基于基因組學(xué)分析嗜熱鏈球菌KLDS SM的蛋白質(zhì)水解系統(tǒng)和氨基酸合成途徑

李柏良，丁秀云,2，靳 妲，劉 飛，蒙月月，李 娜，趙 莉，霍貴成,*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030；2.廣州基迪奧生物科技有限公司，廣東 廣州 510000）

嗜熱鏈球菌是“公認(rèn)安全性（GRAS）”菌株，廣泛應(yīng)用于發(fā)酵乳制品的工業(yè)生產(chǎn)中，是第二重要的工業(yè)用乳酸菌菌種，市場(chǎng)價(jià)值約400億 美元[1]。嗜熱鏈球菌具有快速產(chǎn)酸的能力，可以縮短發(fā)酵乳制品的凝乳時(shí)間，改善質(zhì)地，同時(shí)提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[2-4]。

隨著測(cè)序技術(shù)逐漸成熟和價(jià)格降低，微生物基因組測(cè)序基本普遍。2004年首次完成了嗜熱鏈球菌LMG 18311與嗜熱鏈球菌CNRZ1066的全基因組測(cè)序工作[1]。截至2017年2月，已有15 株嗜熱鏈球菌的基因組已經(jīng)完成測(cè)序?；蚪M序列分析可以更加深入研究一些代謝途徑的遺傳結(jié)構(gòu)，如氨基酸合成[5]、蛋白水解系統(tǒng)[5]、抗噬菌體[6]、葉酸的生物合成及生物膜的形成[7]。

乳酸菌因缺乏必要的氨基酸代謝途徑，不能從頭合成生長(zhǎng)所需的某些氨基酸。因此，乳酸菌需要從外界環(huán)境中獲取相應(yīng)的活性物質(zhì)。乳酸菌可以利用蛋白水解系統(tǒng)水解牛乳中的酪蛋白供應(yīng)生理代謝需要的肽類(lèi)與氨基酸，同時(shí)部分氨基酸的代謝可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為醛類(lèi)、醇類(lèi)等風(fēng)味物質(zhì)，對(duì)發(fā)酵乳制品的風(fēng)味物質(zhì)形成有重要作用[8]。

酪蛋白水解過(guò)程分為3 個(gè)階段。首先，胞外蛋白酶將乳制品中的酪蛋白水解成肽類(lèi)物質(zhì)；其次，通過(guò)ABC型寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)（Opp）將肽類(lèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)；最后，在胞內(nèi)豐富的肽酶，如二肽酶、羧肽酶及內(nèi)肽酶等的作用下形成游離的氨基酸，可以進(jìn)入代謝途徑或者用于合成蛋白質(zhì)以供菌體需求。其中Opp系統(tǒng)是蛋白水解系統(tǒng)的重要組成部分，由1 個(gè)負(fù)責(zé)膜連接寡肽結(jié)合蛋白（OppA），2個(gè)負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)的跨膜蛋白（OppB、OppC）和2個(gè)ATP結(jié)合蛋白（OppD、OppF）構(gòu)成[8-9]。

嗜熱鏈球菌KLDS SM是本實(shí)驗(yàn)室從內(nèi)蒙古牧民家庭以傳統(tǒng)方法自制的酸奶中分離鑒定得到的。前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)該菌株具有快速產(chǎn)酸和高產(chǎn)黏的特性。為更加深入分析該菌株的性能，本研究采用二代與三代測(cè)序結(jié)合的策略對(duì)該菌株進(jìn)行全基因組測(cè)序，基于生物信息學(xué)分析該菌株蛋白質(zhì)水解系統(tǒng)關(guān)鍵控制基因及氨基酸合成途徑的基因分布情況，同時(shí)利用比較基因組學(xué)分析該菌株與其他菌株在氨基酸合成方面上的差異。為該菌株后續(xù)更加合理的應(yīng)用提供了理論依據(jù)，具有一定指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

M17肉湯培養(yǎng)基 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒 北京天根生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

嗜熱鏈球菌KLDS SM由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室工業(yè)微生物菌種保藏中心（KLDSDICC）提供，且通過(guò)16S rRNA測(cè)序鑒定。選擇已完成測(cè)序的14 株嗜熱鏈球菌進(jìn)行比較基因組學(xué)分析，序列從NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/genomes/420?）下載。14 株菌株信息：菌株LMG 18311（CP000023）、菌株CNRZ1066（CP000024）、菌株LMD-9（CP000419、CP000420、CP000421）、菌株ND03（CP002340）、菌株MN-ZLW-002（CP003499）、菌株ASCC 1275（CP006819）、菌株MN-BM-A02（CP010999）、菌株SMQ-301（CP011217）、菌株MNBM-A01（CP012588）、菌株S9（CP013939）、菌株JIM 8232（FR875178）、菌株CS8（CP016439）、菌株KLDS 3.1003（CP016877）與菌株ND07（CP016394）[1,10-18]。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZF-50KB-II立式蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；CJ-2D超凈工作臺(tái) 天津泰斯特儀器有限公司；DHP-927型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；GL-20G-II離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；DYY-10C電泳儀 北京六一儀器廠；PL2002電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化及基因組提取

將甘油保藏的菌株KLDS SM以2%的體積分?jǐn)?shù)接種于M17液體培養(yǎng)基，42 ℃培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)接2 次，16 h后用于基因組提取。

菌株KLDS SM基因組提取按照細(xì)菌基因組提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。取5 μL基因組DNA樣品進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)提取的質(zhì)量及完整性。

1.3.2 全基因組測(cè)序及組裝

采用二代Illumina Hiseq 2500（500 bp，PE125）平臺(tái)與三代Pacbio RSII（20 K）平臺(tái)聯(lián)合測(cè)序。過(guò)濾Hiseq數(shù)據(jù)除去低質(zhì)量、去除接頭、N含量過(guò)高的reads；過(guò)濾Pacbio的polymerase reads數(shù)據(jù)除去低質(zhì)量reads、接頭序列，并將polymerase reads轉(zhuǎn)換為subreads。對(duì)每個(gè)ZMW（zero-mode waveguides）中的subreads去冗余等處理得到CCS（circular consensus sequences）序列，對(duì)CCS做自糾正并組裝序列。使用SMRT Analysis v2.3.0流程中的RS_HGAP_Assembly3[19]軟件將PacBio序列組裝成完整的連續(xù)的contig，根據(jù)contig兩端是否已經(jīng)有Overlap判斷基因組是否成環(huán)?；贗llumina Hiseq 2500數(shù)據(jù)利用兩輪分析方法對(duì)contig進(jìn)行單堿基糾錯(cuò)，即采用GATK分析流程對(duì)Contig進(jìn)行第1輪糾錯(cuò)分析，采用軟件SOAPsnp v1.05[20]與SOAPindel v1.08[21]對(duì)第1輪的糾錯(cuò)結(jié)果進(jìn)行第2輪糾錯(cuò)分析。

1.3.3 基因組注釋

組裝成環(huán)的基因組序列提交到NCBI。采用NCBI原核基因組注釋流程PGAP[22]及RAST Server[23]進(jìn)行全基因組注釋。注釋結(jié)果及序列從NCBI（ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCA/001/663/795/GCA_001663795.1_ASM166379v1/）下載?；蚪M中蛋白序列通過(guò)WebMGA網(wǎng)站[24]進(jìn)行COG（cluster of orthologous group）注釋?zhuān)≧PSBLAST，e-value＜1e-5）；在KAAS網(wǎng)站[25]，采用BBH（bi-directional best hit）方法對(duì)基因組中的蛋白編碼基因進(jìn)行KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）在線(xiàn)注釋?zhuān)镞x擇“eco，bsu，sau，lmo，lla，spy，spn，ste，lpl，lpj，ljo，ljf，lac，lsa，lsl，ldb，lbu，lbr，lca，lcb，lga，lre，lrf，lhe，lfe，lrh，lrl，stc，stl”[26]。

1.3.4 生物信息分析

采用CGView Server[27]繪制基因組圈圖；蛋白質(zhì)水解與氨基酸合成代謝途徑參照KEGG通路數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.genome.jp/kegg/pathway.html）進(jìn)行挖掘；蛋白質(zhì)序列從Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)[28]下載；使用本地BLASTP（2.2.31＋）確認(rèn)各基因在該基因組中存在情況，取最優(yōu)比對(duì)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組的基本特征及注釋

2.1.1 組裝結(jié)果

經(jīng)Illumina Hiseq 2500（500 bp，PE125）平臺(tái)測(cè)序得到467 Mb原始數(shù)據(jù)，過(guò)濾后獲得401 Mb Clean Data。Pacbio RSII（20 K）平臺(tái)測(cè)序得到38 403 條polymerase reads，平均長(zhǎng)度14 976 bp，共643 231 812 bp；過(guò)濾后獲得63 855 條subreads，平均長(zhǎng)度8 972 bp，共572 949 237 bp。經(jīng)組裝、糾錯(cuò)、成環(huán)判斷等過(guò)程獲得一條長(zhǎng)為1 856 787 bp完整、連續(xù)且成環(huán)的contig。

2.1.2 基因組的基本特征

圖1 菌株KLDS SM基因組圈圖Fig. 1 Circular genome map of strain KLDS SM

菌株KLDS SM的全基因組序列已提交到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為：CP016026。基因組圖譜可以直觀體現(xiàn)基因組功能注釋結(jié)果和GC偏移情況，圖1為菌株KLDS SM全基因組圈圖，說(shuō)明菌株KLDS SM全基因組測(cè)序已經(jīng)達(dá)到完成圖水平，且該基因組為雙鏈環(huán)狀分子。

表1 嗜熱鏈球菌基因組基本信息比較Table 1 Comparison of genomic features of Streptococcus thermophilus

如表1所示，同絕大多數(shù)已測(cè)序的嗜熱鏈球菌一樣，菌株KLDS SM基因組中不存在質(zhì)粒，僅由一條環(huán)狀的染色體組成，全長(zhǎng)1 856 787 bp，平均GC含量為39.08%。在基因組中共預(yù)測(cè)1 732 個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因（protein coding genes，CDS），其中129 個(gè)（6.9%）基因發(fā)生突變?yōu)榧倩?，CDS總長(zhǎng)1 559 226 bp，占全基因組序列的83.97%，基因的平均長(zhǎng)度為838 bp。此外，基因組包含6 個(gè)完整的rRNA基因操縱元，其中一個(gè)操縱元與DNA復(fù)制的方向相反，67 個(gè)tRNA基因及4 個(gè)ncRNA。比較發(fā)現(xiàn)，菌株KLDS SM有較多的rRNA基因操縱子、tRNA基因及ncRNA，較少的假基因。

2.1.3 COG注釋

通過(guò)WebMGA網(wǎng)站對(duì)菌株KLDS SM基因組中具有生物學(xué)功能的蛋白編碼基因進(jìn)行COG注釋。結(jié)果表明共有1 400 個(gè)蛋白編碼基因注釋到COG數(shù)據(jù)庫(kù)。如圖2所示，分別有41、16、181、73、81、56、31、142、89、154、79、6、49、82、10、175、130、47、23、43 個(gè)基因注釋到分類(lèi)C～V。其中注釋到氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝（12.9%），翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成（10.1%），復(fù)制、重組和修復(fù)（11%），一般功能（12.5%）及具有潛在功能的假定蛋白（9.3%）5 種分類(lèi)的基因數(shù)較多。另有332 個(gè)（19.2%）具有潛在生物學(xué)功能的基因未被注釋到數(shù)據(jù)庫(kù)中。

圖2 菌株KLDS SM基因組蛋白編碼基因的COG功能分類(lèi)Fig. 2 COG functional classification of protein-encoding genes in strain KLDS SM genome

2.2 蛋白質(zhì)水解系統(tǒng)

2.2.1 胞外蛋白水解

牛乳中的氮源多以酪蛋白的形式存在，很少存在游離的氨基酸。菌株KLDS SM基因組中存在一個(gè)完整的編碼錨定細(xì)胞壁的絲氨酸蛋白酶PrtS的基因A9497_00420。PrtS是降解牛乳中酪蛋白最重要的蛋白酶，由1 618 個(gè)氨基酸組成且高度保守，與豬鏈球菌編碼的PrtS的氨基酸序列有96%的一致性。如圖3所示，該蛋白從N-末端至C-末端依次為YSIRK_signal、Peptidases_S8_C5a_Peptidase、PA_C5a_like、fn3_5、FIVAR與Gram_pos_anchor結(jié)構(gòu)域，其中N-末端35 個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列。

圖3 菌株KLDS SM的 PrtS結(jié)構(gòu)Fig. 3 PrtS architecture of strain KLDS SM

2.2.2 轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)

如表2所示，菌株KLDS SM基因組中存在兩個(gè)Opp系統(tǒng)，且二者結(jié)構(gòu)上有所不同。其中一個(gè)Opp長(zhǎng)約10 kb，由6 個(gè)基因組成（A9497_03140～A9497_03160，A9497_03170），由2 個(gè)oppA與oppB、oppC、oppD、oppF各1 個(gè)組成，且在oppA與oppB之間相反鏈上有一編碼轉(zhuǎn)座酶的基因。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)2 個(gè)oppA僅有86%的一致性。另一個(gè)Opp長(zhǎng)約4 kb，同樣以oppA、oppB、oppC、oppD、oppF順序依次排列，僅有一個(gè)oppA，但該系統(tǒng)每個(gè)基因都發(fā)生了不同程度的突變，如oppA與oppB序列截短，oppC與oppD序列發(fā)生多處移碼，oppF則因突變提前終止。因此這個(gè)Opp不具有轉(zhuǎn)運(yùn)功能。

表2 菌株KLDS SM的肽與氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)Table 2 Peptide and amino acid transport systems of strain KLDS SM

同時(shí)，基因組中還存在許多編碼轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸的基因，以供菌體生理代謝的需求。L-谷氨酰胺ABC型轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)由1 個(gè)谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)底物結(jié)合蛋白（GlnH）、1 個(gè)滲透酶蛋白（GlnP）及1 個(gè)ATP結(jié)合蛋白（GlnQ）組成，菌株KLDS SM基因組上存在完整的編碼轉(zhuǎn)運(yùn)L-谷氨酰胺的ABC型轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的基因，并且每個(gè)基因都有2～3 個(gè)拷貝。支鏈氨基酸為亮氨酸、異亮氨酸與纈氨酸的總稱(chēng)，其ABC型轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)由1 個(gè)支鏈氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)底物結(jié)合蛋白（LivK）及相應(yīng)的2 個(gè)滲透酶蛋白（LivH、LivM）、2 個(gè)ATP結(jié)合蛋白（LivG、LivF）組成，該菌基因組中同樣具有一個(gè)完整的該轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的編碼基因。該菌可以通過(guò)蛋氨酸ABC型轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋氨酸，該系統(tǒng)同樣由3 個(gè)蛋白構(gòu)成，即蛋氨酸ABC型轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)底物結(jié)合蛋白（MetQ）與相應(yīng)的滲透酶蛋白（MetI）、ATP結(jié)合蛋白（MetN）。菌株可以轉(zhuǎn)運(yùn)亞精胺/腐胺，該轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)由1 個(gè)亞精胺/腐胺ABC型轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)底物結(jié)合蛋白（PotD）、2 個(gè)滲透酶蛋白（PotB、PotC）與ATP結(jié)合蛋白（PotA）構(gòu)成，其中編碼PotD的基因有兩個(gè)拷貝?；蚪M中缺失編碼賴(lài)氨酸ABC型轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的滲透酶蛋白（LysX2），因此該菌無(wú)法轉(zhuǎn)運(yùn)賴(lài)氨酸。除此之外，該菌株可以編碼一些滲透酶及電化學(xué)勢(shì)驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)運(yùn)相應(yīng)的氨基酸供菌體使用。

2.2.3 胞內(nèi)肽酶

如表3所示，在菌株KLDS SM基因組中共預(yù)測(cè)出21 個(gè)肽酶編碼基因，其中3 個(gè)基因編碼胞外肽酶參與細(xì)胞壁的形成，剩余的18 個(gè)基因均編碼胞內(nèi)肽酶。這些胞內(nèi)肽酶包括8 個(gè)氨肽酶、1 個(gè)羧肽酶、3 個(gè)二肽酶與4 個(gè)內(nèi)肽酶，且僅有一個(gè)編碼二肽酶PepD的基因因突變失去功能，其余的肽酶均具有生物學(xué)功能。

2.3 氨基酸的生物合成

菌株KLDS SM的20 種氨基酸生物合成途徑注釋結(jié)果如圖4所示，菌株KLDS SM有完整的組氨酸、色氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸與丙氨酸生物合成途徑，因此該菌具有合成這8 種氨基酸的能力。此外，基因組中缺失編碼芳香族氨基酸轉(zhuǎn)氨酶的基因，無(wú)法將谷氨酸的氨基轉(zhuǎn)移到苯丙酮酸及4-羥基苯丙酮酸上，即無(wú)法合成酪氨酸與苯丙氨酸。缺失編碼丙酮酸羧化酶PC（EC:6.4.1.1）的基因，不能將丙酮酸合成草酰乙酸，缺失編碼TCA循環(huán)中的多種酶的基因不能為天冬氨酸的合成提供草酰乙酸，并且缺失編碼天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（EC:2.6.1.1）的基因，無(wú)法轉(zhuǎn)氨合成天冬氨酸。具有編碼將游離的結(jié)合到天冬氨酸形成天冬酰胺的天冬氨酸-氨連接酶的基因A9497_08040（asnA，EC:6.3.1.1）。具有催化天冬氨酸轉(zhuǎn)化成天冬氨酸-β-半醛，合成蘇氨酸、異亮氨酸主鏈、甲硫氨酸及二氨基庚二酸主鏈及甲硫氨酸的酶的編碼基因，但因缺失編碼D-檸蘋(píng)酸合成酶的基因無(wú)法為異亮氨酸、二氨基庚二酸的合成提供相應(yīng)的側(cè)鏈，因此不能合成異亮氨酸、賴(lài)氨酸。該菌具有編碼由草酰乙酸合成α-酮戊二酸以及由α-酮戊二酸合成谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸與脯氨酸的一系列酶的編碼基因。

圖4 菌株KLDS SM的氨基酸生物合成Fig. 4 Amino acid biosynthesis in strain KLDS SM

比較基因組分析發(fā)現(xiàn)，15 株嗜熱鏈球菌中氨基酸合成情況相對(duì)保守。除了菌株LMG 18311、菌株CNRZ1066、菌株S9與菌株CS8因缺失編碼組氨酸途徑的多種酶的基因而無(wú)法合成組氨酸外，15 株菌株合成氨基酸的能力相似。組氨酸的酶促合成有9 種酶參與反應(yīng)，即由5-磷酸核糖-1-焦磷酸作為底物，在酶ATP磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶、焦磷酸水解酶、磷酸核糖-AMP環(huán)化水解酶、磷酸核糖亞氨甲基-5-氨基咪唑-4-羧酰胺核苷酸同分異構(gòu)酶、谷氨酰胺氨基轉(zhuǎn)移酶、咪唑甘油磷酸脫水酶、L-組氨醇磷酸氨基轉(zhuǎn)移酶、L-組氨醇磷酸磷酸酶及組氨醇脫氫酶的作用下合成L-組氨酸。而這9 種酶的編碼基因在菌株KLDS SM（A9497_02145～A9497_02190，GC含量42.6%）及另外10 株菌的基因組中常常成簇存在。

3 討 論

嗜熱鏈球菌常與保加利亞乳桿菌一起作為發(fā)酵劑，廣泛應(yīng)用于酸奶、奶酪和其他乳制品的工業(yè)生產(chǎn)中[29]。嗜熱鏈球菌具蛋白水解酶活性，快速增長(zhǎng)，產(chǎn)生胞外多糖、細(xì)菌素、風(fēng)味物質(zhì)及抗噬菌體等特點(diǎn)，直接或間接影響著發(fā)酵乳制品的質(zhì)量[2-4]。其中蛋白水解酶活性與風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生能力是篩選生產(chǎn)菌株的關(guān)鍵特性。風(fēng)味是決定乳制品的可接受性的關(guān)鍵因素，嗜熱鏈球菌蛋白水解系統(tǒng)降解酪蛋白是風(fēng)味物質(zhì)的重要前體，并且水解活性與產(chǎn)酸能力緊密相關(guān)[3]。

由于分子生物學(xué)研究手段的限制，傳統(tǒng)的乳酸菌研究多集中于根據(jù)生理生化實(shí)驗(yàn)及常規(guī)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)探究乳酸菌的特性，只能以單個(gè)基因和途徑為目標(biāo)，很難對(duì)多基因及代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行深入研究[30]。隨著基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，研究人員可以利用生物信息學(xué)的手段充分挖掘乳酸菌基因組信息，2004年，Bolotin等[1]通過(guò)比較基因組分析，證明了由于嗜熱鏈球菌長(zhǎng)期在乳生態(tài)位中生長(zhǎng)，其有害基因已經(jīng)失活或丟失；2009年，Pastink等[31]基于全基因組構(gòu)建了嗜熱鏈球菌LMG18311的代謝模型；2013年，F(xiàn)lahaut等[32]構(gòu)建了乳酸乳球菌MG1363的代謝模型，并應(yīng)用于風(fēng)味形成途徑分析；2017年，Veronica等[33]對(duì)8 株已完成基因組測(cè)序的嗜熱鏈球菌進(jìn)行了比較基因組學(xué)和生理學(xué)研究。基于此，本研究從遺傳水平上分析了菌株KLDS SM在蛋白質(zhì)水解和氨基酸生物合成2 個(gè)方面相關(guān)的一系列基因。菌株KLDS SM基因組中有2 個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)寡肽的Opp系統(tǒng)，其中一個(gè)完整的Opp系統(tǒng)，而且該系統(tǒng)有兩個(gè)oppA，這或許與更加有效地捕捉底物有關(guān)，但另一個(gè)Opp系統(tǒng)中的每個(gè)基因發(fā)生了不同程度的缺失、移碼突變及無(wú)義突變，說(shuō)明該轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)較早開(kāi)始退化。除此之外，該菌株還可以通過(guò)ABC型轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)L-谷氨酰胺（每個(gè)基因具有2 個(gè)拷貝）、支鏈氨基酸、蛋氨酸、亞精胺/腐胺（底物結(jié)合蛋白2 個(gè)拷貝），以及一些滲透酶及電化學(xué)勢(shì)驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)運(yùn)相應(yīng)的氨基酸供菌體使用。

本研究共預(yù)測(cè)了18 個(gè)編碼胞內(nèi)肽酶基因，包括氨肽酶、羧肽酶、二肽酶與內(nèi)肽酶，且僅有2 個(gè)基因發(fā)生突變。與大多數(shù)乳酸菌不同的是，嗜熱鏈球菌基因組中編碼肽酶的基因并不形成操縱子，而且也不位于編碼氨基酸/肽類(lèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的基因的附近，這點(diǎn)與Goh等[34]分析的結(jié)果一致。此外，該菌株基因組中具有編碼合成8 種氨基酸組氨酸、色氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸和丙氨酸所需酶的基因，其中纈氨酸、亮氨酸和色氨酸為人體必需氨基酸。而在某些氨基酸合成路徑中，如酪氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸與賴(lài)氨酸，僅因基因組中缺失某個(gè)催化酶的編碼基因而無(wú)法合成。比較基因組分析發(fā)現(xiàn)，15 株嗜熱鏈球菌中氨基酸合成情況相對(duì)保守，僅在組氨酸合成途徑存在較大的差異。

4 結(jié) 論

菌株KLDS SM的基因組由一個(gè)1 856 787 bp環(huán)狀染色體組成，GC含量為39.08%，含有1 732 個(gè)CDS。從基因組水平分析，菌株KLDS SM具有完整的蛋白水解系統(tǒng)，并可以合成組氨酸、色氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸和丙氨酸8 種氨基酸。比較基因組分析發(fā)現(xiàn)，不同嗜熱鏈球菌菌株間的氨基酸合成能力較為保守，僅在組氨酸合成途徑存在較大的差異。