柱前衍生化HPLC法分析枸杞多糖中單糖組成

符夢(mèng)凡，趙一帆，閻衛(wèi)東*

（浙江大學(xué)化學(xué)系，浙江 杭州 310027）

枸杞（Lycium barbarum L.）又名枸杞子、西方雪果，是茄族植物枸杞的成熟果實(shí)，是一種傳統(tǒng)的藥食同源植物。枸杞主要產(chǎn)于我國(guó)新疆、青海、寧夏等地，國(guó)外主要分布于日本、朝鮮、歐洲以及北美等地?！侗静菥V目》中記載，枸杞有堅(jiān)筋骨、補(bǔ)精氣諸不足、明目安神等功效。枸杞內(nèi)含有豐富的有益健康的物質(zhì)，如維生素、多糖、生物堿類、有機(jī)酸類、黃酮類、玉米黃質(zhì)、酸漿果紅素、甾醇類、酚類、內(nèi)酯類等[1-3]。其中枸杞多糖是一種重要的生物活性物質(zhì)，具有促進(jìn)身體健康的醫(yī)療功效，如降血脂[4]、降血糖[5]、清除活性氧自由基[6-7]、激發(fā)樹(shù)突細(xì)胞的免疫原性[8]、激發(fā)巨噬細(xì)胞的抗氧化性[9]、抑制肝癌細(xì)胞QGC7703的增殖[10]。近年來(lái)對(duì)多糖的探索研究也成為了醫(yī)學(xué)界和營(yíng)養(yǎng)學(xué)界的研究熱點(diǎn)[11-13]。多糖的結(jié)構(gòu)分析主要以一級(jí)結(jié)構(gòu)為主，即多糖的單糖殘基組成、相鄰糖基之間糖苷鍵的連接方式、糖鏈的分支情況以及異頭物的構(gòu)型等[14-16]。Liu Wei等[17]研究了枸杞多糖p-LBP的結(jié)構(gòu)表征、化學(xué)降解、酶解以及鏈構(gòu)象。Tang Huali等[18]研究了枸杞多糖LBP3a和LBP3b的分子質(zhì)量、單糖物質(zhì)的量比和降糖作用。Gong Guiping等[19]研究了枸杞多糖LBLP5-A的結(jié)構(gòu)表征和抗氧化作用。但是對(duì)枸杞多糖整體的單糖組成分析鮮見(jiàn)報(bào)道。

枸杞多糖是一種健康食品原料，常被制成膠囊、壓片進(jìn)行售賣。然而市售枸杞多糖提取物質(zhì)量良莠不齊，一些廠家可能會(huì)通過(guò)非法添加一些不含功能成分的其他來(lái)源多糖來(lái)降低生產(chǎn)成本，導(dǎo)致其保健功效降低，阻礙了枸杞多糖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，同時(shí)也損害了消費(fèi)者的利益。多糖化合物種類眾多、性質(zhì)相似，常采用硫酸-苯酚、硫酸-咔唑、硫酸-蒽酮等顯色體系經(jīng)反應(yīng)顯色后，使用分光光度法測(cè)定其總多糖含量[20-22]。采用凝膠色譜法[23]和離子色譜法[24]通過(guò)示差檢測(cè)器、蒸發(fā)光檢測(cè)器和電化學(xué)檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，以獲得其分子質(zhì)量和含量。紫外檢測(cè)器是高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）中應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)器之一，但糖類物質(zhì)無(wú)紫外吸收基團(tuán)，無(wú)法用HPLC法直接進(jìn)行定量分析，柱前衍生化HPLC方法中的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）可以在溫和條件下與糖鏈進(jìn)行定量反應(yīng)，使其帶上發(fā)色基團(tuán)、能夠被紫外檢測(cè)[25-27]，降低了糖類檢測(cè)對(duì)儀器的要求，同時(shí)與柱前衍生化氣相色譜法相比較則更為便捷[28-30]。本研究采用水提醇沉法從枸杞中提取枸杞多糖，經(jīng)酸水解和PMP衍生化后，進(jìn)行HPLC分析，該方法經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，可用于分析枸杞多糖中單糖組成的測(cè)定和枸杞多糖提取物及相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸杞干果來(lái)源見(jiàn)表1；乙腈（色譜純） 美國(guó)Sigma公司；葡萄糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖、半乳糖醛酸、氫氧化鈉（NaOH）、磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）、PMP、三氯甲烷、正丁醇、濃硫酸、苯酚（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為純凈水。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-100 HPLC儀 上海伍豐科學(xué)儀器有限公司；OOG-4252-EO C18色譜柱（250 mm×4.60 mm，5 μm）美國(guó)Phenomenex公司；DNG-9070A烘箱 上海精宏科教儀器有限公司；CP225D電子分析天平（精密度為0.01 mg） 德國(guó)Sartorius公司；FD-1A-50真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康科技有限公司；HH-4Y數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋 上海啟前電子科技有限公司；350Y萬(wàn)能粉碎機(jī)西廚電器公司；SHB-III-A循環(huán)水式真空泵 杭州大衛(wèi)科技儀器有限公司；RV05旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國(guó)IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 枸杞多糖的提取[30]

將枸杞干果藥材于烘箱60 ℃烘干，粉碎，稱取適量藥材粉末置于索氏提取器中，加入3 倍體積的氯仿-甲醇（2∶1，V/V）混合溶劑，于80 ℃回流脫脂2 h，過(guò)濾后棄去濾液。再加入3 倍體積的80%乙醇溶液于80 ℃回流2 h除去單糖，過(guò)濾后棄去濾液。再加入5 倍體積熱水于80 ℃回流提取3 h，重復(fù)2 次合并過(guò)濾后的濾液。濾液采用Sevag法[31-32]脫去蛋白后，加入4 倍體積的乙醇使多糖沉淀，依次用乙醇、丙酮淋洗，真空冷凍干燥后得枸杞粗多糖。將10 個(gè)不同產(chǎn)地的枸杞干果按上述方法提取，即制得10 批自制枸杞多糖。

1.3.2 枸杞多糖總糖含量的測(cè)定[33-34]

準(zhǔn)確稱取無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品制成質(zhì)量濃度為64.89 μg/mL的溶液，精密量取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置于10 mL具塞試管，加水補(bǔ)至1.0 mL，各精密加入1.0 mL 5%苯酚溶液（臨用配制）搖勻，豎直懸空緩慢滴加5.0 mL濃硫酸，搖勻后于70 ℃恒溫水浴30 min，取出，迅速冷卻至室溫，以水作為空白，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

精密稱取100 mg枸杞多糖樣品，用水定容至100 mL，精密量取10 mL置于100 mL容量瓶，用水稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL，重復(fù)上述步驟，測(cè)定吸光度，平行測(cè)定3 次。將測(cè)得的吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得樣品質(zhì)量濃度。

1.3.3 枸杞多糖的水解

準(zhǔn)確稱取10 mg枸杞多糖樣品置于10 mL螺紋頂空瓶中，加入2 mol/L鹽酸溶液5 mL，密封，混勻，90 ℃水解3 h，冷卻后于40 ℃旋干，加甲醇旋干至中性，殘?jiān)苡? mL 50%乙醇溶液待衍生化。

1.3.4 PMP衍生化[25-26]

準(zhǔn)確稱取10.20 mg甘露糖、10.68 mg鼠李糖、10.40 mg半乳糖醛酸、11.34 mg半乳糖、10.38 mg阿拉伯糖，分別置于5 mL容量瓶，加水溶解、定容并混勻。移取上述溶液（0.5 mL甘露糖、0.5 mL鼠李糖、1.0 mL半乳糖醛酸、0.5 mL半乳糖、0.5 mL阿拉伯糖），置于10 mL容量瓶中，精密稱取21.40 mg葡萄糖加入其中，加水至刻度，制成混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。移取上述混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液200 μL，置于7 mL離心管中，加入0.5 mol/L PMP-甲醇溶液200 μL、0.3 mol/L NaOH溶液200 μL，充分搖勻，70 ℃水浴反應(yīng)30 min，冷卻至室溫，加0.3 mol/L HCl溶液200 μL，混勻，加入1 mL氯仿萃取過(guò)量的PMP，棄去下層溶液，重復(fù)3 次，8 000 r/min離心10 min后收集上清液，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾待測(cè)，衍生化過(guò)程如圖1所示；精密吸取枸杞多糖水解液，重復(fù)上述步驟，處理后待測(cè)。

圖1 單糖的PMP衍生化過(guò)程Fig. 1 PMP derivatization process of monosaccharide

1.3.5 HPLC條件

將PMP衍生化后的標(biāo)準(zhǔn)品及樣品處理液進(jìn)行HPLC分析。HPLC條件：Phenomenex OOG-4252-EO C18色譜柱（250 mm×4.60 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.05 mol/mL磷酸緩沖液（pH 6.8）（18∶82，V/V）；流速1.0 mL/min；柱溫40 ℃；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm；進(jìn)樣量20 μL。

1.3.6 枸杞多糖提取率

枸杞多糖提取率按公式（1）計(jì)算：

式中：m0為枸杞干果質(zhì)量/g；m1為粗多糖質(zhì)量/g；W為枸杞原料的失水率/%。

1.3.7 枸杞多糖中單糖的含量

枸杞多糖中單糖質(zhì)量濃度及含量按公式（2）、（3）計(jì)算：

式中：Cx為多糖樣品中某單糖的質(zhì)量濃度/（μg/mL）；Ax為多糖樣品中某單糖的峰面積/（mAU·s）；a為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；b為標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距。

式中：wx為多糖樣品中某單糖的含量/（mg/g）；V為樣品溶液的體積/mL；mx為樣品的質(zhì)量/mg。

2 結(jié)果與分析

2.1 枸杞多糖提取率及其總糖含量的測(cè)定

表1 不同產(chǎn)地枸杞的多糖提取率及枸杞多糖總糖含量測(cè)定結(jié)果（n=3）Table 1 Comparison of extraction efficiencies and contents of polysaccharides from Lycium barbarum L. from different geographical origins (n= 3)

如表1所示，不同產(chǎn)地的枸杞在相同提取條件下得到的枸杞多糖提取率有所不同，但大多數(shù)枸杞多糖的提取率均在3%以內(nèi)。其中7號(hào)枸杞樣品的多糖提取率最高，為3.13%，而5號(hào)枸杞樣品的提取率最低，為1.19%。10批枸杞多糖中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在33%～60%之間。

2.2 方法學(xué)考察結(jié)果

線性關(guān)系和檢出限的考察及結(jié)果：將6 種單糖標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液按照葡萄糖質(zhì)量濃度配制為0.053 5、0.107、0.214、0.428、0.856、1.284、1.712、2.14 mg/mL的溶液，按1.3.4～1.3.5節(jié)方法進(jìn)行柱前衍生化HPLC分析，每個(gè)質(zhì)量濃度測(cè)定3 次。根據(jù)峰面積（y）與進(jìn)樣質(zhì)量濃度（x）建立回歸方程來(lái)確定線性范圍。將標(biāo)準(zhǔn)單糖溶液逐級(jí)稀釋，依次進(jìn)樣，記錄各組分的信號(hào)強(qiáng)度與空白樣品的噪音強(qiáng)度，以3 倍信噪比時(shí)相應(yīng)質(zhì)量濃度作為該組分的檢出限，結(jié)果見(jiàn)表2。

儀器精密度的考察及結(jié)果：將1.284 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)單糖混合溶液衍生化后連續(xù)進(jìn)樣6 針，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖的進(jìn)樣相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.96%、1.97%、2.05%、0.83%、2.23%、1.84%。

溶液穩(wěn)定性的考察及結(jié)果：將衍生化后的樣品于4 ℃保存，每隔2 h進(jìn)一針，共6 針，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖的進(jìn)樣相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.65%、3.15%、2.56%、3.18%、2.85%、2.23%。

方法重復(fù)性的考察及結(jié)果：平行配制同一批樣品（編號(hào)9）6 份，水解衍生化后測(cè)定，每一個(gè)樣品連續(xù)進(jìn)樣3 針，由公式（3）計(jì)算6 種單糖的含量，見(jiàn)表3。

表3 枸杞多糖樣品（編號(hào)9）水解產(chǎn)物中單糖含量的測(cè)定結(jié)果（n= 6）Table 3 Repeatabilty of the method for monosaccharide composition analysis of polysaccharides extracted from Lycium barbarum L. (sample 9)

回收率的考察及結(jié)果：精密稱定枸杞多糖樣品（編號(hào)9）38.28 mg，加水定容至5 mL，制得樣品溶液。準(zhǔn)確稱取14.55 mg甘露糖、14.28 mg鼠李糖、16.77 mg半乳糖醛酸、10.29 mg半乳糖、8.43 mg阿拉伯糖，置于10 mL容量瓶中，加水定容。取1 mL上述溶液和107.7 mg葡萄糖于100 mL容量瓶，加水定容混勻，即得高質(zhì)量濃度混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精密量取6.67 mL高質(zhì)量濃度混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，置于10 mL容量瓶中，加水定容，即得中質(zhì)量濃度混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精密量取3.33 mL高質(zhì)量濃度混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，置于10 mL容量瓶中，加水定容，即得低質(zhì)量濃度混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精密吸取0.5 mL樣品溶液3 份，分別加入0.5 mL高、中、低質(zhì)量濃度混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按1.3.3～1.3.5節(jié)方法進(jìn)行水解、衍生化后測(cè)定。重復(fù)測(cè)定3 次，計(jì)算回收率見(jiàn)表4。

表4 加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果Table 4 Recoveries of monosaccharides from spiked sample

從上述考察結(jié)果可以看出，儀器精密度與方法重復(fù)性的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3%，穩(wěn)定性的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%，不同質(zhì)量濃度的加標(biāo)回收率在98%～102%之間，說(shuō)明PMP柱前衍生化方法適用于枸杞多糖水解液中單糖分析。

2.3 枸杞多糖水解物的衍生化HPLC分析

圖2 混合標(biāo)準(zhǔn)單糖（A）、自制枸杞多糖水解物（B）的PMP衍生物色譜圖Fig. 2 HPLC chromatograms of mixed monosaccharide standards (A)and hydrolyzed polysaccharides (B) from Lycium barbarum L. by PMP derivatization

由圖2可知，枸杞多糖的水解產(chǎn)物中，葡萄糖的含量最高，枸杞多糖的單糖含量及物質(zhì)的量比見(jiàn)表5、6。

表5 枸杞多糖水解產(chǎn)物中單糖含量的測(cè)定結(jié)果（n=3）Table 5 Monosaccharide contents of ten laboratory prepared polysaccharide samples (n= 3)

由表5、6可以看出，單糖組分的含量在1.0～280.0 mg/g之間，各批次自制枸杞多糖均含有甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖6 種單糖組分，其中葡萄糖的含量最高，在50～300 mg/g之間，占總糖含量的70.62%～94.74%，阿拉伯糖、半乳糖次之。6 種組分的平均物質(zhì)的量比為：甘露糖∶鼠李糖∶半乳糖醛酸∶葡萄糖∶半乳糖∶阿拉伯糖=1.00∶1.38∶0.63∶92.37∶1.18∶3.55。單糖的含量和組成比例有一定差異，說(shuō)明藥材的產(chǎn)地對(duì)枸杞多糖的單糖組成有一定影響。

表6 枸杞多糖中單糖的物質(zhì)的量比（n=3）Table 6 Molar ratios of monosaccharides in ten laboratory prepared polysaccharide samples (n= 3)

2.4 市售枸杞多糖的鑒別分析

表7 市售枸杞多糖中多糖含量及單糖的物質(zhì)的量比Table 7 Monosaccharide composition of commercial samples

將8 種市售枸杞多糖按1.3節(jié)方法測(cè)定總糖含量，再水解、PMP衍生化后，采用HPLC法測(cè)定多糖水解產(chǎn)物中單糖組分的含量及其物質(zhì)的量比，并與10 批自制枸杞多糖的物質(zhì)的量比進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表7。市售枸杞多糖水解產(chǎn)物的單糖組分出峰順序與自制枸杞多糖一致、葡萄糖含量最高，半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖含量較低。市售樣品1、2、3、4、7、8的多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)在35%～60%之間，葡萄糖的物質(zhì)的量比例在87～139（自制枸杞多糖的0.95～1.5 倍）之間，屬于正常枸杞多糖提取物。而市售樣品5的多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為67.97%，略高于均值，但葡萄糖的物質(zhì)的量比例為236.05（自制枸杞多糖的2.55 倍）；市售樣品6的多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)接近100%，遠(yuǎn)高于均值，葡萄糖的物質(zhì)的量比例為258.14（自制枸杞多糖的2.80 倍），半乳糖和阿拉伯糖未檢出，因此樣品5、樣品6較可能添加了以葡萄糖為單體的其他多糖。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)相比于《中國(guó)藥典》（2015版）中枸杞項(xiàng)下的測(cè)定方法[35]增加了脫蛋白的步驟。枸杞多糖是一種酸性雜多糖同多肽或蛋白質(zhì)構(gòu)成的復(fù)合多糖，藥典中的方法為490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度從而得出總糖含量，蛋白質(zhì)（最大吸收波長(zhǎng)在280 nm）對(duì)其沒(méi)有影響。而PMP衍生化后檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm，蛋白質(zhì)對(duì)其影響較大，因此將多糖脫去蛋白后進(jìn)行分析。

實(shí)驗(yàn)定量分析了6 種單糖（鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、半乳糖醛酸）。依據(jù)文獻(xiàn)中對(duì)枸杞多糖中單糖組成的報(bào)道[18,29-30]，檢測(cè)了9 種單糖（鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、半乳糖醛酸、木糖、巖藻糖、核糖），未檢測(cè)到木糖、巖藻糖、核糖，故只選取前6 種單糖進(jìn)行測(cè)定。

4 結(jié) 論

本研究采用柱前衍生化HPLC法分析了不同產(chǎn)地枸杞多糖的單糖組成，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，該方法可靠、適用性強(qiáng)。通過(guò)測(cè)定自制的10 批不同產(chǎn)地的枸杞多糖中6 種單糖含量，得到了枸杞多糖中6 種單糖的平均物質(zhì)的量比。并測(cè)定了8 批次不同廠家的枸杞多糖中6 種單糖的物質(zhì)的量比，發(fā)現(xiàn)其中有2 批可能添加了以葡萄糖為單體的其他多糖。本方法為枸杞多糖的質(zhì)量控制提供了依據(jù)，可有效防止非法添加的行為。