• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    1 株水開菲爾粒中植物乳桿菌的鑒定及產(chǎn)細(xì)菌素基因分析

    2018-10-08 02:50:16梁新紅冉軍艦孫華迪趙瑞香焦凌霞盧艷清
    食品科學(xué) 2018年18期
    關(guān)鍵詞:菲爾產(chǎn)物氨基酸

    梁新紅,冉軍艦,*,孫華迪,趙瑞香,焦凌霞,盧艷清

    (1.河南科技學(xué)院食品學(xué)院,河南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地,新鄉(xiāng)市農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心,河南 新鄉(xiāng) 453003;2.河南科技學(xué)院新科學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453003)

    食品安全是影響食品質(zhì)量的重要方面,其中食源性微生物引發(fā)的疾病在發(fā)達(dá)和發(fā)展中國家均廣泛存在,嚴(yán)重威脅公共健康。經(jīng)過多年研究,與危害人類健康相關(guān)的食品病原微生物已經(jīng)得到鑒定,比如腸炎沙門菌(Salmonella enteritidis)和大腸桿菌(Eschericia coli),這兩種菌引起75%的食源性疾病[1]。通過抗生素可以抑制病原菌的生長,但是抗生素的濫用使病原菌產(chǎn)生耐藥性,嚴(yán)重威脅人類的健康,所以天然抑菌物質(zhì)得到越來越多的重視。細(xì)菌素是由乳酸菌產(chǎn)生的具有抑菌活性肽類或蛋白類物質(zhì),可用于食品的防腐。產(chǎn)生細(xì)菌素的菌種來源于食品、動物、植物和臨床樣品[2-8],而且不同的菌種產(chǎn)生的細(xì)菌素種類不盡相同,如Nisin(Lactococcus sp.)、Pediocin(Pediococcus sp.)、Lactocin(Lactobacillus sp.)、Enterocin(Enterococcus sp.),革蘭氏陽性菌比革蘭氏陰性菌產(chǎn)生更多種類的細(xì)菌素[9-12]。細(xì)菌素因具有獨(dú)特的抑菌機(jī)制且無毒、無殘留、無抗藥性的特點(diǎn)受到了越來越多的關(guān)注。目前已有多種細(xì)菌素已經(jīng)被分離鑒定,比如Subtilin、Cerein、Thuricin、Plantaricin[13]。但是到目前為止只有Nisin(Lactococcus lactis)、Pediocin(Pediococcus acidilactici)等少量的細(xì)菌素作為商業(yè)生產(chǎn),其他細(xì)菌素仍處于實(shí)驗(yàn)階段,所以細(xì)菌素作為添加劑或者化學(xué)抗菌劑的替代品具有很大潛力,可以廣泛的應(yīng)用在食品行業(yè)。水開菲爾是一種自然發(fā)酵的飲料,具有改善人體胃腸道蠕動、增強(qiáng)身體免疫力的作用,在全球范圍廣泛飲用[14-18]。將水果、水、糖和開菲爾粒混合無氧發(fā)酵2~4 d即可獲得水開菲爾[19-20],在發(fā)酵后期,水開菲爾粒在水開菲爾中形成,通過過濾將水開菲爾粒分離重復(fù)利用。水開菲爾粒易碎,由胞外多糖組成,并含有多種微生物[21-23]。近些年來,有研究關(guān)注于水開菲爾粒發(fā)酵過程的微生物菌落動力學(xué)、生物多樣性和代謝組學(xué),通過研究證明在水開菲爾發(fā)酵過程中起主要作用的是乳酸菌,如副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)、希氏乳桿菌(L.hilgardii)和植物乳桿菌(L. plantarum),以及酵母,如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等[24]。

    本研究從水開菲爾粒中分離出1 株具有抑菌活性的菌株,以該菌為研究對象,對該菌株所屬菌種、所產(chǎn)細(xì)菌素相關(guān)基因進(jìn)行鑒定,并對其編碼基因進(jìn)行分析。研究結(jié)果為該菌株和其細(xì)菌素的應(yīng)用提供理論支持。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    菌株QF01從水開菲爾分離并于實(shí)驗(yàn)室保藏;大腸桿菌(Escherichia coli JM109)為實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

    MRS液體培養(yǎng)基:蛋白胨10 g、葡萄糖20 g、乙酸鈉5 g、檸檬酸氫二銨2 g、Mg2SO4·7H2O 0.58 g、K2HPO42 g、硫酸錳0.25 g、牛肉膏10 g、酵母膏5 g、吐溫80 1 mL、蒸餾水1 000 mL,微調(diào)pH 6.5;MRS固體培養(yǎng)基:固體培養(yǎng)基加瓊脂15 g/L,用于QF01菌的培養(yǎng)。

    LB液體培養(yǎng)基:蛋白胨10 g/L,酵母浸膏5 g/L,NaCl 10 g/L,pH 7.0;LB固體培養(yǎng)基:固體培養(yǎng)基加瓊脂15 g/L,用于E. coli JM109的培養(yǎng)及乳酸菌細(xì)菌素活性測定。

    1.2 儀器與設(shè)備

    ZHWY-211C恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海智城分析儀器制造有限公司;DZKW-4電子恒溫水浴鍋 北京中興偉業(yè)儀器有限公司;JB-CJ-800超凈臺 蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司;JY600電泳儀 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司;GelX1650凝膠成像分析系統(tǒng) 上海歐翔科學(xué)儀器有限公司;Labcycler Standard Plus聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀 美國Bio-Rad公司。

    1.3 方法

    1.3.1 菌種的活化

    在超凈工作臺中活化低溫保藏的菌種QF01,將菌種劃線于MRS固體培養(yǎng)基,在37 ℃條件下培養(yǎng)過夜,挑平板上的單菌落置于10 mL MRS液體培養(yǎng)基中,在培養(yǎng)溫度37 ℃、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min條件下培養(yǎng)12 h。

    1.3.2 抑菌活性測定

    采用牛津杯法測定:取指示菌液100 μL均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基上,放置牛津杯,在杯中注入細(xì)菌素樣品50 μL,菌株QF01產(chǎn)生的細(xì)菌素由硫酸銨沉淀法獲得[25]。在4 ℃條件下靜置過夜,待細(xì)菌素充分?jǐn)U散后放入37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12~16 h,觀察抑菌圈大小,以磷酸緩沖液(pH 6.8)為對照每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

    1.3.3 引物設(shè)計(jì)

    各細(xì)菌素基因PCR合成引物參考文獻(xiàn)[26],擴(kuò)增的各基因引物序列如表1所示,設(shè)計(jì)的引物在上海生工生物工程有限公司合成。

    表1 11 對引物序列Table 1 Sequences of 11 pairs of primers used for PCR

    1.3.4 PCR擴(kuò)增

    用菌株QF01的DNA作為PCR的模板,對細(xì)菌素相關(guān)基因進(jìn)行PCR檢測。反應(yīng)體系為25 μL,包括DNA模板1 μL,10×PCR緩沖液2.5 μL,dNTP 2 μL,Mg2+1.5 μL,上游引物1 μL,下游引物1 μL,rTaq 0.125 μL,ddH2O 16 μL。細(xì)菌素相關(guān)基因的PCR擴(kuò)增條件為:預(yù)熱溫度95 ℃,時(shí)間5 min;解鏈溫度95 ℃、時(shí)間30 s,退火溫度53 ℃、時(shí)間30 s,延伸溫度72 ℃、時(shí)間90 s,循環(huán)30 次;溫度72 ℃再延伸5 min。擴(kuò)增結(jié)束后取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠、1×TAE緩沖液中進(jìn)行電泳,在130 V電壓下,電泳30 min后,取出膠在EB染色池中染色15 min,然后通過紫外凝膠熒光掃描儀檢測。將PCR產(chǎn)物純化后連接到pMD-19T克隆載體上,轉(zhuǎn)入E. coli DH-5α感受態(tài)細(xì)胞。在氨芐抗生素的LB平板上涂布培養(yǎng),挑單菌落PCR鑒定,將獲得的陽性克隆送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。

    1.3.5 序列分析

    利用NCBI網(wǎng)站BLAST程序?qū)Ξa(chǎn)物序列進(jìn)行同源性搜索,分析其保守序列并利用MEGA 5.1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹;使用ProParam tool(http://www.expasy.ch/tools/protparam.html)對其基因編碼產(chǎn)物的理化性質(zhì)進(jìn)行分析;利用TMHMM 2.0在線軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對QF01細(xì)菌素合成必需基因編碼產(chǎn)物的氨基酸序列進(jìn)行跨膜螺旋信號分析;利用在線軟件(http://www.ebi.ac.uk)中的InterProScan工具對QF01細(xì)菌素合成必需基因編碼產(chǎn)物的氨基酸序列結(jié)構(gòu)域預(yù)測;利用在線軟件(http://npsa-pbil.ibcp.fr/)中的SOPM工具進(jìn)行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測;通過ExPASy(http://ca.expasy.org/)提供的SWISS-MODEL在線工具對蛋白質(zhì)進(jìn)行同源建模,查看空間模型[27]。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 抑菌活性

    菌株QF01發(fā)酵上清液中的細(xì)菌素作用于大腸桿菌,如圖1所示,通過與對照組相比較,發(fā)酵上清液具有抑菌作用。

    圖1 菌株QF01產(chǎn)細(xì)菌素抑制大腸桿菌效果Fig. 1 Inhibitory effect of bacteriocin produced by strain QF01 against E. coli

    2.2 菌株QF01基因組DNA提取分析與菌種鑒定

    提取菌株QF01總DNA通過瓊脂糖凝膠電泳,提取的QF01總DNA條帶清晰,沒有雜條帶,片段大小在20 000 bp左右,以此基因組DNA作為16S rDNA的PCR擴(kuò)增模板,得到菌株QF01的16S rDNA片段。

    圖2 菌株QF01 16S rDNA PCR擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳分析Fig. 2 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification product of 16S rDNA from strain QF01

    如圖2所示,16S rDNA引物擴(kuò)增后的條帶在1 400 bp左右,將PCR產(chǎn)物送往測序公司進(jìn)行測序。測定的菌株QF01的16S rDNA序列結(jié)果提交至NCBI中的BLAST進(jìn)行對比,選取部分乳桿菌屬標(biāo)準(zhǔn)菌株的16S rDNA序列共8 個(gè),用軟件MEGA 5.1構(gòu)建菌種系統(tǒng)發(fā)育樹。從圖3可看出,該菌與L. planrarum strain Z55同源性最高,可初步確定該菌株為植物乳桿菌。

    圖3 菌株QF01 16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree of strain QF01 based on 16S rDNA sequence

    2.3 細(xì)菌素合成基因鑒定

    利用設(shè)計(jì)的11 對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖4。通過觀察,發(fā)現(xiàn)只有plnD、plnEF、plnR、plnV擴(kuò)增出現(xiàn)產(chǎn)物條帶,將PCR產(chǎn)物回收測序,進(jìn)行DNA序列的生物信息學(xué)分析。其他基因沒有擴(kuò)增出條帶,可能是因?yàn)樵摼缓羞@些細(xì)菌素的基因。

    圖4 L. planrarum QF01細(xì)菌素相關(guān)基因PCR擴(kuò)增電泳圖Fig. 4 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification products of the bacteriocin-related genes of L. planrarum QF01

    2.4 氨基酸序列比對分析

    利用NCBI網(wǎng)站中的BLAST對植物乳桿菌QF01細(xì)菌素合成基因(plnD、plnEF、plnR、plnV)進(jìn)行比對,發(fā)現(xiàn)PlnD、plnEF、plnR、plnV與植物乳桿菌相關(guān)基因核苷酸序列一致性達(dá)到96%~100%,這表明植物乳桿菌中plnD、plnEF、plnR、plnV基因的核苷酸序列有高度保守性。采用鄰位相接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖5所示,圖中數(shù)字為Bootstrap 1 000 次的置信度,4 個(gè)pln系列基因在各自的發(fā)育樹中均與植物乳桿菌聚類,表明4 個(gè)基因的氨基酸序列在相同物種親緣關(guān)系較近,存在著共同進(jìn)化模式,可為乳桿菌各物種的分類提供依據(jù)。

    圖5 植物乳桿菌QF01四種細(xì)菌素基因氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 5 Phylogenetic analysis of amino acid sequences of four bacteriocin genes of L. plantarum QF01

    2.5 相關(guān)基因編碼產(chǎn)物理化性質(zhì)分析

    在線軟件蛋白預(yù)測結(jié)果顯示,plnD基因的編碼產(chǎn)物蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量為23 743.20 ku,氨基酸數(shù)為206,理論pI值為5.17,脂肪族氨基酸指數(shù)101.80,總平均親水性-0.270,不穩(wěn)定系數(shù)28.50,根據(jù)不穩(wěn)定系數(shù)大于40則該蛋白結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)[28],說明該蛋白質(zhì)是穩(wěn)定的。plnEF基因的編碼產(chǎn)物蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量為6 960.90 ku,氨基酸數(shù)為63,理論pI值為9.99,脂肪族氨基酸指數(shù)85.08,總平均親水性-0.192,不穩(wěn)定系數(shù)15.82,說明該蛋白質(zhì)是穩(wěn)定的。plnR基因的編碼產(chǎn)物蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量為3 288.62 ku,氨基酸數(shù)為234,理論pI值為5.75,脂肪族氨基酸指數(shù)56.15,總平均親水性-0.692,不穩(wěn)定系數(shù)49.76,說明該蛋白質(zhì)不穩(wěn)定。plnV基因的編碼產(chǎn)物蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量為25 022.97 ku,氨基酸數(shù)為226,理論pI值為9.65,脂肪族氨基酸指數(shù)132.29,總平均親水性0.951,不穩(wěn)定系數(shù)20.88,說明該蛋白質(zhì)是穩(wěn)定的。上述分析是軟件預(yù)測結(jié)果,需要進(jìn)一步表達(dá)純化出細(xì)菌素進(jìn)行驗(yàn)證。

    2.6 跨膜螺旋信號分析

    由表2可知,只有plnV基因編碼產(chǎn)物的跨膜螺旋中的氨基酸殘基數(shù)大于18[29],前60 個(gè)氨基酸跨膜螺旋中的殘基數(shù)44 個(gè)(圖6),說明plnV基因編碼產(chǎn)物可能存在跨膜序列,且蛋白的N端存在信號肽。在PDB(Protein Data Bank)數(shù)據(jù)庫中只有1%左右的跨膜蛋白結(jié)構(gòu)[30],膜蛋白在細(xì)胞和外界環(huán)境、細(xì)胞與細(xì)胞之間的信息識別、物質(zhì)交流及運(yùn)轉(zhuǎn)中起著不可替代的作用,所以plnV基因在細(xì)菌素合成過程中起著非常重要的作用,可深入研究。plnD、plnEF和plnR基因編碼產(chǎn)物均無跨膜區(qū)域和信號肽,說明這3 種基因編碼產(chǎn)物合成后不進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)運(yùn),保留在細(xì)胞基質(zhì),易于提取分離。

    表2 L. planrarum QF01細(xì)菌素相關(guān)基因編碼產(chǎn)物的氨基酸跨膜螺旋數(shù)據(jù)Table 2 Analysis of amino acid trans- membrane helix of products encoded by bacteriocin genes in L. planrarum QF01

    圖6 plnV基因編碼產(chǎn)物蛋白質(zhì)序列跨膜螺旋預(yù)測分析Fig. 6 Prediction of the transmembrane helixes of plnV encoding product

    2.7 結(jié)構(gòu)域分析

    通過在線軟件分析可知,在plnD基因編碼產(chǎn)物序列中有信號傳導(dǎo)響應(yīng)調(diào)節(jié)接收器特征結(jié)構(gòu)域,位于第2~129個(gè)氨基酸之間(圖7),該結(jié)構(gòu)域是群體效應(yīng)中調(diào)控細(xì)菌素合成的反應(yīng)調(diào)節(jié)器特征結(jié)構(gòu),對調(diào)節(jié)基因啟動子有重要的作用;在plnEF、plnR、plnV基因編碼產(chǎn)物序列中均沒有家族結(jié)構(gòu)特征。

    圖7 L. plantarum QF01 plnD編碼產(chǎn)物預(yù)測結(jié)構(gòu)域Fig. 7 Predicted domain of plnD-encoding product

    2.8 二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)分析

    表3 L. plantarum QF01細(xì)菌素合成相關(guān)基因編碼產(chǎn)物的二級結(jié)構(gòu)分析Table 3 Analysis of secondary structures of proteins encoded by the bacteriocin-related genesof L. plantarum QF01

    如表3所示,plnD、plnEF、plnR和plnV基因的編碼產(chǎn)物中均存在α-螺旋、伸展鏈、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲,其中α-螺旋在4 種基因編碼產(chǎn)物中所占比例最高。plnD基因編碼產(chǎn)物中有85 個(gè)氨基酸形成α-螺旋,占所有氨基酸的41.26%,plnEF基因編碼產(chǎn)物中有29 個(gè)氨基酸形成α-螺旋,占所有氨基酸的49.15%,plnR基因編碼產(chǎn)物中有101 個(gè)氨基酸形成α-螺旋,占所有氨基酸的43.16%,plnV基因編碼產(chǎn)物中有114 個(gè)氨基酸形成α-螺旋,占所有氨基酸的50.44%。

    將4 種氨基酸序列進(jìn)行同源建模,結(jié)果如圖8所示。plnD編碼產(chǎn)物模型與DNA結(jié)合的反應(yīng)調(diào)節(jié)器蛋白模型同源性最高(22.5%),該蛋白是細(xì)菌素合成的調(diào)節(jié)因子;plnEF編碼產(chǎn)物模型與細(xì)菌素PlnF蛋白模型同源性為100%,plnE起到調(diào)控乳酸菌產(chǎn)生細(xì)菌素的作用;plnR編碼產(chǎn)物模型與甲酸通道蛋白模型同源性為10.89%;plnV編碼產(chǎn)物模型與Ras轉(zhuǎn)化酶1蛋白模型同源性為22.73%,該蛋白是一種膜內(nèi)蛋白酶,能阻斷Ras通路傳導(dǎo)信號。其中plnEF編碼產(chǎn)物同源性最高,另外3 種模型同源性較低。在圖8中能明顯看出蛋白二級結(jié)構(gòu)α-螺旋所占比例較大,對比空間結(jié)構(gòu)的元件及分布,證明二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)結(jié)果一致,表明模型的可信度較高。

    圖8 L. plantarum QF01相關(guān)基因編碼產(chǎn)物的三級結(jié)構(gòu)Fig. 8 Tertiary structures of proteins encoded by the bacteriocinrelated genes of L. plantarum QF01

    3 結(jié) 論

    本研究從水開菲爾粒中分離鑒定出1 株具有抑菌效果的植物乳桿菌QF01,利用已報(bào)道細(xì)菌素相關(guān)基因的11 對特異性引物對植物乳桿菌QF01全基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測序,發(fā)現(xiàn)該菌基因組中存在plnD、plnEF、plnR和plnV基因,并獲得了4 種細(xì)菌素基因序列,通過生物信息學(xué)分析得知4 種細(xì)菌素氨基酸序列,確定plnR基因編碼產(chǎn)物結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,plnD、plnEF和plnV基因編碼產(chǎn)物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定??缒ぢ菪盘柗治龅弥猵lnV基因編碼產(chǎn)物可能存在跨膜序列,且蛋白的N端可能存在信號肽,由于跨膜蛋白在生命體內(nèi)有著重要的作用,所以plnV基因編碼產(chǎn)物可進(jìn)行深入研究。因此,本研究利用分子技術(shù)鑒定細(xì)菌素的方法可以為食品安全提供材料,而且為細(xì)菌素外源表達(dá)提供理論支持。

    猜你喜歡
    菲爾產(chǎn)物氨基酸
    低共熔溶劑在天然產(chǎn)物提取中的應(yīng)用
    最終,菲爾茲獎二次花落女得主
    英語文摘(2022年9期)2022-10-26 06:58:00
    康菲爾科技
    《天然產(chǎn)物研究與開發(fā)》青年編委會
    月桂酰丙氨基酸鈉的抑菌性能研究
    UFLC-QTRAP-MS/MS法同時(shí)測定絞股藍(lán)中11種氨基酸
    中成藥(2018年1期)2018-02-02 07:20:05
    一株Nsp2蛋白自然缺失123個(gè)氨基酸的PRRSV分離和鑒定
    看戲
    氨基酸分析儀測定玉米漿中17種游離氨基酸的不確定度評定
    就我一個(gè)人的時(shí)候
    a级毛片黄视频| 久久久久精品久久久久真实原创| 久久99蜜桃精品久久| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 久久热在线av| 久久久久国产精品人妻一区二区| 老女人水多毛片| 亚洲欧美成人精品一区二区| 中文天堂在线官网| 五月玫瑰六月丁香| 在线观看国产h片| 国产老妇伦熟女老妇高清| 香蕉精品网在线| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 只有这里有精品99| 国产精品三级大全| 丝袜脚勾引网站| 18禁动态无遮挡网站| 两个人免费观看高清视频| 大陆偷拍与自拍| 午夜av观看不卡| 国产成人精品婷婷| 成人漫画全彩无遮挡| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 青春草国产在线视频| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产精品蜜桃在线观看| 99re6热这里在线精品视频| 国产福利在线免费观看视频| 精品久久蜜臀av无| 日韩欧美精品免费久久| 午夜精品国产一区二区电影| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 日本爱情动作片www.在线观看| 亚洲美女搞黄在线观看| 亚洲图色成人| 97超碰精品成人国产| av有码第一页| 亚洲国产精品999| 欧美日本中文国产一区发布| 久久亚洲国产成人精品v| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 街头女战士在线观看网站| 草草在线视频免费看| 大码成人一级视频| 成人无遮挡网站| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 久久久久国产精品人妻一区二区| 国产精品久久久久久精品古装| 国产乱人偷精品视频| 国产午夜精品一二区理论片| 久久久久久久久久成人| 岛国毛片在线播放| 成年人免费黄色播放视频| 国产高清三级在线| 精品亚洲成国产av| 在现免费观看毛片| 大片免费播放器 马上看| 国产成人aa在线观看| 免费黄频网站在线观看国产| 永久网站在线| 国产成人精品婷婷| 欧美成人午夜精品| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 丰满少妇做爰视频| 婷婷成人精品国产| 欧美激情 高清一区二区三区| 精品福利永久在线观看| 一级a做视频免费观看| 国产片特级美女逼逼视频| 在线观看人妻少妇| 人成视频在线观看免费观看| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 在线观看一区二区三区激情| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 男女无遮挡免费网站观看| 免费观看在线日韩| 九色成人免费人妻av| 我要看黄色一级片免费的| 伊人久久国产一区二区| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 亚洲国产欧美在线一区| 欧美xxxx性猛交bbbb| 精品一区二区三卡| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 伦理电影免费视频| 亚洲精品第二区| 在线观看免费视频网站a站| 成年美女黄网站色视频大全免费| 99久久中文字幕三级久久日本| 久久午夜福利片| 熟妇人妻不卡中文字幕| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 精品久久国产蜜桃| 日韩一区二区三区影片| 尾随美女入室| 日本午夜av视频| 亚洲 欧美一区二区三区| 美女视频免费永久观看网站| av有码第一页| 一级毛片 在线播放| 日韩欧美精品免费久久| 国产成人欧美| 深夜精品福利| 午夜av观看不卡| 色视频在线一区二区三区| 久久精品久久久久久久性| 欧美+日韩+精品| 在线观看免费日韩欧美大片| 黄片播放在线免费| 中文字幕制服av| 国产精品.久久久| 久久精品国产自在天天线| 91在线精品国自产拍蜜月| 美女视频免费永久观看网站| 国产一区二区激情短视频 | 看免费av毛片| 日日啪夜夜爽| 边亲边吃奶的免费视频| 青春草亚洲视频在线观看| 国产精品一二三区在线看| 亚洲国产精品999| 中文欧美无线码| 国产精品女同一区二区软件| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| videosex国产| 亚洲精品乱久久久久久| 在线 av 中文字幕| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 亚洲精品aⅴ在线观看| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 欧美xxxx性猛交bbbb| 亚洲国产精品999| 制服诱惑二区| 国产免费一区二区三区四区乱码| 成年女人在线观看亚洲视频| 观看av在线不卡| 男男h啪啪无遮挡| 国产日韩欧美亚洲二区| 交换朋友夫妻互换小说| 国产成人av激情在线播放| 美女视频免费永久观看网站| 人体艺术视频欧美日本| 多毛熟女@视频| 久久人人爽人人片av| 欧美激情 高清一区二区三区| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕 | 久久久欧美国产精品| 2022亚洲国产成人精品| 亚洲,一卡二卡三卡| 18禁观看日本| 男女下面插进去视频免费观看 | 欧美激情极品国产一区二区三区 | 欧美97在线视频| 精品福利永久在线观看| 国产精品女同一区二区软件| 国产日韩欧美亚洲二区| 国产黄色免费在线视频| 美女内射精品一级片tv| 成年女人在线观看亚洲视频| 免费高清在线观看视频在线观看| av国产精品久久久久影院| 久久久久久人妻| 老司机影院毛片| av一本久久久久| 久久精品久久久久久久性| 性高湖久久久久久久久免费观看| 亚洲av福利一区| 欧美精品亚洲一区二区| 99国产精品免费福利视频| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 精品久久久精品久久久| kizo精华| av免费在线看不卡| 韩国av在线不卡| 91精品三级在线观看| 国产 一区精品| 免费观看无遮挡的男女| 亚洲第一av免费看| 国产精品一国产av| 国产片特级美女逼逼视频| 亚洲欧美成人精品一区二区| 亚洲av男天堂| 51国产日韩欧美| 久久av网站| 最黄视频免费看| av国产久精品久网站免费入址| 国产日韩欧美在线精品| 国产精品一国产av| 色婷婷久久久亚洲欧美| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 午夜视频国产福利| 亚洲美女视频黄频| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 国产成人91sexporn| 国产精品熟女久久久久浪| 午夜免费男女啪啪视频观看| 亚洲国产av新网站| 一级黄片播放器| 不卡视频在线观看欧美| 午夜激情久久久久久久| 在线免费观看不下载黄p国产| 免费黄频网站在线观看国产| 大香蕉久久成人网| 亚洲欧洲日产国产| 国产老妇伦熟女老妇高清| 欧美+日韩+精品| 日日撸夜夜添| 成人二区视频| 免费高清在线观看日韩| 大片电影免费在线观看免费| 18禁动态无遮挡网站| 亚洲欧美精品自产自拍| 一区二区三区四区激情视频| 久久久a久久爽久久v久久| 日韩av不卡免费在线播放| 亚洲,一卡二卡三卡| 一级爰片在线观看| 国产黄色免费在线视频| 一区二区三区乱码不卡18| 国产淫语在线视频| av免费观看日本| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲欧美成人精品一区二区| 黑人高潮一二区| 丰满饥渴人妻一区二区三| 国产成人精品福利久久| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 18禁动态无遮挡网站| 亚洲精品aⅴ在线观看| 看免费av毛片| av视频免费观看在线观看| 人人妻人人澡人人看| 在现免费观看毛片| 高清视频免费观看一区二区| 亚洲av福利一区| 欧美 日韩 精品 国产| 寂寞人妻少妇视频99o| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 日本欧美视频一区| 99热国产这里只有精品6| 日本欧美国产在线视频| 看十八女毛片水多多多| 国产片内射在线| 久久精品国产a三级三级三级| 天天操日日干夜夜撸| 一区二区三区四区激情视频| 午夜免费男女啪啪视频观看| 亚洲国产av影院在线观看| 午夜激情av网站| 亚洲国产日韩一区二区| 男女国产视频网站| 精品亚洲成国产av| 日韩伦理黄色片| 51国产日韩欧美| 免费av不卡在线播放| 国产精品欧美亚洲77777| 国产一级毛片在线| 母亲3免费完整高清在线观看 | 大香蕉97超碰在线| 性高湖久久久久久久久免费观看| 制服人妻中文乱码| 午夜影院在线不卡| 少妇被粗大猛烈的视频| 亚洲五月色婷婷综合| 欧美日韩综合久久久久久| 男女国产视频网站| 国产免费又黄又爽又色| 国产成人91sexporn| 日韩一区二区三区影片| 在线看a的网站| 人人澡人人妻人| 国产一区有黄有色的免费视频| 男人操女人黄网站| 亚洲精品第二区| 99视频精品全部免费 在线| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 日日啪夜夜爽| 视频区图区小说| 国产成人aa在线观看| 最近中文字幕2019免费版| 欧美性感艳星| 精品一品国产午夜福利视频| 美女国产视频在线观看| 999精品在线视频| 国产成人精品久久久久久| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 亚洲丝袜综合中文字幕| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 亚洲图色成人| 国产一区二区在线观看日韩| 少妇熟女欧美另类| 国产成人精品久久久久久| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 国产精品国产av在线观看| 日本vs欧美在线观看视频| 丰满饥渴人妻一区二区三| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 9191精品国产免费久久| 亚洲久久久国产精品| 男女边吃奶边做爰视频| 国产一区有黄有色的免费视频| 观看av在线不卡| 亚洲人与动物交配视频| 老司机影院毛片| 天美传媒精品一区二区| 国产伦理片在线播放av一区| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 国产亚洲精品第一综合不卡 | 亚洲伊人久久精品综合| 久久精品久久久久久久性| 亚洲av日韩在线播放| 国产成人a∨麻豆精品| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 夫妻午夜视频| 免费人成在线观看视频色| 七月丁香在线播放| 精品人妻一区二区三区麻豆| 亚洲伊人久久精品综合| 精品亚洲乱码少妇综合久久| av福利片在线| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 亚洲欧洲日产国产| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 欧美另类一区| 国产色婷婷99| 日日撸夜夜添| 国产乱人偷精品视频| 看非洲黑人一级黄片| 久久人人爽人人片av| 欧美精品一区二区大全| 国产精品嫩草影院av在线观看| 欧美最新免费一区二区三区| 久久韩国三级中文字幕| 免费大片黄手机在线观看| 国产精品一区二区在线不卡| 日韩在线高清观看一区二区三区| 国产高清国产精品国产三级| 日本91视频免费播放| 亚洲美女视频黄频| 久久精品国产亚洲av天美| 免费高清在线观看视频在线观看| 一二三四在线观看免费中文在 | av国产精品久久久久影院| 亚洲久久久国产精品| 久久热在线av| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 日本免费在线观看一区| 99久久精品国产国产毛片| 亚洲成色77777| 天美传媒精品一区二区| www.av在线官网国产| 天美传媒精品一区二区| 岛国毛片在线播放| 亚洲成人手机| 国产av码专区亚洲av| 亚洲高清免费不卡视频| 黑丝袜美女国产一区| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 一本久久精品| 久久人妻熟女aⅴ| 国产在视频线精品| 亚洲第一区二区三区不卡| 最近手机中文字幕大全| 最近中文字幕2019免费版| 午夜老司机福利剧场| 免费高清在线观看日韩| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 久久99热6这里只有精品| 这个男人来自地球电影免费观看 | 国产片特级美女逼逼视频| 国产成人精品无人区| 在现免费观看毛片| a级毛片在线看网站| 国产 精品1| 永久免费av网站大全| 老司机亚洲免费影院| 亚洲一码二码三码区别大吗| 欧美日韩av久久| 国产永久视频网站| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国产精品无大码| 亚洲成人一二三区av| 中文欧美无线码| 黄色 视频免费看| 日韩av不卡免费在线播放| 日韩免费高清中文字幕av| 十八禁网站网址无遮挡| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 色5月婷婷丁香| 亚洲情色 制服丝袜| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 韩国av在线不卡| 免费高清在线观看视频在线观看| 久久影院123| 国产伦理片在线播放av一区| 国产亚洲最大av| 久久久欧美国产精品| 亚洲综合色网址| 午夜福利视频在线观看免费| 亚洲欧洲国产日韩| 三上悠亚av全集在线观看| 看非洲黑人一级黄片| 国产69精品久久久久777片| 黄片无遮挡物在线观看| 青春草国产在线视频| 中文字幕人妻丝袜制服| 久久久久精品性色| 国产有黄有色有爽视频| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 99精国产麻豆久久婷婷| 曰老女人黄片| 寂寞人妻少妇视频99o| 国产成人免费无遮挡视频| 国产男女超爽视频在线观看| 国产成人免费无遮挡视频| 大陆偷拍与自拍| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 熟女av电影| 国产综合精华液| kizo精华| 国产av国产精品国产| 国产精品国产av在线观看| 天堂8中文在线网| 夜夜爽夜夜爽视频| 我的女老师完整版在线观看| 国产免费又黄又爽又色| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 美女中出高潮动态图| 我的女老师完整版在线观看| 乱人伦中国视频| av免费在线看不卡| 亚洲国产精品国产精品| 久久久久视频综合| 精品亚洲成国产av| 欧美少妇被猛烈插入视频| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 一区二区av电影网| 在线观看一区二区三区激情| 我的女老师完整版在线观看| 人妻 亚洲 视频| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 日韩一区二区视频免费看| 中国三级夫妇交换| 午夜影院在线不卡| 777米奇影视久久| 国产黄色视频一区二区在线观看| 中文欧美无线码| 亚洲人与动物交配视频| 日本色播在线视频| 亚洲精品中文字幕在线视频| 日本wwww免费看| 中文字幕制服av| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 久热久热在线精品观看| 婷婷色综合www| 亚洲av欧美aⅴ国产| 大香蕉97超碰在线| 久久99精品国语久久久| 一边摸一边做爽爽视频免费| 成人国产麻豆网| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产精品.久久久| 国产av一区二区精品久久| 麻豆乱淫一区二区| 久久久欧美国产精品| 欧美日韩视频精品一区| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 精品一品国产午夜福利视频| 男女边摸边吃奶| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 九九爱精品视频在线观看| 99视频精品全部免费 在线| 视频区图区小说| 欧美丝袜亚洲另类| 免费av不卡在线播放| 国产片内射在线| 成年av动漫网址| 免费高清在线观看视频在线观看| 男男h啪啪无遮挡| 欧美xxxx性猛交bbbb| 午夜福利,免费看| 99热国产这里只有精品6| 欧美成人午夜免费资源| 有码 亚洲区| 在线观看人妻少妇| 美女国产视频在线观看| 亚洲精品国产av蜜桃| 国产欧美日韩综合在线一区二区| av电影中文网址| 亚洲图色成人| 丝袜在线中文字幕| 伦理电影大哥的女人| 男女高潮啪啪啪动态图| 国产黄色视频一区二区在线观看| 热re99久久精品国产66热6| 男女免费视频国产| 我要看黄色一级片免费的| 黄色配什么色好看| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 校园人妻丝袜中文字幕| 乱码一卡2卡4卡精品| 中文字幕人妻熟女乱码| 亚洲国产色片| 亚洲精品aⅴ在线观看| 9191精品国产免费久久| 亚洲人成77777在线视频| 国产成人av激情在线播放| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | av线在线观看网站| 欧美97在线视频| av网站免费在线观看视频| 久久久久人妻精品一区果冻| 99久久人妻综合| 日本黄大片高清| 好男人视频免费观看在线| videosex国产| 亚洲精品国产色婷婷电影| 十八禁高潮呻吟视频| 日韩中字成人| 激情视频va一区二区三区| 亚洲欧美精品自产自拍| 一区二区三区四区激情视频| 亚洲精华国产精华液的使用体验| √禁漫天堂资源中文www| 国产成人欧美| 久久久久久久久久久久大奶| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 午夜免费男女啪啪视频观看| 久久久久久伊人网av| 晚上一个人看的免费电影| 爱豆传媒免费全集在线观看| 久久狼人影院| av在线播放精品| 十八禁网站网址无遮挡| 成年人午夜在线观看视频| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 日韩 亚洲 欧美在线| 最新中文字幕久久久久| 十八禁高潮呻吟视频| 在线观看国产h片| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国产男女超爽视频在线观看| 国产精品熟女久久久久浪| 69精品国产乱码久久久| 男人舔女人的私密视频| 一级a做视频免费观看| 亚洲人成网站在线观看播放| av国产久精品久网站免费入址| 欧美xxⅹ黑人| 亚洲精品456在线播放app| 最新中文字幕久久久久| 另类亚洲欧美激情| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 欧美+日韩+精品| 国产老妇伦熟女老妇高清| 最新的欧美精品一区二区| 丁香六月天网| 亚洲国产欧美在线一区| 精品酒店卫生间| 精品国产国语对白av| 在线观看免费日韩欧美大片| 黄色 视频免费看| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 少妇的逼水好多| av电影中文网址| 日韩av在线免费看完整版不卡| 男女午夜视频在线观看 | 亚洲成人一二三区av| 精品午夜福利在线看| 精品人妻在线不人妻| 咕卡用的链子| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 日韩成人伦理影院| 精品少妇久久久久久888优播| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 久久人人爽人人片av| 亚洲精品色激情综合| 国产成人午夜福利电影在线观看| 一二三四中文在线观看免费高清| 老司机影院毛片| 五月天丁香电影| 少妇人妻 视频| 国产精品久久久av美女十八| 久久国产亚洲av麻豆专区| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 色婷婷久久久亚洲欧美| 精品国产一区二区久久| 免费少妇av软件| 嫩草影院入口| 久久国产精品大桥未久av| 蜜桃国产av成人99| 极品人妻少妇av视频| 精品少妇黑人巨大在线播放| 免费观看性生交大片5| 国产在线视频一区二区| 久久精品夜色国产| 欧美日韩成人在线一区二区| 亚洲美女搞黄在线观看| 日韩中文字幕视频在线看片| 看十八女毛片水多多多| av国产久精品久网站免费入址| 成人手机av| 久久久久久人妻| 青青草视频在线视频观看| 国产成人精品在线电影|