亞硝化模擬體系中油脂對(duì)N-亞硝胺形成的影響

熊鳳嬌，馬儷珍,*，王 洋，梁麗雅，楊 華,4，李雙燕

（1.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，國(guó)家大宗淡水魚加工技術(shù)研發(fā)分中心，天津市水產(chǎn)品加工及質(zhì)量安全校企協(xié)同創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室，天津 300384；2.天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384；3.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術(shù)工程中心，天津 300384；4.天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 300384）

在肉制品的加工過(guò)程中加入亞硝酸鹽不僅可以改善產(chǎn)品的風(fēng)味、口感及色澤，對(duì)肉毒梭狀芽孢桿菌的生長(zhǎng)繁殖也能起到一定的抑制作用[1]。然而肉制品中存在的亞硝酸鹽也能與胺類物質(zhì)經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)生成致癌物N-亞硝胺[2-6]。Jakszyn等[7]研究表明，亞硝酸鹽及N-亞硝胺攝入量與胃癌、食道癌之間呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)關(guān)系。影響N-亞硝胺形成的因素有很多，包括亞硝酸鹽的含量、二級(jí)胺的種類和濃度、溫度、pH值、反應(yīng)時(shí)間等。亞硝酸鹽作為N-亞硝胺形成的底物，能在亞硝化反應(yīng)中為N-亞硝胺提供亞硝基，因此N-亞硝胺的生成量隨著反應(yīng)體系中亞硝酸鹽濃度的增加有上升的趨勢(shì)[8-9]；且當(dāng)亞硝酸鹽與二級(jí)胺類底物濃度比為2∶1時(shí)，N-亞硝胺的生成量最大[10]；因?yàn)镹-亞硝胺的形成過(guò)程符合熱反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程，故在一定范圍內(nèi)，溫度越高，N-亞硝胺的生成量越多[11]；酸性條件可促進(jìn)亞硝酸鹽的解離以及NOx的形成，故N-亞硝胺更易在酸性條件下形成[12]；反應(yīng)時(shí)間也影響著N-亞硝胺的形成，研究發(fā)現(xiàn)在反應(yīng)開始3 h后，N-二甲基亞硝胺（N-nitrosodimethylamine，NDMA）的生成量明顯增大[11]。研究發(fā)現(xiàn)，脂肪也是影響亞硝化反應(yīng)的重要參數(shù)，如油炸培根的脂肪組織中N-亞硝胺的含量遠(yuǎn)高于瘦肉或全肉，分析其原因可能是非極性脂質(zhì)為N-亞硝胺的形成提供了有利條件[13]；Yurchenko等報(bào)道，含有脂肪的羊肉中N-亞硝胺含量高于純瘦肉中N-亞硝胺的含量[14]；另有研究表明，培根加熱后流出的油脂具有亞硝化能力[15]。以上報(bào)道均表明脂肪在N-亞硝胺的形成過(guò)程中有可能起到促進(jìn)作用。然而，關(guān)于脂肪的種類和比例對(duì)亞硝化反應(yīng)的影響卻鮮有報(bào)道。

N-亞硝胺的種類較多，本實(shí)驗(yàn)首先以肉制品中常檢測(cè)到的2 種N-亞硝胺，即NDMA、N-二乙基亞硝胺（N-nitrosodiethylamine，NDEA）為研究對(duì)象，提前將二甲胺鹽酸鹽（di-methylamine hydrochlorid，DMA·HCl）、二乙胺鹽酸鹽（di-ethylamine hydrochloride，DEA·HCl）分別與亞硝酸鹽作為反應(yīng)底物加入到亞硝化反應(yīng)體系中，再加入不同種類（花生油、葵花籽油、亞麻籽油）和比例（0%～40%）的油脂，研究脂肪的種類及比例對(duì)N-亞硝胺（NDMA、NDEA）生成量的影響。并進(jìn)一步研究亞硝化反應(yīng)體系中某一種油脂存在條件下，底物濃度比、pH值、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間對(duì)NDMA、NDEA和N-亞硝基吡咯烷（N-nitrosopyrrolidine，NPYR）形成的影響，為肉制品加工過(guò)程中各種工藝參數(shù)的確定以及進(jìn)一步研究抑制N-亞硝胺生成的方法提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

葵花籽油、花生油、亞麻籽油購(gòu)于天津市紅旗農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，采用GB 5009.227—2016《食品中過(guò)氧化值的測(cè)定》[16]中的滴定法測(cè)定葵花籽油、花生油、亞麻籽油的過(guò)氧化值（peroxide value，POV）分別為（12.41±0.13）、（28.52±0.16）、（27.45±0.19） mmol/kg。

三氯甲烷、冰乙酸、碘化鉀、可溶性淀粉、硫代硫酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、NaOH、DMA·HCl、DEA·HCl、吡咯烷（pyrolidine，PYR）、PEG8000、二氯甲烷（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；NDMA、NDEA、NPYR（均為色譜純） 美國(guó)AccuStandard公司。

7890A氣相色譜儀 美國(guó)Agilent公司；ST 40R離心機(jī) 美國(guó)Thermo公司；18Basic勻漿機(jī) 德國(guó)IKA公司；FA2004精密電子天平 上海精科儀器公司；STARTER3100酸度計(jì) 美國(guó)OHAUS公司；HH-S型數(shù)顯恒溫油浴鍋 江蘇科析儀器有限公司；XMTD-4000電熱恒溫水浴鍋 上?？坪銓?shí)業(yè)發(fā)展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 油脂對(duì)體外模擬亞硝化反應(yīng)體系中N-亞硝胺生成量的影響

參照Kuniyuki等[17]的方法，在50 mL離心管中依次加入50 mmol/L NaNO2和25 mmol/L DMA·HCl（DEA·HCl）（其中NaNO2和二級(jí)胺鹽酸鹽均由25 mmol/L、pH值為6.2的磷酸緩沖鹽配制，模擬體系中NaNO2、二級(jí)胺鹽酸鹽的終濃度分別為15 mmol/L和7.5 mmol/L），再繼續(xù)將不同種類（花生油、葵花籽油、亞麻籽油）及不同比例（體積分?jǐn)?shù)0%～40%）的油脂加入離心管中，由于油脂和水不能互溶，因此需在離心管中加入適量的乳化劑（PEG8000），制成乳化體系。待所有試劑加完后，立即用勻漿機(jī)在B檔（13 000 r/min）勻漿30 s，制備得到乳化體系，然后擰緊離心管，置于80 ℃的水浴鍋中水浴1 h，隨即用6 mmol/L NaOH溶液將反應(yīng)體系的pH值調(diào)至13以終止亞硝化反應(yīng)。然后向離心管中加入5 mL二氯甲烷溶液，充分振蕩2 min，離心5 min（4 ℃，10 000×g），吸取下層清亮部分，過(guò)0.45 μm有機(jī)膜后裝入氣相色譜儀的樣品瓶中，待上機(jī)測(cè)定。

1.2.2 亞硝化反應(yīng)條件對(duì)2 種反應(yīng)體系中N-亞硝胺生成量的影響

通過(guò)模擬反應(yīng)體系1.2.1節(jié)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定將20%花生油應(yīng)用到模擬反應(yīng)體系中，形成乳化體系，以不加花生油的水相體系為對(duì)照，研究不同NaNO2與DMA·HCl、DEA·HCl、PYR的濃度比（1∶1、2∶1、1∶2）、pH值（5.4、5.8、6.2、6.6、7.0）、反應(yīng)溫度（20、50、80、100、120 ℃）、反應(yīng)時(shí)間（1、1.5、2、2.5、3 h）對(duì)乳化體系以及水相體系中NDMA、NDEA及NPYR生成量的影響。

模擬體系制備過(guò)程：用25 mmol/L磷酸鹽緩沖液分別配制100 mmol/L的NaNO2溶液以及50 mmol/L的DMA·HCl（DEA·HCl或PYR）溶液，然后各取4 mL于50 mL離心管中，繼續(xù)向離心管中加入2 mL花生油（乳化體系）或緩沖鹽溶液（水相體系）及乳化劑（PEG8000），立即勻漿、乳化。將反應(yīng)體系置于水浴鍋中加熱一段時(shí)間后，取出置于冰中快速冷卻，然后用6 mol/L NaOH溶液終止亞硝化反應(yīng)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟同1.2.1節(jié)。

1.2.3 N-亞硝胺指標(biāo)的測(cè)定

將前處理好的樣品進(jìn)行氣相色譜測(cè)定。色譜條件：HP-INNOWAX毛細(xì)管色譜柱（30 m×320 μm，0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度250 ℃；氮磷檢測(cè)器溫度330 ℃；載氣為N2；流速6 mL/min；空氣流速60 mL/min；H2流速3 mL/min。升溫程序：初始溫度50 ℃，保持4 min；以10 ℃/min升到180 ℃，保持2 min；后運(yùn)行200 ℃，5 min。不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量1 μL。

利用安捷倫工作站對(duì)色譜圖進(jìn)行分析及數(shù)據(jù)處理，采用保留時(shí)間進(jìn)行定性，外標(biāo)法進(jìn)行定量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Excel 2016計(jì)算各個(gè)指標(biāo)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，結(jié)果用±s表示，實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。SPSS Statistix 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，通過(guò)SNK法進(jìn)行顯著性分析，顯著性差異（P＜0.05）。使用Origin 9.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種類及比例油脂的添加對(duì)N-亞硝胺生成量的影響

圖1 不同種類及比例的油脂對(duì)N-亞硝胺形成的影響Fig. 1 Effects of different types and proportions of oils on the formation of N-nitrosamines

由圖1可以看出，在含有花生油、亞麻籽油和葵花籽油的亞硝化反應(yīng)體系中，花生油和亞麻籽油的添加明顯促進(jìn)了NDMA和NDEA的形成，且隨著添加比例的增加，NDMA和NDEA的生成量明顯升高，當(dāng)花生油的添加比例為30%時(shí)，NDMA和NDEA的生成量與未添加油脂（0.94、0.87 ng/μL）時(shí)相比分別增加了47%和42%；同樣，當(dāng)亞麻籽油的添加比例為30%時(shí)，NDMA和NDEA的生成量也分別增加了38%和29%；然而葵花籽油的添加幾乎沒(méi)有使體系中的NDMA和NDEA的生成量出現(xiàn)明顯增加趨勢(shì)。分析原因可能與油脂的脂肪氧化程度不同有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)所使用的花生油和亞麻籽油的POV分別為（28.52±0.16） mmol/kg和（27.45±0.19） mmol/kg，顯著高于葵花籽油（（12.41±0.13） mmol/kg，P＜0.05），花生油和亞麻籽油的脂肪氧化程度較高，勢(shì)必會(huì)形成一定的脂肪氧化產(chǎn)物，而脂肪氧化產(chǎn)物對(duì)N-亞硝胺的形成會(huì)有一定的促進(jìn)作用[18]。所以，添加葵花籽油的模擬體系中N-亞硝胺生成量相對(duì)其他2 種油脂來(lái)說(shuō)較低。由此說(shuō)明，某些油脂的添加確實(shí)會(huì)促進(jìn)N-亞硝胺的形成，但與油脂的種類和比例有關(guān)。因?yàn)楫?dāng)油脂的添加比例高于30%時(shí)，不容易形成較好的乳化穩(wěn)定體系，因此將20%花生油應(yīng)用到后續(xù)模擬實(shí)驗(yàn)中。

2.2 底物濃度比對(duì)N-亞硝胺生成量的影響

圖2 底物濃度比對(duì)N-亞硝胺生成量的影響Fig. 2 Influence of substrate concentration on the formation of N-nitrosamines

如圖2所示，在其他亞硝化反應(yīng)條件相同情況下，含有油脂（花生油）的乳化體系中3 種N-亞硝胺的生成量均顯著高于水相體系（對(duì)照組）中N-亞硝胺的生成量（P＜0.05），這說(shuō)明體系中油脂的存在可能以某種形式促進(jìn)N-亞硝胺的形成。且在相同反應(yīng)條件下，NaNO2與相同濃度的DMA·HCl、DEA·HCl或PYR反應(yīng)時(shí)，NDMA的生成量明顯高于NDEA和NPYR的生成量。結(jié)果表明，當(dāng)NaNO2與DMA·HCl、DEA·HCl底物濃度比為2∶1時(shí)，乳化體系和水相體系中NDMA和NDEA的生成量最高，顯著高于其他2 個(gè)濃度比（1∶1或1∶2）。而當(dāng)比較底物濃度為1∶1或1∶2之間的變化時(shí)，1∶2的NDMA和NDEA的生成量略高于1∶1。與NDMA和NDEA的變化不同，當(dāng)?shù)孜餄舛萅aNO2與PYR濃度比為2∶1時(shí)，NPYR的生成量并不是最高，反而是1∶2相對(duì)較高，這說(shuō)明NPYR的形成機(jī)制與NDMA和NDEA有很大不同。

2.3 pH值對(duì)N-亞硝胺生成量的影響

圖3 pH值對(duì)N-亞硝胺生成量的影響Fig. 3 Effect of pH on the formation of N-nitrosamines

由圖3可知，pH值在5.4～7.0范圍內(nèi)，隨著pH值的升高，水相體系及乳化體系中NDMA和NDEA的生成量均有明顯下降趨勢(shì)（P＜0.05），且水相體系及乳化體系之間逐漸趨于一致。當(dāng)pH值升高到7時(shí)，水相體系和乳化體系中NDMA和NDEA生成量均降到很低的水平（0.30～0.76 ng/μL）。說(shuō)明N-亞硝胺更易在酸性條件下形成，越接近中性條件，NDMA和NDEA生成量越少。圖3表明在pH值變化初期（5.4～6.2）乳化體系中NPYR的生成量隨著pH值上升顯著下降，當(dāng)pH值大于6.2時(shí)，NPYR的生成量基本保持不變，水相體系中NPYR的生成量受pH值的影響不大。并且，pH值在5.4～7.0范圍內(nèi)，乳化體系中NDMA（0.75～12.79 ng/μL）、NDEA（0.50～8.87 ng/μL）、NPYR（1.25～2.07 ng/μL）生成量始終高于水相體系中NDMA（0.60～8.89 ng/μL）、NDEA（0.30～8.06 ng/μL）、NPYR（0.50～0.82 ng/μL）的生成量。

2.4 反應(yīng)溫度對(duì)N-亞硝胺生成量的影響

圖4 反應(yīng)溫度對(duì)N-亞硝胺生成量的影響Fig. 4 Effect of reaction temperature on the formation of N-nitrosamines

由圖4可以看出，乳化體系中N-亞硝胺生成量始終高于水相體系，且溫度越高，2 種體系中N-亞硝胺生成量之間的差異越明顯。如反應(yīng)溫度50 ℃時(shí)，NDMA在乳化體系中的生成量是水相體系的1.15 倍，而當(dāng)溫度升高到120 ℃時(shí)，升至1.79 倍。反應(yīng)溫度對(duì)所有的化學(xué)反應(yīng)速率均有一定的影響，據(jù)范霍夫近似規(guī)律，溫度每升高10 K，反應(yīng)速率近似增加2～4 倍。因此，高溫對(duì)亞硝化反應(yīng)速率起到明顯的促進(jìn)作用，特別是油脂存在條件下，高溫更有利于N-亞硝胺的形成。

NDMA、NDEA、NPYR三者之間比較，在相同條件下，NDMA的生成量最高，其次是NDEA，而NPYR的生成量最低，但實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，溫度超過(guò)100 ℃，NPYR才更容易形成，且溫度越高，油脂的存在更容易促進(jìn)NPYR的形成，如120 ℃時(shí)，乳化體系中NPYR的生成量比水相體系高出2.54 倍。

2.5 2 種亞硝化反應(yīng)體系條件下反應(yīng)時(shí)間對(duì)N-亞硝胺生成量的影響

圖5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)N-亞硝胺生成量的影響Fig. 5 Effect of reaction time on the formation of N-nitrosamines

由圖5可知，反應(yīng)時(shí)間在1～2.5 h范圍內(nèi)，乳化體系和水相體系中NDMA、NDEA的生成量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過(guò)2.5 h后，NDMA和NDEA的生成量有略微下降的趨勢(shì)，但差異不顯著（P＞0.05）。NPYR的變化趨勢(shì)不同于NDMA和NDEA，反應(yīng)時(shí)間在1～3 h范圍內(nèi)，水相體系中NPYR的生成量變化不明顯，乳化體系只有當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過(guò)2.5 h后才有一個(gè)明顯的上升趨勢(shì)。

3 討 論

脂肪氧化產(chǎn)物能促進(jìn)N-亞硝胺的形成。Kurechi等[18]在二甲胺和亞硝酸鹽的反應(yīng)體系中，加入脂肪氧化產(chǎn)物丙二醛（0.05 mol），觀察反應(yīng)體系中NDMA的形成情況，同時(shí)做空白對(duì)照，結(jié)果表明pH值為6.0時(shí)丙二醛的反應(yīng)體系中NDMA的生成量是對(duì)照體系中的8.64 倍。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，氧化程度較高的花生油和亞麻籽油，其參與的模擬體系中NDMA和NDEA生成量也較高。除了脂肪氧化程度外，油脂種類也影響N-亞硝胺的形成。另外為進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)還將氧化程度較低的花生油通過(guò)在高溫條件下加熱不同時(shí)間，得到不同氧化程度的花生油（POV分別為（10.26±0.21）、（18.74±0.13）、（33.20±0.17） mmol/kg），然后將亞硝酸鹽和二甲胺鹽酸鹽以及不同氧化程度的花生油添加到模擬體系中制備乳化體系（其中花生油的添加量為20%），測(cè)定不同體系中NDMA生成量（對(duì)應(yīng)的NDMA生成量分別為（1.17±0.10）、（1.24±0.06）、（1.33±0.04） ng/μL），結(jié)果表明NDMA的生成量隨著花生油過(guò)氧化值的升高有上升的趨勢(shì)，說(shuō)明氧化產(chǎn)物影響N-亞硝胺的形成。且由2.1節(jié)可知，葵花籽油過(guò)氧化值為（12.41±0.13） mmol/kg，高于氧化程度低的花生油的POV（10.26 mmol/kg），但在其他條件相同的情況下，添加20%葵花籽油的模擬體系中NDMA的生成量（0.87 ng/μL）卻低于添加花生油的模擬體系中的NDMA生成量（1.27 ng/μL）。說(shuō)明除了油脂氧化程度外，油脂的種類可能也會(huì)影響N-亞硝胺的形成，究其原因可能在于不同油脂的脂肪酸組成及脂肪酸飽和度均有一定的差異。

表1 N-亞硝胺結(jié)構(gòu)及形成機(jī)理Table 1 Structure and formation mechanism of N-nitrosamines

底物濃度對(duì)N-亞硝胺的形成有明顯的影響，楊華等[10]研究表明亞硝酸鹽濃度越高，N-亞硝胺的生成量越大。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，當(dāng)亞硝酸鹽和二級(jí)胺鹽酸鹽的濃度比為2∶1時(shí)，生成的NDMA和NDEA的量最多。究其原因可能在于，N-亞硝胺的形成過(guò)程分為兩步，第1步是兩分子亞硝酸生成活性中間體NOx（N2O3），第2步是NOx（N2O3）將DMA（DEA）亞硝化為NDMA（NDEA），如表1中公式2、3所示。其中第1步的主要產(chǎn)物是N2O3，這1步的活化能約為114～118 kJ/moL，比第2步反應(yīng)的活化能高103～108 kJ/moL，所以兩分子亞硝酸生成N2O3是整個(gè)亞硝化反應(yīng)的控速步驟，因此NDMA的生成速率與亞硝酸/亞硝酸鹽的濃度密切相關(guān)[19]，亞硝酸鹽濃度越高，其生成量也就越大。但亞硝酸鹽濃度對(duì)NPYR的形成影響較小，Drabik-markiewicz等[20]認(rèn)為，NPYR的形成與溫度及脯氨酸濃度有關(guān)，而與亞硝酸鹽濃度的關(guān)系不大，與本實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果一致。

低pH值條件下有利于NDMA（NDEA）的形成。Mirvish[12]研究了水相中N-亞硝胺形成的動(dòng)力學(xué)，結(jié)果表明pH值每下降1 個(gè)單位，N-亞硝胺形成的初始速率就會(huì)增加10 倍。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，pH值在5.4～7.0范圍內(nèi)，NDMA和NDEA生成量隨著pH值的上升有下降的趨勢(shì)。原因可能是亞硝酸鈉不能直接與二級(jí)胺（DMA、DEA）反應(yīng)生成N-亞硝胺，需先在酸性條件下轉(zhuǎn)化為亞硝酸（表1公式1），亞硝酸進(jìn)一步反應(yīng)生成亞硝化試劑NOx（表1公式2），NOx再亞硝化胺類物質(zhì)生成N-亞硝胺（表1公式3）。因此，當(dāng)pH值較高時(shí)，亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為亞硝酸的量大大降低，從而導(dǎo)致N-亞硝胺的生成量出現(xiàn)明顯下降的趨勢(shì)。但pH值也并非越低越好，尹立輝等[11]認(rèn)為當(dāng)pH值過(guò)低時(shí)，會(huì)導(dǎo)致胺類化合物質(zhì)子化，使其不能夠和活性中間體氮氧化物發(fā)生反應(yīng)，從而影響N-亞硝胺的形成。Rywotycki[21]認(rèn)為對(duì)于仲胺來(lái)說(shuō)，生成N-亞硝胺的最有效的pH值為4～4.5。

溫度是影響N-亞硝胺形成的重要因素之一，楊華等[10]研究表明當(dāng)溫度高于80 ℃時(shí)，NDMA和NDEA的生成量隨著溫度的上升有明顯增加的趨勢(shì)。Bharucha等[22]研究表明，培根經(jīng)過(guò)高溫處理后NPYR含量顯著高于生培根中NPYR的含量。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)反應(yīng)溫度高于80 ℃時(shí)，隨著溫度的升高，3 種N-亞硝胺的生成量明顯增加。另外本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果還表明，在高溫條件下（大于80 ℃），乳化體系中NDMA和NDEA的生成速率高于水相體系。原因可能是脂肪可以與NOx反應(yīng)生成一種中間產(chǎn)物（lipid-NOx，LN）（表1公式4），LN可能直接與胺類底物反應(yīng)生成N-亞硝胺（表1公式5），LN也可能在適當(dāng)條件下釋放NOx（表1公式4），NOx與存在的自由胺類物質(zhì)反應(yīng)，形成N-亞硝胺（表1公式3）[14]，而高溫則會(huì)加速LN降解并釋放氮氧化物[23]。因此高溫條件下乳化體系中NDMA和NDEA形成速率明顯高于水相體系中N-亞硝胺的形成速率。與NDMA、NDEA的變化趨勢(shì)相同，乳化體系中NPYR的形成速率也高于水相體系。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NDMA和NDEA的生成量隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)有先上升后略微下降的趨勢(shì)，原因可能是反應(yīng)開始時(shí)，硝酸逐漸向NOx轉(zhuǎn)化（表1公式2），隨著體系中NOx的增加，N-亞硝胺的生成量隨之增大。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到2.5 h后，體系中的N-亞硝胺底物（亞硝酸鈉或二級(jí)胺鹽酸鹽）基本耗盡，因此生成量并未出現(xiàn)上升的趨勢(shì)。Bharucha等[22]研究發(fā)現(xiàn)，培根在油炸后期N-亞硝胺呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)，原因是油炸后期部分N-亞硝胺隨著蒸汽揮發(fā)至空氣當(dāng)中，因此本實(shí)驗(yàn)NDMA、NDEA生成量在3 h略微下降也很可能是由于隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，少量N-亞硝胺隨著水蒸氣揮發(fā)至外界所致，但差異不顯著。

本實(shí)驗(yàn)研究表明NaNO2與DMA·HCl、DEA·HCl、PYR濃度比為2∶1時(shí)，NDMA、NDEA的生成量最高，NPYR的生成量最低。這可能與DMA、DEA的結(jié)構(gòu)有關(guān)（表1）。DMA和DEA的碳鏈長(zhǎng)短不一樣，碳鏈越長(zhǎng)，分子間作用力越大，因此相對(duì)于DEA而言，DMA上的氫原子更易被亞硝基取代，從而生成相應(yīng)的N-亞硝胺。NPYR生成量最低的原因可能是相對(duì)于NDMA、NDEA而言，NPYR的形成需要更高的溫度，PYR是穩(wěn)定的五元環(huán)，在低溫條件下不容易發(fā)生取代反應(yīng)，但高溫有利于NPYR的形成。Drabik-markiewicz等[20]研究表明，將肉制品加熱到85 ℃，NDMA的檢出率較高，但NPYR的檢出率基本為零，當(dāng)溫度升至200 ℃以后，NPYR檢出率較高。

Mottram等[24]研究表明油炸培根的脂肪組織中N-亞硝胺的含量遠(yuǎn)高于瘦肉或全肉；熊鳳嬌等[25]研究發(fā)現(xiàn)，在魚豆腐的加工過(guò)程中，在添加脂肪進(jìn)行斬拌后，N-亞硝胺含量有明顯上升的趨勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在不同因素的影響下，乳化體系中N-亞硝胺生成量高于水相體系中N-亞硝胺的生成量。關(guān)于脂肪參與N-亞硝胺形成的原因，除了上述提到的脂肪氧化產(chǎn)物促進(jìn)N-亞硝胺的形成外，Hotchkiss等[15]推測(cè)脂肪可以與NOx反應(yīng)生成一種未知的中間產(chǎn)物，這一中間產(chǎn)物可以在一定條件下（煎炸）降解成為亞硝化試劑，將胺類底物亞硝化成相應(yīng)N-亞硝胺。學(xué)者們通過(guò)將氮氧化物與脂肪酸反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)形成的反應(yīng)產(chǎn)物能亞硝化胺類物質(zhì)[26-29]。Liu Ruihai等[30]研究證明了N2O3可加成到脂肪酸的碳碳雙鍵位置，生成脂肪亞硝化試劑，該試劑可以在油炸過(guò)程中分解，并釋放出可以亞硝化二級(jí)胺的氮氧化物。由此可以看出，脂肪確實(shí)能夠參與N-亞硝胺的形成，但關(guān)于脂肪與氮氧化物的反應(yīng)物結(jié)構(gòu)及其合成機(jī)制亟待深入研究。

4 結(jié) 論

在含有油脂的亞硝化反應(yīng)體系中，3 種油脂（花生油、亞麻籽油、葵花籽油）對(duì)NDMA和NDEA的形成均有一定的促進(jìn)作用，但油脂的種類和比例影響N-亞硝胺的形成，且相對(duì)于添加葵花籽油而言，花生油和亞麻籽油的添加對(duì)N-亞硝胺形成的促進(jìn)效果更好。

比較亞硝化反應(yīng)的水相體系和乳化體系，整體上乳化體系中NDMA、NDEA和NPYR的生成量均顯著高于水相體系中，且相同反應(yīng)條件下，三者的生成量依次是NDMA＞NDEA＞NPYR，說(shuō)明油脂確實(shí)起到促進(jìn)N-亞硝胺形成的作用。

無(wú)論乳化體系還是水相體系，亞硝化反應(yīng)條件（底物濃度、pH值、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間）對(duì)N-亞硝胺的形成影響較大，NaNO2與DMA·HCl、DEA·HCl和PYR濃度比為2∶1時(shí)，NDMA和NDEA的生成量最大；pH值在5.4～7.0范圍，NDMA和NDEA的生成量隨著pH值的上升有下降的趨勢(shì)。但pH值對(duì)NPYR生成量影響較?。环磻?yīng)溫度越高，N-亞硝胺的生成量越大，當(dāng)溫度高于80 ℃時(shí)，NDMA和NDEA的生成量有明顯上升的趨勢(shì)，反應(yīng)溫度高于100 ℃時(shí)，NPYR才有明顯的升高趨勢(shì)；在1～2.5 h反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，NDMA和NDEA的生成量有上升的趨勢(shì)，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過(guò)2.5 h后，NDMA和NDEA的生成量有略微下降的趨勢(shì)。與NDMA和NDEA相比較，反應(yīng)時(shí)間對(duì)NPYR生成量的影響較小。

在高溫、低pH值、高亞硝酸鈉濃度和一定量的油脂存在的條件下，NDMA、NDEA的生成量較大，而對(duì)NPYR形成影響最大的因素是反應(yīng)溫度，因此在肉制品實(shí)際生產(chǎn)中可以通過(guò)控制這些因素從而降低N-亞硝胺的形成。