梯棱羊肚菌子實(shí)體轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及解析

王金秋，葉鴻亮，梁道崴，劉達(dá)玉，耿 放，李 翔*

（成都大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，四川 成都 610106）

羊肚菌（Morchella）隸屬于盤菌目（Pezizales）羊肚菌科（Morohellaceae）[1]，是一種全世界廣泛分布的藥食兩用真菌[2]。羊肚菌子實(shí)體質(zhì)地脆嫩，廣受消費(fèi)者歡迎[3-4]，其氨基酸含量豐富、種類齊全，是優(yōu)質(zhì)的植物蛋白資源，高比例鮮味氨基酸更是賦予其鮮美的滋味[5-6]。羊肚菌中不飽和脂肪酸比例高，以亞油酸為主，對(duì)人體健康具有積極作用[7-8]。羊肚菌中的碳水化合物主要為膳食纖維、甘露醇、海藻糖等，具有抗氧化、抗腫瘤、調(diào)控血糖、提高免疫力等功效[9-11]。此外，其他生物活性物質(zhì)如甾醇、酚類等也具有多種功效[12-13]。

長(zhǎng)期以來(lái)，羊肚菌都以野生栽培為主，因此產(chǎn)量較少、價(jià)格昂貴。近年來(lái)，羊肚菌人工栽培得已實(shí)現(xiàn)，性狀穩(wěn)定，產(chǎn)量逐年上升，產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展[14-16]。但新鮮羊肚菌子實(shí)體質(zhì)地脆嫩，不耐貯藏，且采摘后的呼吸活動(dòng)劇烈，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗快，易出現(xiàn)萎蔫、褐化、腐敗等現(xiàn)象[17]，其采后貯藏保鮮問(wèn)題限制了產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，通過(guò)遺傳選育、采后分子調(diào)控等措施延長(zhǎng)羊肚菌保藏時(shí)間，將具有重要意義。然而，目前羊肚菌尚鮮見高質(zhì)量的遺傳信息數(shù)據(jù)，限制了相關(guān)研究的開展。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是一種高通量獲取遺傳信息的技術(shù)手段，已廣泛應(yīng)用于食用菌的研究中[18-27]。本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)，以四川地區(qū)廣泛的栽培種梯棱羊肚菌（Morchella importuna）為材料，對(duì)羊肚菌成熟子實(shí)體轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行深度測(cè)序，通過(guò)從頭組裝拼接獲得unigene，并對(duì)其功能進(jìn)行注釋和分類；在此基礎(chǔ)上，對(duì)影響羊肚菌采后食用品質(zhì)的相關(guān)代謝路徑中關(guān)鍵基因進(jìn)行挖掘，以期為羊肚菌貯藏保鮮技術(shù)的開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

梯棱羊肚菌（Morchella importuna）成熟子實(shí)體采自于四川省成都市金堂縣（圖1）。采摘后挑選新鮮、完整、無(wú)腐爛病害的子實(shí)體5 株，每株沿子實(shí)體軸線縱切，取約2 mm厚的組織，立即液氮速凍。

圖1 梯棱羊肚菌成熟子實(shí)體Fig. 1 Mature fruiting body of Morchella importuna

總RNA提取試劑盒（TRIzol?Reagent）、DynabeadsTMmRNA純化試劑盒 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；文庫(kù)建立試劑盒（TruseqTMRNA Sample Prep Kit）、橋式擴(kuò)增試劑盒（HiSeq 4000 PE Cluster Kit）美國(guó)Illumina公司；文庫(kù)回收試劑（Certified Low Range Ultra Agarose） 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DYY-12型電泳儀、DYCZ-24DN型水平電泳槽北京六一儀器廠；3-30K離心機(jī) 德國(guó)Sigma Laborzentrifugen公司；磁力架、NanoDrop 2000型紫外-可見分光光度計(jì) 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；渦旋儀 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 羊肚菌子實(shí)體總RNA提取

將5 株羊肚菌子實(shí)體樣品混合后研磨，使用總RNA提取試劑盒（TRIzol?Reagent）按照說(shuō)明書提取總RNA，利用紫外光吸收法檢測(cè)RNA的濃度和純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。

1.3.2 羊肚菌子實(shí)體RNA測(cè)序

向得到的總RNA中加入磁珠，通過(guò)堿基配對(duì)，進(jìn)一步富集mRNA。隨后加入片段化緩沖液，將mRNA隨機(jī)斷裂成200 bp左右的小片段。以這些小片段為模板，利用隨機(jī)引物和逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第1鏈，隨后進(jìn)行cDNA第2鏈合成，得到黏性末端的雙鏈cDNA。隨后加入末端修復(fù)試劑，將其補(bǔ)成平末端，并在3’末端加上一個(gè)A堿基并連接測(cè)序接頭。分別利用文庫(kù)建立試劑盒和橋式擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行cDNA文庫(kù)構(gòu)建和擴(kuò)增，然后進(jìn)行上機(jī)測(cè)序（HiSeq 4000測(cè)序系統(tǒng)）。本研究中的cDNA構(gòu)建和測(cè)序服務(wù)由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司提供。

1.3.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)處理

利用SeqPrep（https://github.com/jstjohn/SeqPrep）軟件，對(duì)以上得到的原始讀段進(jìn)行過(guò)濾，去除接頭序列、低質(zhì)量的末端序列（質(zhì)量值小于20）和含N比例超過(guò)10%的序列，得到高質(zhì)量的有效讀段。羊肚菌無(wú)參考基因組，因此利用Trinity（http://trinityrnaseq.sourceforge.net/）軟件將上述有效讀段進(jìn)行從頭組裝，得到高質(zhì)量的轉(zhuǎn)錄本，取最長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄本作為該樣品的unigene進(jìn)行后續(xù)分析。

1.3.4 unigene功能注釋

得到1.3.3節(jié)序列后，利用Trinity軟件提供的基于開放閱讀框的預(yù)測(cè)流程，對(duì)組裝得到的所有轉(zhuǎn)錄本序列進(jìn)行基因預(yù)測(cè)，得到unigene。利用unigene序列信息分別與Nr、String、Swissprot、KEGG和Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得unigene的注釋信息。根據(jù)與String數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果，進(jìn)行真核生物直系同源（euKaryotic of orthologous groups，KOG）功能歸類。通過(guò)BLAST2GO（http://www.blast2go.com/b2ghome）對(duì)unigene進(jìn)行基因本體論（gene ontology，GO）注釋，并利用WEGO軟件進(jìn)行GO分類。在上述注釋分析過(guò)程中，以期望值小于10-5為成功注釋的閾值。通過(guò)HMMER3程序，以上述得到的unigene對(duì)應(yīng)的蛋白序列，比對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù)和dbCAN數(shù)據(jù)庫(kù)（http://csbl.bmb.uga.edu/dbCAN/07/15/2016），進(jìn)行蛋白家族的注釋和相關(guān)基因功能的挖掘。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量檢測(cè)

通過(guò)對(duì)梯棱羊肚菌成熟子實(shí)體樣品轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，共獲得66 562 198 條原始讀段，過(guò)濾掉接頭、低質(zhì)量和含N比例超過(guò)10%的序列后，得到63 939 094 條有效讀段，總測(cè)序堿基數(shù)為9 282 996 323。堿基質(zhì)量值（Q30，99.9%堿基正確率）為91.21%，表明測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量較高，可滿足后續(xù)分析要求（表1）。

表1 梯棱羊肚菌轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量檢測(cè)統(tǒng)計(jì)Table 1 Statistics and quality estimation of M. importuna transcriptome

2.2 轉(zhuǎn)錄組從頭組裝結(jié)果

表2 轉(zhuǎn)錄本和unigenes從頭組裝結(jié)果統(tǒng)計(jì)表Table 2 Summary of de novo assembly of transcripts and unigenes

羊肚菌子實(shí)體目前無(wú)參考基因組，利用Trinity軟件對(duì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行從頭組裝拼接，將所得有效讀段進(jìn)行從頭拼接和去冗余，共生成62 284 條轉(zhuǎn)錄本，平均長(zhǎng)度為3 232.2 bp。取最長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄本作為unigene，得到14 637 條unigene，平均長(zhǎng)度為2 248.9 bp（表2）。羊肚菌unigenes的轉(zhuǎn)錄本組裝居中長(zhǎng)度（N50）數(shù)值為3 292，遠(yuǎn)長(zhǎng)于多種已測(cè)序食用菌，如毛木耳[19]、茶樹菇[20]、茯苓[21]、香菇[22-23]、靈芝[24]、裂蹄木層孔菌[25]和白靈菇[26]。N50數(shù)值是無(wú)參考序列評(píng)估測(cè)度的重要指標(biāo)，一定程度上反映拼接所得序列的完整性。物種差異、測(cè)序平臺(tái)和拼接算法都可能會(huì)影響該值。在先前的食用菌轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究中，多采用Illumina HiSeq 2000或者454測(cè)序平臺(tái)，本研究所采用的測(cè)序平臺(tái)為較新的Illumina HiSeq 2500平臺(tái)，讀長(zhǎng)可達(dá)150 bp。因此，在保證較高測(cè)序質(zhì)量（Q30＞90%）的前提下，可得到更長(zhǎng)的測(cè)序長(zhǎng)度和更高的覆蓋度。

圖2 梯棱羊肚菌unigene長(zhǎng)度分布圖Fig. 2 Unigene length distribution profile of Morchella importuna

進(jìn)一步分析顯示，羊肚菌unigene長(zhǎng)度范圍在201～21 475 bp之間，長(zhǎng)度在1～400、401～800、801～1 000、2 001～2 400 bp和2 401～2 800 bp之間的unigene數(shù)目最多（圖2）。以上數(shù)據(jù)表明，本研究中轉(zhuǎn)錄組組裝質(zhì)量較高，為后續(xù)羊肚菌基因功能的分析提供了較為全面和可靠的序列信息。

2.3 unigene功能注釋及分類

通過(guò)BLAST程序?qū)nigene序列分別與Nr、String、Swissprot、KEGG和Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，各數(shù)據(jù)庫(kù)分別注釋到8 340、2 528、5 693、3 856、5 537 個(gè)unigene。有功能或代謝通路注釋的unigene總數(shù)為8 495 個(gè)，占全部unigene的58%，其中，1 545 個(gè)unigene在所有的數(shù)據(jù)庫(kù)中都被注釋，占總數(shù)的10.6%（圖3）。與大多數(shù)已經(jīng)測(cè)序的其他食用菌相比，羊肚菌轉(zhuǎn)錄組中得到注釋的unigene比例較低[19-27]。這可能由于羊肚菌屬于子囊菌亞門，而目前已測(cè)序和注釋的大多食用菌屬于擔(dān)子菌亞門，親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，參考信息較少。

圖3 各數(shù)據(jù)庫(kù)注釋到的unigene統(tǒng)計(jì)圖Fig. 3 Statistical results of annotated unigenes in various databases

2.3.1 同源物種比對(duì)分析

Nr數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果可以查看物種同源度情況，以及unigenes的功能信息。近緣物種比對(duì)結(jié)果表明，羊肚菌子實(shí)體unigene與黑松露（Tuber melanosporum）相似序列最多，為3 286 個(gè)，占據(jù)全部unigenes的39.3%，表明兩者同源度較高。其次為燒土火絲菌（Pyronema omphalodes），相似序列為1 202 個(gè)，占14.4%。以上2 個(gè)物種均屬于盤菌目，表明在已有遺傳數(shù)據(jù)的食用菌中，羊肚菌與之的親緣關(guān)系相對(duì)較近。

2.3.2 GO功能分類

GO數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)關(guān)于基因和基因產(chǎn)物的生物學(xué)術(shù)語(yǔ)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，通過(guò)該數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)，可對(duì)unigene的功能和分類進(jìn)行統(tǒng)一的描述。分析結(jié)果顯示，羊肚菌成熟子實(shí)體中共有3 994 個(gè)unigene得到GO功能注釋，歸類于生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能（圖4），較全面地對(duì)注釋基因的功能進(jìn)行了分類。生物學(xué)過(guò)程類別中，參與代謝過(guò)程、細(xì)胞內(nèi)過(guò)程和單組織過(guò)程的unigene所占比例最高，分別為66.9%（2 671 個(gè)）、59.8%（2 387 個(gè)）和47.9 %（1 912 個(gè)）。細(xì)胞組分類別中，參與細(xì)胞、細(xì)胞部分和細(xì)胞器構(gòu)成的unigene數(shù)量較多，前兩者均為43.8%（1 749 個(gè)），后者為32.4%（1 295 個(gè)）。分子功能類別中，催化活性、結(jié)合活性和轉(zhuǎn)運(yùn)活性的基因最多，分別占47.2%（2 153 個(gè)）、54.0%（1 884 個(gè)）和6.4%（256 個(gè)）。梯棱羊肚菌中的主要生物學(xué)過(guò)程與其他食用菌如毛木耳[19]、茶樹菇[20]、香菇[22]等相似，表明不同食用菌子實(shí)體的主要生理過(guò)程具有一定的相似性。

圖4 梯棱羊肚菌unigene的GO功能分類Fig. 4 GO classification of Morchella importuna unigenes

2.3.3 KOG功能分類

KOG數(shù)據(jù)庫(kù)為蛋白直系同源簇?cái)?shù)據(jù)庫(kù)，是基于蛋白質(zhì)序列的進(jìn)化關(guān)系構(gòu)建而成。該數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)結(jié)果顯示，羊肚菌子實(shí)體轉(zhuǎn)錄組中，共匹配上2 152 個(gè)unigene，根據(jù)蛋白質(zhì)功能劃分，歸屬于25 個(gè)家族（圖5）。其中，最主要的5 類依次為：翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)與合成（J，250 個(gè)，11.6%），翻譯后修飾、蛋白質(zhì)折疊和分子伴侶（O，218 個(gè)，10.1%），一般功能預(yù)測(cè)（R，168 個(gè)，7.8%），信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制（T，153 個(gè)，7.1%），能量生產(chǎn)和轉(zhuǎn)化（C，152 個(gè)，7.1%）。另外，與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝路徑相關(guān)的unigene較多，如碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝，分別為116、112 個(gè)和88 個(gè)。

GO和KOG功能分類分析結(jié)果表明，羊肚菌成熟子實(shí)體中具有旺盛的生理活動(dòng)，包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、能量代謝、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)等。結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)相關(guān)同源基因的注釋信息，可為羊肚菌采后生理生化過(guò)程、相關(guān)生物活性物質(zhì)的合成等提供重要的信息，為研究羊肚菌采后品質(zhì)變化規(guī)律和貯藏保鮮技術(shù)提供參考。

圖5 梯棱羊肚菌unigenes的KOG功能分類Fig. 5 KOG classification of Morchella importuna unigenes

2.3.4 KEGG通路注釋

圖6 梯棱羊肚菌unigenes的Top 10 KEGG代謝通路Fig. 6 Top 10 KEGG categories of Morchella importuna unigenes

為了分析羊肚菌unigene參與的代謝路徑，進(jìn)一步通過(guò)KEGG通路注釋分析，共注釋到了3 856 個(gè)unigene，分布于376 個(gè)代謝通路。其中，羊肚菌unigene參與最多的10 個(gè)代謝通路依次為：核糖體（199 個(gè)）、碳代謝（174 個(gè)）、氨基酸合成（152 個(gè)）、內(nèi)吞作用（120 個(gè)）、RNA運(yùn)輸（106 個(gè)）、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)（96 個(gè)）、嘌呤代謝（95 個(gè)）、淀粉和蔗糖代謝（91 個(gè)）、細(xì)胞周期（90 個(gè)）、剪切體（90 個(gè)）（圖6）。此外，在能量代謝、糖異生/糖酵解、脂質(zhì)代謝、輔助因子和維生素代謝等通路中也富集了較多的unigene。這些結(jié)果進(jìn)一步表明，羊肚菌成熟子實(shí)體具有旺盛的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝和能量代謝，預(yù)示著在采后貯藏過(guò)程中，羊肚菌子實(shí)體營(yíng)養(yǎng)組成和食用品質(zhì)可能會(huì)發(fā)生較大的變化。此外，羊肚菌unigene參與的主要代謝路徑與其他食用菌，如灰樹花[18]、茶樹菇[20]、靈芝[24]等存在一定的差異，這可能是物種差異、發(fā)育階段等因素引起的。

2.4 梯棱羊肚菌采后關(guān)鍵生理過(guò)程相關(guān)基因分析

在采后貯藏過(guò)程中，呼吸代謝與營(yíng)養(yǎng)風(fēng)味成分變化、多糖代謝與組織軟化、氧化還原酶系與褐變等對(duì)羊肚菌子實(shí)體的食用品質(zhì)具有重要影響，因此，本研究對(duì)這些過(guò)程中涉及到的關(guān)鍵基因進(jìn)行挖掘和分析。

2.4.1 呼吸作用相關(guān)基因分析

呼吸作用主要包括磷酸戊糖途徑、糖酵解、三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循環(huán)及氧化磷酸化等途徑，這些途徑的關(guān)鍵酶決定了呼吸作用的強(qiáng)度，且是各類營(yíng)養(yǎng)素（糖類、脂類、蛋白質(zhì)、核苷酸、維生素）代謝通路相互聯(lián)系的樞紐，亦是產(chǎn)生滋味和風(fēng)味物質(zhì)的重要途徑。

糖酵解是生物體內(nèi)葡萄糖代謝所必須經(jīng)過(guò)的共同階段。在羊肚菌成熟子實(shí)體轉(zhuǎn)錄組中，共鑒定到了79 個(gè)參與糖酵解的unigene，涵蓋了糖酵解幾乎所有關(guān)鍵酶，涉及該過(guò)程中的31 個(gè)催化反應(yīng)。TCA循環(huán)是糖類、脂類和氨基酸的最終代謝通路，亦是產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)和有機(jī)酸等的主要產(chǎn)生途徑，與羊肚菌子實(shí)體的風(fēng)味和滋味密切相關(guān)。在羊肚菌轉(zhuǎn)錄組中，共發(fā)現(xiàn)了30 個(gè)unigene參與TCA循環(huán)，包括該途徑中的所有關(guān)鍵酶，涉及16 個(gè)催化反應(yīng)。磷酸戊糖途徑是葡萄糖氧化降解的另一途徑，羊肚菌轉(zhuǎn)錄組中共鑒定到了24 個(gè)unigene參與該途徑，涉及12 個(gè)催化反應(yīng)，包括了氧化階段和非氧化階段的幾乎所有關(guān)鍵酶。氧化磷酸化發(fā)生在真核生物的線粒體中，是通過(guò)呼吸鏈將能量轉(zhuǎn)化為腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）的過(guò)程。在羊肚菌的轉(zhuǎn)錄組中，共發(fā)現(xiàn)79 個(gè)unigene參與該代謝路徑，其編碼的蛋白質(zhì)是羊肚菌呼吸鏈的重要組成。以上結(jié)果表明，羊肚菌呼吸代謝所需的關(guān)鍵代謝酶齊全，在遺傳水平闡釋了羊肚菌子實(shí)體呼吸代謝旺盛的原因。

2.4.2 碳水化合物活性酶與羊肚菌子實(shí)體的質(zhì)地及多糖合成

碳水化合物活性酶（carbohydrate active enzyme，CAZymes）是參與寡聚糖或多聚糖合成、水解和修飾的一類酶。CAZymes包括糖苷水解酶（glycosyl hydrolase，GH）、多糖裂解酶（pectate lyase，PL）、碳水化合物酯酶（carbohydrate esterase，CE）、輔助酶類（auxiliary activitie，AA）和糖苷轉(zhuǎn)移酶（glycosyl transferase，GT）。

羊肚菌子實(shí)體質(zhì)地脆嫩是其口感特點(diǎn)之一，但在采后貯藏過(guò)程中，子實(shí)體發(fā)生明顯的軟化現(xiàn)象，導(dǎo)致其食用品質(zhì)下降。軟化主要與子實(shí)體細(xì)胞壁的降解相關(guān)，主要涉及葡聚糖、幾丁質(zhì)、纖維素、半纖維素、果膠等的降解。因此，相關(guān)基因的挖掘?qū)ρ蚨蔷珊筚|(zhì)地的保持具有重要意義。GH可催化糖苷鍵水解，其主要底物為纖維素、半纖維素和果膠。在羊肚菌子實(shí)體轉(zhuǎn)錄組中，共有157 個(gè)unigene注釋到GH家族，分布于41 個(gè)亞家族；其中，GH61和GH5亞家族最多，分別為19 個(gè)和16 個(gè)，這兩個(gè)亞家族均主要為纖維素降解酶，在其他食用菌中的豐度也較高；其次為GH3（12 個(gè)）和GH43（11 個(gè)）亞家族成員，主要編碼纖維素酶和半纖維素酶。CE催化糖酯鍵水解，羊肚菌子實(shí)體轉(zhuǎn)錄組中共有36 個(gè)unigene注釋到CE，其中，CE1亞家族最多（20 個(gè)），占據(jù)了整個(gè)家族的55.6%，其編碼的酶類主要為纖維素酶和半纖維素酶。PL催化裂解含有糖醛酸的多聚糖鏈，共有22 個(gè)unigene注釋到PL，其中最多的是PL1亞家族（8 個(gè)），其次為PL3亞家族（7 個(gè)），這些基因編碼的酶類主要為果膠酶。AA主要包括木質(zhì)素降解酶和溶解性多糖單加氧酶，羊肚菌轉(zhuǎn)錄組中有43 個(gè)unigene注釋到AA，其中AA1亞家族18 個(gè)，AA3和AA5分別為15、10 個(gè)。

對(duì)上述催化多糖水解的CAZymes按照底物進(jìn)行分類，主要為幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶、果膠酶、纖維素酶等。其中，幾丁質(zhì)相關(guān)降解酶總計(jì)14 個(gè)，包括10 個(gè)幾丁質(zhì)酶、2 個(gè)內(nèi)切殼聚糖酶、1 個(gè)幾丁質(zhì)脫乙酰酶和1 個(gè)β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶。葡聚糖酶總計(jì)7 個(gè)，分別為6 個(gè)β-1,3-葡聚糖酶和1 個(gè)β-1,6-葡聚糖酶。果膠降解相關(guān)酶總計(jì)26 個(gè)，主要包括：3 個(gè)多聚半乳糖醛酸酶、2 個(gè)果膠甲酯酶、12 個(gè)果膠裂解酶、6 個(gè)鼠李半乳糖醛酸聚糖酶、2 個(gè)不飽和鼠李半乳糖醛酸聚糖水解酶和1 個(gè)鼠李半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶。此外，共鑒定到了33 個(gè)纖維素酶和5 個(gè)纖維二糖水解酶。這些酶的底物包括了羊肚菌子實(shí)體中的主要多糖類型，在碳源吸收與利用、子實(shí)體形態(tài)發(fā)育、采后組織軟化等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

此外，單糖是碳水化合物降解的末端產(chǎn)物，亦是多糖合成的基本單元，主要包括木糖、甘露糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖等。單糖的不同組合形成不同的糖苷鍵，需要不同的水解酶，因此半纖維素水解酶種類豐富。羊肚菌轉(zhuǎn)錄組中，鑒定到的木糖降解相關(guān)酶最多，為6 類38 個(gè)，主要包括：13 個(gè)木糖聚合物水解酶、3 個(gè)木聚糖酶、3 個(gè)乙酰木聚糖酯酶、2 個(gè)α-木糖苷酶等。甘露聚糖相關(guān)降解酶種類也較多，共4 類11 個(gè)，具體為5 個(gè)β-1,4-甘露聚糖酶切酶、3 個(gè)β-1,6-甘露聚糖酶、2 個(gè)甘露聚糖酶和1 個(gè)甘露糖基寡糖類葡糖苷酶。阿拉伯聚糖的相關(guān)降解酶鑒定到了5 類11 個(gè)，分別為4 個(gè)α-L-阿拉伯葡聚糖酶、3 個(gè)α-1,5-L-阿拉伯聚糖內(nèi)切酶、2 個(gè)α-N-阿拉伯葡聚糖酶、1 個(gè)阿拉伯糖苷酶和1 個(gè)β-L-阿拉伯葡聚糖酶。此外，鑒定到了3 個(gè)以半乳糖聚合物為底物的降解酶，分別為2 個(gè)外切β-1,3-半乳聚糖酶和1 個(gè)內(nèi)切β-1,4-半乳聚糖酶。除了以上種類的半纖維素酶，還鑒定到了1 個(gè)細(xì)胞壁酸性海藻糖酶。

與降解相對(duì)應(yīng)，GT催化糖基轉(zhuǎn)移，主要參與多糖合成。羊肚菌多糖具有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等多種功效，是其影響羊肚菌食用品質(zhì)和功能活性的重要組分。羊肚菌轉(zhuǎn)錄組中注釋到GT的unigene共有51 個(gè)，分布在9 個(gè)亞家族中，其中GT2亞家族成員最多，為13 個(gè)。發(fā)現(xiàn)的這些GT酶對(duì)調(diào)控羊肚菌多糖合成具有重要意義。

2.4.3 酶促氧化褐變基因分析

酶促氧化褐變是羊肚菌采后貯藏及加工過(guò)程中影響其食用品質(zhì)和商品價(jià)值的另一重要因素。目前，羊肚菌的酶促褐變機(jī)制還不明確，本研究對(duì)褐變相關(guān)的unigene進(jìn)行了分析和挖掘。先前的研究表明，影響褐變的酶主要有多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）、過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）和脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）[28-29]。同時(shí)，活性氧清除酶類對(duì)褐變具有抑制作用，主要包括過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）和超氧化酶歧化酶（superoxide dismutase，SOD）。

PPO是引起其酶促褐變的主要酶類，其催化酚類物質(zhì)氧化成醌，進(jìn)而生成黑色素導(dǎo)致褐變。在微生物中，PPO主要包括酪氨酸酶、漆酶[30]。本研究在羊肚菌轉(zhuǎn)錄組unigene中鑒定出了7 個(gè)酪氨酸酶和3 個(gè)漆酶。POD通過(guò)催化酚類物質(zhì)的氧化和聚合，導(dǎo)致褐變[29]，羊肚菌轉(zhuǎn)錄組中共鑒定到了11 個(gè)POD和2 個(gè)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶。LOX在特定條件下，能氧化膜脂進(jìn)而破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，使得PPO與酚類物質(zhì)接觸而發(fā)生酶促褐變，羊肚菌轉(zhuǎn)錄組中該類酶鑒定到了2 個(gè)，分別是亞油酸脂氧合酶和亞油酸雙加氧酶。上述氧化酶類可能是導(dǎo)致羊肚菌子實(shí)體采后酶促氧化褐變的關(guān)鍵酶。

與數(shù)量較多的氧化褐變酶類相比，活性氧清除酶類數(shù)量較少，SOD和CAT僅分別鑒定到了7 個(gè)和5 個(gè)。以上結(jié)果表明，羊肚菌成熟子實(shí)體中PPO和POD種類和數(shù)量均較多，為后期深入研究羊肚菌的酶促褐變機(jī)制提供了分子依據(jù)。

3 結(jié) 論

本研究采用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)羊肚菌成熟子實(shí)體的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行深度測(cè)序，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝、注釋和分析。結(jié)果顯示，羊肚菌轉(zhuǎn)錄組包含14 637 條unigene，其中8 495 條unigene得到注釋。注釋基因的GO和KOG功能分類、以及KEGG通路注釋結(jié)果，為系統(tǒng)和深入理解羊肚菌主要生理生化過(guò)程提供了重要線索。此外，分析和挖掘了與呼吸作用、碳水化合物合成與代謝、多酚氧化還原等相關(guān)的unigene，這些基因所編碼的酶類在羊肚菌營(yíng)養(yǎng)成分合成與代謝、風(fēng)味與滋味物質(zhì)產(chǎn)生、多糖代謝與組織軟化、酶促氧化褐變等過(guò)程中具有重要作用。該研究為探究羊肚菌生理、生化過(guò)程相關(guān)基因功能及調(diào)控等提供了重要信息，亦為深入研究羊肚菌遺傳育種、栽培技術(shù)、采后生理、貯藏保鮮等相關(guān)技術(shù)提供了基礎(chǔ)。