：初溫140 ℃保持5 min，以5 ℃/min的速率升溫至240 ℃，保持30 min。

1.3.4 熔融特性分析

取4～6 mg樣品放在10 μL容量的鋁盤中壓片，使用差示掃描量熱儀測定1.3.2節(jié)制備的MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)熔融特性。升溫條件：第1階段：樣品從室溫快速加熱至80 ℃，保持10 min；第2階段：將樣品以10 ℃/min速率冷卻至-40℃，保持30 min；第3階段：樣品以5 ℃/min速率加熱至80 ℃。

1.3.5 理化指標(biāo)測定

酸價(jià)測定參照GB/T 5009.229—2016《食品中酸價(jià)的測定》，結(jié)果以KOH計(jì)；皂化值測定參照GB/T 5534—2008《動(dòng)植物油脂 皂化值的測定》，結(jié)果以KOH計(jì)；碘值測定參照GB/T 5532—2008《動(dòng)植物油脂 碘值的測定》；煙點(diǎn)測定參照GB/T 20795—2006《植物油脂煙點(diǎn)測定》。

1.3.6 單因素試驗(yàn)

單因素試驗(yàn)中各因素的固定值分別為底物（月桂酸∶大豆油）物質(zhì)的量比4∶1，反應(yīng)時(shí)間20 h，反應(yīng)溫度45 ℃，脂肪酶添加量為底物質(zhì)量的10%。保持其他3 個(gè)因素不變，每次改變1 個(gè)因素，設(shè)計(jì)底物物質(zhì)的量比分別為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1，反應(yīng)時(shí)間分別為12、14、16、18、20、22、24、26 h，反應(yīng)溫度分別為30、35、40、45、50、55、60、65 ℃，脂肪酶添加量分別為4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%、18%，以月桂酸插入率作為評價(jià)指標(biāo)，計(jì)算公式如下：

式中：C為月桂酸插入率/%；A1為結(jié)構(gòu)脂質(zhì)中月桂酸甲酯氣相色譜圖中對應(yīng)峰面積；A2為結(jié)構(gòu)脂質(zhì)中所有脂肪酸甲酯氣相色譜圖所對應(yīng)峰面積。

1.3.7 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，以底物物質(zhì)的量比（A）、反應(yīng)時(shí)間（B）、反應(yīng)溫度（C）脂肪酶添加量（D）為考察變量，以月桂酸插入率為響應(yīng)值（Y），設(shè)計(jì)4因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)，確定最佳工藝。每一變量的低、中、高水平分別以-1、0、1編碼，試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels used for Box-Behnken design

1.4 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)采用Excel和SPSS 20.0軟件進(jìn)行均值方差分析，使用Origin 8.5 Pro軟件進(jìn)行繪圖分析。響應(yīng)面試驗(yàn)用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)并對回歸模型進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖1A可以看出，底物（月桂酸∶大豆油）物質(zhì)的量比對酸解反應(yīng)具有較大影響，在底物物質(zhì)的量比為5∶1時(shí)，月桂酸插入率達(dá)到最大值，然而當(dāng)?shù)孜镂镔|(zhì)的量比大于5∶1時(shí)，月桂酸插入率沒有再繼續(xù)增加反而出現(xiàn)下降趨勢?？赡苁歉咚降挠坞x脂肪酸會產(chǎn)生大量的羧酸基團(tuán)，從脂肪酶表面剝奪必需的水分，從而導(dǎo)致反應(yīng)介質(zhì)被破壞，反應(yīng)朝著逆反應(yīng)方向進(jìn)行[25]。Nunes等[26]在研究橄欖油與辛酸或癸酸優(yōu)化反應(yīng)中，得到最佳比例為2.8∶1和3∶1，可能是月桂酸熔點(diǎn)高常溫條件下呈固體，需要更多的量才能使反應(yīng)充分進(jìn)行。由圖1B可知，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間小于22 h，月桂酸插入率隨著反應(yīng)時(shí)間的延長呈現(xiàn)很明顯的增加趨勢，但反應(yīng)時(shí)間在22～26 h時(shí)，月桂酸插入率的增長趨勢表現(xiàn)相對平穩(wěn)。不同溫度脂肪酶催化效果不同[27]，如圖1C所示，在45 ℃時(shí)，月桂酸的插入率效果最好，與Lipozyme RM IM最佳催化溫度（45 ℃）相一致。如圖1D所示，脂肪酶添加量為12%時(shí)，月桂酸插入率達(dá)到最大值。然而，過高的脂肪酶添加量并沒有明顯提高月桂酸插入率，主要由于底物濃度限制，多余的脂肪酶并未能參與催化反應(yīng)[28]。

圖1 各因素對月桂酸插入率的影響Fig. 1 Effects of various factors on the insertion rate of lauric acid

2.2 MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)合成工藝條件的優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 Experimental design with response variable

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，繼續(xù)對提取條件進(jìn)行優(yōu)化。采用響應(yīng)面軟件Design-Expert 8.0.6設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，并對結(jié)果進(jìn)行回歸分析，見表2。經(jīng)回歸擬合，可以得到月桂酸插入率（Y）對底物物質(zhì)的量比（A）、反應(yīng)時(shí)間（B）、反應(yīng)溫度（C）、脂肪酶添加量（D）的回歸方程：Y=29.44＋4.57A＋0.32B＋0.12C＋0.94D-0.12AB＋0.17AC-0.34AD-0.27BC-0.75BD-0.56CD-4.44A2-1.78B2-1.51C2-2.38D2。

2.2.2 模型方程建立與顯著性檢驗(yàn)

由表3可知，此模型P值小于0.000 1，達(dá)到極顯著水平，且失擬項(xiàng)不顯著（P=0.185 3＞0.05），校正模型的相關(guān)系數(shù)R2為0.907 8，決定系數(shù)為0.926 1，說明回歸模型與實(shí)際值擬合良好，能較好地反映出各因素對月桂酸插入率的影響。由表3可以看出，一次項(xiàng)中，底物物質(zhì)的量比（A）、反應(yīng)時(shí)間（B）影響極顯著（P＜0.001）、脂肪酶添加量（D）影響顯著（P＜0.05），二次項(xiàng)中，BC、C2影響顯著（P＜0.05），A2、B2、D2影響極顯著（P＜0.001）。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

2.3 各因素交互作用對月桂酸插入率的影響

從圖2a～c可以看出，底物物質(zhì)的量比的曲線最陡，幅度最大，可知底物物質(zhì)的量比對產(chǎn)物中月桂酸插入率影響最顯著。從圖2a、d、e可以看出，反應(yīng)時(shí)間的曲線比較平緩，而從圖2c、e、f可以看出，脂肪酶添加量的曲線也比較平緩，因此，反應(yīng)時(shí)間與脂肪酶添加量對月桂酸插入率的影響程度小于底物物質(zhì)的量比。由圖2b、d、f可以看出，反應(yīng)溫度的響應(yīng)面曲線幅度最為平滑，反應(yīng)溫度對月桂酸插入率的影響最小。

在選取的試驗(yàn)因素和水平范圍內(nèi)，根據(jù)回歸模型分析，以月桂酸插入率為評價(jià)指標(biāo)，可以確定最佳的提取工藝條件為底物物質(zhì)的量比5.9∶1、反應(yīng)時(shí)間23.56 h、反應(yīng)溫度45.28 ℃、脂肪酶添加量13.03%，該條件下的月桂酸插入率預(yù)測值為29.87%。在實(shí)際操作中，將工藝條件修正為底物物質(zhì)的量比6∶1、反應(yīng)時(shí)間24 h、反應(yīng)溫度45 ℃、脂肪酶添加量13%，3 次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，月桂酸插入率的平均值為29.26%，與理論值基本相符，表明本實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化工藝參數(shù)具有實(shí)際應(yīng)用指導(dǎo)價(jià)值。

2.4 結(jié)構(gòu)脂質(zhì)物理化學(xué)性質(zhì)分析

表4 大豆油和結(jié)構(gòu)脂質(zhì)理化性質(zhì)分析Table 4 Physicochemical properties of soybean oil and MLM-type structured lipids

在最佳工藝條件下合成MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)，并測定其理化指標(biāo)。如表4所示，碘值是衡量油脂中不飽和度的指標(biāo)，MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的碘值小于沒有改性的大豆油（106.45 g/100 g），主要因?yàn)樵诟男赃^程中加入的MCFA是飽和脂肪酸，油脂的不飽和度也隨之降低，碘值也隨之降低。此外，測定結(jié)果顯示MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的皂化值要明顯大于原大豆油樣品（190.71 mg/g），說明接入月桂酸后，MLM中脂肪酸分子質(zhì)量降低。黏度是流體對流動(dòng)阻力的量度，通過脂肪酶酸解合成結(jié)構(gòu)脂質(zhì)由于插入MCFA，其具有更低的分子質(zhì)量和不飽和程度，對黏度產(chǎn)生一定的影響，所以MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)黏度（70.39 cP）小于大豆油黏度（78.61 cP）。制備的MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)煙點(diǎn)比大豆油樣品略有提高，但無顯著差異（P＞0.05）。品質(zhì)沒有受到加工過程的影響。與Jennings等[29]測定結(jié)果相一致。

2.5 結(jié)構(gòu)脂質(zhì)熔融特性分析

圖3 大豆油和結(jié)構(gòu)脂質(zhì)熔融結(jié)晶曲線圖Fig. 3 DSC thermograms of soybean oil and structured lipids

油脂的熱性能受甘油三酯種類、脂肪酸組成和飽和度的影響[30]。從圖3可以看出，MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的熔融開始溫度為-19.87 ℃，比大豆油（-32.52 ℃）高。原大豆油結(jié)晶開始溫度為-7.65 ℃，MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)結(jié)晶開始溫度為4.89 ℃，說明MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)具有更高的結(jié)晶點(diǎn)。因此，MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)有和大豆油不一樣的熔融特性。熔融曲線特點(diǎn)與Jennings等[29]研究結(jié)果相同。

3 結(jié)論與討論

MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)是改性油脂研究的熱點(diǎn)，由于其特殊的結(jié)構(gòu)特征，在體內(nèi)消化時(shí)不會與其他脂類物質(zhì)形成乳糜微粒，可以快速為人體供能，減少體內(nèi)脂質(zhì)的堆積。Moreira等[18]使用橄欖油，Ifeduba[17]和Jennings[19]等使用辛酸或癸酸作為底物合成MLM結(jié)構(gòu)脂質(zhì)研究都有諸多報(bào)道。本研究對大豆油和月桂酸合成MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的合成工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，其最佳酶催化合成工藝條件為底物（月桂酸∶大豆油）物質(zhì)的量比6∶1、反應(yīng)溫度45 ℃、反應(yīng)時(shí)間24 h、脂肪酶添加量13%，該條件下月桂酸的插入率可以達(dá)到29.26%。理化性質(zhì)方面，MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的碘值、黏度要低于大豆油，皂化值和熔融結(jié)晶溫度均高于大豆油，煙點(diǎn)略微升高，可以用于日常烘焙與食品制備。在后續(xù)研究中，進(jìn)一步進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究，來確定MLM結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的抗肥胖、降血脂等功能性作用，使其更安全有效地應(yīng)用到日常生活中。