杏鮑菇分離蛋白和清蛋白的理化性質(zhì)及功能分析

魏君慧，薛 媛，馮 莉，張若曦，王小晶，雷宏杰*，徐懷德*

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

杏鮑菇（Pleurotus eryngii（DC. et Fr.）Quel.）屬傘菌目側(cè)耳科側(cè)耳屬菌類，又名刺芹側(cè)耳[1]。1977年實現(xiàn)了商業(yè)性栽培，是近年來開發(fā)栽培成功的珍稀食藥兩用食用菌新品種[2]。我國的杏鮑菇栽培起步較晚，但發(fā)展快，目前已成為世界上杏鮑菇產(chǎn)量最大的國家，且生產(chǎn)量逐年增長，產(chǎn)地集中在河南、山東、黑龍江、福建、江蘇、浙江等地區(qū)[3]。我國杏鮑菇主要用作鮮食，市面上主要以杏鮑菇粉、醬、脯、飲料、脆片[2]等初級加工產(chǎn)品為主，精深加工產(chǎn)品較少。因此，需要進一步開發(fā)杏鮑菇精深加工系列產(chǎn)品，開拓杏鮑菇產(chǎn)品市場。

杏鮑菇子實體色澤乳白、菌肉肥厚、質(zhì)地脆嫩、兼具杏仁香味和鮑魚風味，素有“平菇王”的美譽[4]。研究表明，杏鮑菇不僅富含多糖、蛋白、多酚、膳食纖維等營養(yǎng)成分，而且具有抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、保肝和降血脂[5-8]等多種藥理作用，因其獨特的風味和豐富的營養(yǎng)價值，備受消費者青睞。杏鮑菇中蛋白質(zhì)含量較高，約占其干質(zhì)量的18.61%[9]，明顯高于蔬菜，可與肉、蛋和豆類媲美。近年來，國內(nèi)外對杏鮑菇多糖的研究較多，主要表現(xiàn)在多糖的提取純化、結(jié)構(gòu)表征及生物活性等方面[7,10-11]，而對杏鮑菇蛋白的研究主要集中在提取[12-14]和酶解[15]方面，關(guān)于杏鮑菇蛋白的理化性質(zhì)及功能特性的研究，國內(nèi)外鮮有報道。

本研究以杏鮑菇為原料，對杏鮑菇分離蛋白（Pleurotus eryngii protein isolate，PEPI）和杏鮑菇清蛋白（Pleurotus eryngii albumin，PEA）的理化性質(zhì)、功能特性進行研究，為杏鮑菇的綜合利用以及相關(guān)蛋白產(chǎn)品的進一步開發(fā)應(yīng)用提供實驗支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮杏鮑菇購自陜西楊凌，樣品切片后經(jīng)40 ℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量、60 目粉碎過篩后置于4 ℃冷藏備用。

三羥甲基氨基甲烷（trihydroxymethyl aminomethane，Tris）、甘氨酸 北京索萊寶生物科技有限公司；考馬斯亮藍G-250、8-苯胺基-1-萘磺酸鈉（8-aniline-1-naphthalenesulfonate sodium，ANS）、5,5’-二硫代-2-硝基苯甲酸（5,5’-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）美國Sigma公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

GL-10MD大容量高速冷凍離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司；K9840型自動凱氏定氮儀 濟南海能儀器有限公司；UV-1780型紫外-可見分光光度計島津儀器（蘇州）有限公司；FD5-2.5 E型凍干機 金西盟（北京）儀器有限公司；S-4800場發(fā)射掃描電鏡日本日立公司；Vetex70傅里葉變換紅外光譜儀德國布魯克公司；Q2000差示掃描量熱儀（differential scanning calorimeter，DSC） 美國Waters公司；LS55熒光分光光度計 美國PE公司。

1.3 方法

1.3.1 杏鮑菇基本成分測定

蛋白質(zhì)測定：GB/T 15673—2009《食用菌中粗蛋白含量的測定》；水分測定：GB/T 5009.3—2010《食品中水分的測定》；灰分測定：GB/T 12532—2008《食用菌灰分測定》；粗脂肪測定：GB/T 15674—2009《食用菌中粗脂肪含量的測定》；粗纖維測定：GB/T 5009.10—2003《植物類食品中粗纖維的測定》；總糖測定：GB/T 15672—2009《食用菌中總糖含量的測定》。

1.3.2 杏鮑菇蛋白組分分離

參照毛曉英[16]Osborne分級提取的流程，依次用10 倍體積蒸餾水、8 倍體積2% NaCl溶液、8 倍體積75%乙醇溶液和8 倍體積0.2 mol/L NaOH溶液提取杏鮑菇粉中的PEA、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白。

1.3.3 PEPI和PEA的制備

1.3.3.1 PEPI的制備

參照劉慶等[12]優(yōu)化的堿溶酸沉法制備PEPI。具體操作如下：將杏鮑菇粉與去離子水以料液比1∶12（g/mL）混合，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值至10.0，30 ℃浸提30 min后，4 000 r/min離心20 min。收集上清液，殘渣復(fù)提1 次，合并2 次上清液，用1 mol/L HCl溶液調(diào)至PEPI等電點3.6，靜置30 min后4 000 r/min離心20 min，收集沉淀，水洗至中性后透析48 h，真空冷凍干燥得到PEPI。

1.3.3.2 PEA的制備

稱取一定量的杏鮑菇粉末，加入10 倍體積蒸餾水，40 ℃攪拌2 h后，4 000 r/min離心20 min。將上清液pH值調(diào)至等電點4.0，緩慢加入一定量固體硫酸銨，使溶液中硫酸銨飽和度達到45%，4 ℃靜置0.5 h，6 000 r/min離心15min；上清液繼續(xù)追加硫酸銨，使溶液硫酸銨飽和度達到80%，4 ℃靜置0.5 h，6 000 r/min離心15 min。合并2 次鹽析得到的蛋白沉淀，水洗至中性后透析。過量的10% BaCl2溶液檢測透析效果，至無白色沉淀生成，即水中不再含有，真空冷凍干燥得PEA。

1.3.4 PEPI和PEA氨基酸組成分析

精確稱取一定量的樣品，用6 mol/L的HCl溶液密封水解24 h，采用氨基酸分析儀按照GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測定》方法測定氨基酸含量（除色氨酸外）。色氨酸測定時用堿水解法按照GB/T 15400—1994《飼料中色氨酸測定方法 分光光度法》方法測定。

1.3.5 PEPI和PEA表面疏水性測定

采用ANS熒光探針法測定[17]。配制1.0 mg/mL的蛋白溶液，并用磷酸緩沖液（20 mmol/L，pH 7.4）稀釋，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)量濃度為0.1～1.0 mg/mL，取稀釋后的蛋白溶液4.0 mL，加入20 μL的8 mmol/L ANS溶液，振蕩，避光反應(yīng)10 min后搖勻，采用LS55熒光分光光度計測定樣品的熒光強度。以蛋白質(zhì)量濃度為橫坐標，熒光強度為縱坐標，初始階段的曲線斜率為表面疏水性。

1.3.6 PEPI和PEA巰基和二硫鍵含量測定[18]

游離巰基含量的測定：準確量取2.0 mL蛋白樣品溶液，加入5.0 mL Tris-Gly緩沖液（0.086 mol/L Tris，0.09 mol/L Gly，4 mmol/L Na2EDTA，pH 8.0），再加入100 μL的Ellman試劑（10 mmol/L）。渦旋振蕩混合均勻，25 ℃保溫反應(yīng)15 min后，在412 nm波長處測定吸光度。以不加Ellman試劑的溶液作為對照，同時以Tris-HCl（pH 8.0）代替樣品測定空白值。每個樣品測定3 次取平均值。

總巰基含量的測定：準確量取1.0 mL蛋白樣品溶液，加入4.0 mL Tris-Gly-10 mol/L Urea溶液，再加入50 μL的Ellman試劑（10 mmol/L）。渦旋振蕩混合均勻，25 ℃保溫反應(yīng)15 min后，在412 nm波長處測定吸光度。以不加Ellman試劑的溶液作為對照，同時測定空白值。每個樣品測定3 次取平均值。巰基含量計算見式（1）：

式中：73.53=106/（1.36×104），1.36×104為Ellman試劑的摩爾消光系數(shù)/（L/（mol·cm））；A412nm=加Ellman試劑時樣品溶液吸光度-不加Ellman試劑時樣品溶液吸光度；D為稀釋系數(shù)；c為樣品蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

二硫鍵含量按照式（2）進行計算：

1.3.7 PEPI和PEA熱穩(wěn)定性測定

通過DSC分析蛋白樣品的熱變性溫度和焓值。精確稱取蛋白樣品2 mg左右并記錄質(zhì)量。將樣品均勻平鋪在鋁制坩堝中密封，以空鋁盒作為空白對照。樣品室的氮氣流量為20 L/min，掃描溫度范圍為20～150℃，升溫速率為10 ℃/min。

1.3.8 PEPI和PEA的溶解性測定[19]

精確稱取50 mg蛋白樣品分散在25 mL蒸餾水中，用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH值為2.0～10.0，用蒸餾水補加至30 mL，室溫振蕩20 min后，4 000 r/min離心20 min，上清液采用Bradford法測定蛋白含量，根據(jù)式（3）計算蛋白溶解性：

1.3.9 PEPI和PEA持水性和持油性測定[20]

準確稱取0.10 g蛋白樣品（大豆油）于離心管中，加入5.0 mL去離子水?；靹蚝箪o置30 min，4 000 r/min離心20 min，測定上清液體積。體積減少量即為樣品吸水/吸油量，持水性/持油性用每克樣品吸附水/油的體積表示。

1.3.10 PEPI和PEA起泡性和泡沫穩(wěn)定性測定[21]

分別配制1.0%的蛋白溶液15 mL，調(diào)節(jié)溶液pH值為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0，體積記為V0。10 000 r/min均質(zhì)2 min，室溫下測定總體積V1，靜置10 min后再次測定總體積V2。起泡性和泡沫穩(wěn)定性分別利用式（4）、（5）進行計算：

1.3.11 PEPI和PEA乳化性和乳化穩(wěn)定性測定[22]

分別配制0.10%蛋白溶液9.0 mL，調(diào)節(jié)pH值為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0，再加3.0 mL大豆油混合，10 000 r/min均質(zhì)2 min。立即從底部取50 μL乳狀液，加入5 mL 0.1%的十二烷基硫酸鈉溶液混勻，在500 nm波長處測定吸光度，記為A0。將乳化液靜置10 min后，再次用上述方法測定吸光度，記為A10。根據(jù)式（6）、（7）分別計算乳化性和乳化穩(wěn)定性：

式中：D為稀釋倍數(shù)；Φ為油相的體積分數(shù)/%；L為光程（1 cm）；c為乳濁液形成前蛋白溶液中的蛋白質(zhì)量濃度/（g/mL）；t為時間/min。

1.3.12 PEPI和PEA傅里葉變換紅外光譜分析

采用溴化鉀壓片法測定。精確稱取2.0 mg蛋白樣品和200.0 mg溴化鉀，研磨混合均勻后壓制成片。室溫下以空氣為背景，光譜測量范圍為4 000～400 cm-1，光譜分辨率為4 cm-1，信號掃描累加32 次。利用PeakFit v4.12軟件對譜圖酰胺I帶1 600～1 700 cm-1進行分析。對曲線依次進行基線校正、平滑處理、Gaussian去卷積、二階導(dǎo)數(shù)擬合等數(shù)據(jù)處理，計算擬合圖譜中各子峰積分面積得到二級結(jié)構(gòu)的相對含量。

1.3.13 PEPI和PEA掃描電鏡分析

將蛋白過100 目篩，取篩下物用雙面膠黏在樣品座上。將樣品座置于離子濺射儀中，在樣品表面蒸鍍1 層10～20 nm厚的鉑金膜，調(diào)節(jié)電鏡至最佳拍攝視野，并放大倍數(shù)，觀察并拍攝照片。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 杏鮑菇的基本組成成分及蛋白組分分析

杏鮑菇水分、粗纖維、總糖以及灰分質(zhì)量分數(shù)（以干質(zhì)量計）分別為（7.23±0.06）%、（7.66±0.17）%、（34.98±0.66）%、（4.99±0.04）%；蛋白質(zhì)量分數(shù)為（17.57±0.90）%，高于云耳（Auricularia auricula）（10.3%）、銀耳（Tremella fuciformis）（9.6%）及巖耳（Umbilicari）（9.0%）的蛋白質(zhì)量分數(shù)[23]；粗脂肪質(zhì)量分數(shù)僅為（0.76±0.02）%，說明杏鮑菇是一種高蛋白低脂肪的營養(yǎng)食品，可作為一種潛在的蛋白來源。

Osborne法分級分離PEPI結(jié)果表明，杏鮑菇中的PEA、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白分別占總蛋白的81.12%、5.38%、4.03%和9.47%。PEPI主要以PEA為主，谷蛋白、球蛋白和醇溶蛋白的含量較低。

2.2 PEPI和PEA氨基酸組成及營養(yǎng)評價

表1 PEPI、PEA和乳清蛋白、大豆蛋白的氨基酸組成和必需氨基酸評價比較Table 1 Comparison of amino acid composition and essential amino acids of PEPI, PEA, whey protein and soy protein

由表1可知，天冬氨酸和谷氨酸均為酸性氨基酸，是PEPI和PEA氨基酸的主要成分，分別占12.84%、14.60%和10.91%、9.52%，與大多數(shù)貯藏蛋白相一致[24]。PEPI和PEA含有人體所必需的8 種氨基酸，必需氨基酸占總氨基酸的比例分別為40.80%和40.51%，略低于乳清蛋白（44.10%）[25]；必需氨基酸與非必需氨基酸的比值分別為0.689 2和0.680 8，高于大豆蛋白（0.480 4）[21]，均符合FAO/WHO提出的理想蛋白質(zhì)規(guī)定（40%和0.6）[26]，表明杏鮑菇蛋白可作為一種優(yōu)質(zhì)的蛋白來源。從必需氨基酸評價分析，PEPI和PEA的第1限制氨基酸分別為色氨酸和含硫氨基酸；第2限制氨基酸分別為含硫氨基酸和亮氨酸；賴氨酸是PEPI和PEA的第3限制氨基酸。PEPI和PEA中蘇氨酸、異亮氨酸、賴氨酸等必需氨基酸含量高于FAO/WHO的推薦值。因此PEPI和PEA可作為一種營養(yǎng)功能成分添加到食品中以提高食品品質(zhì)。

2.3 PEPI和PEA表面疏水性、巰基和二硫鍵含量結(jié)果

表面疏水性是測定蛋白質(zhì)表面存在的疏水基團數(shù)量的指標，對評價蛋白分子的構(gòu)象以及蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和功能性質(zhì)起關(guān)鍵作用[27]。如表2所示，PEA的表面疏水性（265.25）顯著高于PEPI（164.27）（P＜0.01），與之前研究報道的白木通種子（Akebia trifoliata var.australis）的結(jié)果相似[28]。表面疏水性有差異可能是由于蛋白質(zhì)的氨基酸組成、三級構(gòu)象不同所致。此外，蛋白在溶液中通過疏水相互作用或二硫鍵聚集發(fā)生折疊，降低表面疏水性[28]。

巰基和二硫鍵是維系蛋白空間結(jié)構(gòu)的重要化學(xué)鍵。由表2可知，PEPI的總巰基含量（67.80 μmol/g）高于PEA（61.53 μmol/g）（P＜0.05），表明PEPI更易與水結(jié)合。二硫鍵是共價鍵，能使肽鏈的空間結(jié)構(gòu)更加緊密，與含硫氨基酸含量有關(guān)。PEPI的二硫鍵含量比PEA高，可能是PEA含硫氨基酸含量低，導(dǎo)致其二硫鍵含量低。二硫鍵通常被認為與蛋白的熱穩(wěn)定性相關(guān)，二硫鍵含量越高，打破二硫鍵使蛋白伸展所需的能量大，熱變性溫度也越高[29]。因此二硫鍵含量高的蛋白，表明其熱穩(wěn)定性好，結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。PEPI的二硫鍵含量高，表明其在食品加工熱處理時穩(wěn)定性高。

表2 PEPI和PEA的表面疏水性、巰基和二硫鍵含量Table 2 Surface hydrophobicity, and sulfydryl and disulfide bond contents of PEPI and PEA

2.4 PEPI和PEA的熱穩(wěn)定性分析

蛋白在加熱過程中抵制聚集的能力是衡量其熱穩(wěn)定性的標準。蛋白的熱穩(wěn)定性用變性溫度T和誘導(dǎo)變性所需的能量變性焓ΔH表示。DSC曲線中最大峰對應(yīng)溫度和峰面積即為T和ΔH。如圖1所示，PEA的變性溫度（100.98 ℃）低于PEPI（108.27 ℃），其可能原因是PEA二硫鍵含量較低。ΔH反映蛋白分子的疏水性和親水性以及聚集程度，與蛋白二級結(jié)構(gòu)的有序含量有關(guān)，吸熱峰表示蛋白分子由于加熱經(jīng)歷解折疊過程[28]。PEA的熱變性焓（65.34 J/g）小于PEPI（86.44 J/g），推斷其β-折疊有序結(jié)構(gòu)所占比例較低，分子相對舒展，分子內(nèi)部疏水性殘基較多。此外，峰的寬窄與蛋白變性轉(zhuǎn)變有關(guān)，峰寬表示變性時間長，熱變性協(xié)同性差[29]，表明PEPI和PEA可能是由不同亞基組成的一類蛋白。

圖1 PEPI和PEA的DSC圖Fig. 1 DSC graphs of PEPI and PEA

2.5 PEPI和PEA的溶解性結(jié)果

圖2 PEPI和PEA溶解性Fig. 2 Solubility of PEPI and PEA

如圖2所示，隨著pH值的增大，PEPI和PEA的溶解性先降低后升高，在pH值為4時蛋白分子表面正負電荷相等，處于中性狀態(tài)，溶解性最??；當pH值小于或大于4時，蛋白分子表面出現(xiàn)較多的正或負電荷，靜電斥力作用和蛋白離子水合作用增加，溶解性升高。這些結(jié)果與之前雞腿菇蛋白、黑木耳蛋白及羊肚菌蛋白研究結(jié)果類似[30-32]。當pH值為7時，PEPI和PEA的溶解性均小于大豆蛋白（36.46%）和雞蛋蛋白（91.39%）[33]。此外，pH值在2～3之間時，PEPI溶解性較低，可能與其等電點較低有關(guān)。當pH值大于3時，PEPI的溶解性較高，這與其總巰基含量較高、表面疏水性較低相符。由于普通蛋白飲料的pH值為6.8～7.0，因此PEPI在蛋白飲料生產(chǎn)中的應(yīng)用性優(yōu)于PEA。

2.6 PEPI和PEA的持水性和持油性分析

蛋白與水的結(jié)合能力受氨基酸組成、蛋白構(gòu)象、表面極性和疏水性比值的影響[24]。PEPI的持水性（3.58 mL/g）顯著高于PEA（1.64 mL/g）（P＜0.05），PEPI持水性較大的原因可能是極性氨基酸殘基較多，與水分子的作用較強。當?shù)鞍椎某炙詾?.49～4.71 mL/g 時，較適合用于如湯、肉汁等黏性食品及焙烤食品[18]。由此可見，PEPI和PEA均可作為黏性食品中的重要成分。

持油性是蛋白質(zhì)的非極性側(cè)鏈對油脂的結(jié)合，用來衡量蛋白的吸油能力。PEPI的持油性（8.36 mL/g）顯著高于PEA（5.59 mL/g）（P＜0.05），PEPI和PEA持油性不同可能與其表觀結(jié)構(gòu)不同有關(guān)。

2.7 PEPI和PEA的起泡性和泡沫穩(wěn)定性分析

起泡性是指蛋白溶液在攪打過程中產(chǎn)生泡沫的能力；泡沫穩(wěn)定性表示蛋白具有足夠的黏度以維持泡沫并防止破裂和聚結(jié)的能力。由圖3A可知，在pH 2～10范圍內(nèi)，PEPI和PEA的起泡性先減小后增大，pH值為4時，PEPI和PEA的起泡性最低。這可能是由于在等電點時，蛋白溶解度低，蛋白沉淀較多，導(dǎo)致結(jié)合空氣-水界面的蛋白不足，蛋白起泡性較小。隨pH值的升高，蛋白質(zhì)的凈電荷增加，削弱了疏水性相互作用，增加了蛋白的柔韌性，起泡性得到提高。此外，PEPI的起泡性高于PEA，可能是因為PEPI在水中易溶，并且與水的作用增強后會提高蛋白的伸展性，氣泡形成能力提升[34]。除pH值為8外，PEA的泡沫穩(wěn)定性高于PEPI（圖3B）。這可能是因為當pH值為8時，PEPI的蛋白濃度較高，蛋白質(zhì)間分子作用較強，溶液黏度較大，因而呈現(xiàn)出較好的泡沫穩(wěn)定性。當pH值較高時，泡沫穩(wěn)定性降低可能是由于帶相同負電蛋白分子間斥力的作用[30]。蛋白溶解性、柔韌性、膜的氣體滲透性和強度以及泡沫的流變性能均會影響泡沫穩(wěn)定性[35]?？傊?，PEPI可作為一種發(fā)泡成分添加到不同食品中。

圖3 不同pH值條件下PEPI和PEA的起泡性（A）和泡沫穩(wěn)定性（B）Fig. 3 Foaming capacity (A) and foam stability (B) of PEPI and PEA at different pH levels

2.8 PEPI和PEA的乳化性和乳化穩(wěn)定性

乳化性表示蛋白乳液的形成能力，乳化穩(wěn)定性是蛋白在規(guī)定時間內(nèi)形成穩(wěn)定乳狀液能力的量度[18]。如圖4A所示，在PEPI和PEA等電點處，凈電荷幾乎為零，其膠體作用較弱，乳化性較小，分別為31.52 m2/g和51.79 m2/g；除pH 4外，PEPI乳化性相比PEA較高，蛋白乳化性與pH值的關(guān)系跟溶解度與pH值關(guān)系相似。有研究表明[24]，乳化性可能受溶解度和表面疏水性單獨或交互作用的影響。此外，蛋白表面疏水性的增強和蛋白表面親水-疏水的平衡可以抑制蛋白與水的相互作用，提高蛋白的柔韌性，使蛋白擴散到空氣-水界面速率更快[24]。圖4B顯示PEPI和PEA乳化穩(wěn)定性隨pH值升高呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢。在pH值接近等電點時，蛋白質(zhì)的排斥力弱，有利于液滴的乳化聚合，乳化穩(wěn)定性差。相反，當油滴周圍電荷很高時，靜電斥力有助于維持液滴穩(wěn)定和延緩乳液聚合[36]。在食品加工過程中，常出現(xiàn)乳狀液失穩(wěn)的問題，因此乳化穩(wěn)定性較高的PEPI在食品行業(yè)中有較大的優(yōu)勢[28]。

圖4 不同pH值條件下PEPI和PEA的乳化性（A）和乳化穩(wěn)定性（B）Fig. 4 Emulsifying capacity (A) and emulsion stability (B) of PEPI and PEA at different pH levels

2.9 PEPI和PEA的傅里葉變換紅外光譜分析

由圖5可知，PEPI和PEA的光譜相似，有幾個特征峰發(fā)生了變化，說明PEPI和PEA的氨基酸殘基不同。蛋白質(zhì)在紅外區(qū)有若干特征吸收帶，其中酰胺I帶（1 600～1 700 cm-1）的譜峰主要與氨基酸殘基的C＝O伸縮振動有關(guān)，反映α-螺旋、β-折疊、無規(guī)則卷曲和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)等信息[37]。

利用PeakFit v4.12軟件對酰胺I帶分析可知，PEPI二級結(jié)構(gòu)主要由β-折疊和β-轉(zhuǎn)角組成，相對含量分別為34.17%和35.21%。α-螺旋相對含量為22.39%，無規(guī)則卷曲最少，為8.23%。PEA的β-轉(zhuǎn)角相對含量最高（39.44%），其次是β-折疊（26.66%），α-螺旋（18.75%）和無規(guī)則卷曲（15.14%）。PEPI有序結(jié)構(gòu)（α-螺旋＋β-折疊）相對含量（56.55%）高于PEA（45.42%），表明其整個分子構(gòu)象有序，二級結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定。PEPI的β-折疊較高，需要解折疊的能量大，與其熱變性焓ΔH值較高相吻合。

圖5 PEPI和PEA的傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 5 FTIR spectra of PEPI and PEA

2.10 PEPI和PEA的掃描電鏡分析

利用掃描電鏡對蛋白樣品表面形貌進行二次電子信號成像。蛋白的表觀形態(tài)主要影響其功能特性，如持水持油性、乳化性能等。由圖6可知，PEA表面呈山脊狀，局部有空洞，結(jié)構(gòu)較為緊密；PEPI表面多孔，且孔徑較小，呈蜂巢狀。蜂巢結(jié)構(gòu)具有良好的物理截留作用，主要改善蛋白的持水和持油性[38]。由此推斷，PEPI的持水和持油性較好可能與其結(jié)構(gòu)有關(guān)。

圖6 PEA（a）和PEPI（b）的掃描電鏡圖Fig. 6 Scanning electron micrographs of PEA (a) and PEPI (b)

3 結(jié) 論

杏鮑菇干粉中蛋白質(zhì)量分數(shù)為17.57%，PEA占總分離蛋白組分的81.12%。PEPI和PEA中均含18 種氨基酸，其中天冬氨酸和谷氨酸是主要氨基酸，蘇氨酸、異亮氨酸、賴氨酸等必需氨基酸含量高于FAO/WHO的推薦值。與PEPI相比，PEA表面疏水性較高，總巰基含量、溶解性和持水性較低；PEPI的含硫氨基酸含量較多，二硫鍵含量高，熱變性溫度高，有序結(jié)構(gòu)（α-螺旋＋β-折疊）含量高于PEA，二級結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定。PEPI和PEA的溶解性、起泡性、泡沫穩(wěn)定性、乳化性及乳化穩(wěn)定性隨pH值變化均呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢。PEPI呈蜂巢結(jié)構(gòu)，物理截留作用較好，持油性高于PEA。在中性環(huán)境下，PEPI相比PEA具有較好的理化和功能特性。本研究結(jié)果為杏鮑菇蛋白產(chǎn)品開發(fā)及在食品加工中的應(yīng)用提供實驗支撐。