人博卡病毒微滴數(shù)字PCR定量方法的建立

鄧幼平，劉穎娟，王笑臣，劉佳明，楊占秋，趙東赤,*

(1 武漢大學(xué)中南醫(yī)院 兒科，武漢 430071；2 武漢大學(xué)中南醫(yī)院 檢驗(yàn)科，武漢 430071；3 武漢大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)病毒學(xué)研究所，病毒學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430071)

人博卡病毒(Human bocavirus, HBoV)是單鏈無(wú)包膜的DNA病毒，屬于細(xì)小病毒科博卡病毒屬，基因全長(zhǎng)約5.2 kb，由瑞典學(xué)者采用隨機(jī)PCR克隆測(cè)序方法在兒童呼吸道感染病例中發(fā)現(xiàn). HBoV與人類呼吸道感染密切相關(guān)，易感人群主要是嬰幼兒，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、喘鳴及不同程度的呼吸窘迫，極少數(shù)患者可出現(xiàn)縱膈氣腫和雙側(cè)氣胸，是兒童呼吸道感染重要的呼吸道病原之一[1,2].

由于缺少可靠的HBoV體外培養(yǎng)系統(tǒng)和動(dòng)物模型，目前臨床診斷主要依靠血清學(xué)方法檢測(cè)病毒抗體和PCR技術(shù)檢測(cè)病毒核酸[1,3-6].熒光定量PCR法(real-time PCR)法較常規(guī)PCR法更敏感，并能定量病毒拷貝數(shù)，但它依賴CT值和標(biāo)準(zhǔn)曲線間接定量，對(duì)低拷貝和復(fù)雜來(lái)源的臨床樣本檢測(cè)存在較大的局限性.隨著PCR定量技術(shù)的不斷改進(jìn)，微滴數(shù)字PCR(ddPCR)可實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA分子的絕對(duì)定量.ddPCR的原理是將微量DNA樣品大倍數(shù)稀釋和分液，使其分布在一定數(shù)目的微滴中，微滴中每個(gè)樣品中的待測(cè)分子數(shù)不超過(guò)1，再將所有樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)發(fā)生了反應(yīng)的樣品計(jì)數(shù)，并根據(jù)泊松分布計(jì)算DNA分子進(jìn)行定量[7].為了快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)和診斷HBoV，本研究建立了HBoV ddPCR檢測(cè)方法并對(duì)臨床鼻咽分泌物咽拭子樣本進(jìn)行了檢測(cè).

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

人博卡病毒陽(yáng)性標(biāo)本由武漢生物工程學(xué)院李毅教授實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)[8]，呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒(Adv)、鼻病毒(RV)、流感病毒A(H1N1)和巨細(xì)胞病毒(CMV)，由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院病毒所保存.AxyPrep Body Fluid Viral DNA/RNA Miniprepkit試劑盒(愛(ài)思進(jìn))，微滴數(shù)字PCR定量試劑盒(美國(guó)伯樂(lè))，引物(上海生工).

Nanodrop 2000C超微量紫外分光光度計(jì)(美國(guó)賽默飛)，CFX96 Real-Time System PCR儀、QX100TM微滴式數(shù)字PCR儀(美國(guó)伯樂(lè)).

1.2 樣本來(lái)源

選取2012年7月至2013年6月武漢大學(xué)中南醫(yī)院兒科住院患兒鼻咽拭子樣本182例，患兒年齡20 d至10歲，鼻咽拭子采集時(shí)間為入院2 d內(nèi)；同時(shí)選取24例1個(gè)月至12歲健康體檢兒童為對(duì)照.

1.3 病毒核酸的提取

根據(jù)DNA提取試劑盒的方法，提取臨床標(biāo)本總核酸，用50 μL的洗脫液洗脫，置于-80 ℃冰箱中保存.

1.4 引物及探針的設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI上檢索的HBoV-sh9(NO：JN632519)基因序列，設(shè)計(jì)最佳引物和探針，序列見(jiàn)表1，探針為雙熒光探針，5′ 端FAM報(bào)告基因，3′ 端TAMRA淬滅基因.

表1 HBoV引物和探針序列Tab.1 Primer and probe sequence for HBoV

1.5 HBoV ddPCR方法的建立

1.5.1 ddPCR擴(kuò)增反應(yīng)條件的優(yōu)化

ddPCR方法的準(zhǔn)確性與PCR擴(kuò)增體系中的引物、探針濃度密切相關(guān).為獲得最佳ddPCR效果，對(duì)引物、探針濃度和擴(kuò)增體系進(jìn)行了優(yōu)化. 將HBoV陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增[9]，產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序證實(shí)后克隆入puc57載體制備了HBoV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品(puc57-HBoV)[10]，根據(jù)其吸光度計(jì)算質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度為53.3 ng/μL，優(yōu)化方法為以制備的HBoV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品(puc57-HBoV)為模板[10]，選擇55～60 ℃設(shè)置梯度退火溫度，50～900 nM設(shè)置引物濃度，50～250 nM設(shè)置探針濃度，分別進(jìn)行ddPCR反應(yīng)，根據(jù)結(jié)果選擇線性回歸曲線最佳R2和濃度獲得最大信號(hào)/背景比值的組合做為ddPCR反應(yīng)體系建立的條件.

1.5.2 ddPCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序

根據(jù)優(yōu)化結(jié)果，確定ddPCR反應(yīng)體系為：2×dd PCRTM Supermix for Probes 10 μL，DNA模板4 μL，900 nM引物1.8 μL，250 nM探針0.5 μL，純水1.9 μL，共20 μL.將配制好的20 μL PCR反應(yīng)液，轉(zhuǎn)移至微滴發(fā)生卡樣本孔中，再加入70 μL微滴發(fā)生油至油孔中，利用微滴生成器制備反應(yīng)微滴.將每個(gè)樣品的微滴分別轉(zhuǎn)移至96孔PCR反應(yīng)板中對(duì)應(yīng)的反應(yīng)孔中，在普通PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增.擴(kuò)增循環(huán)條件和溫度見(jiàn)表2.

表2 HBoV ddPCR循環(huán)程序

注：a檢查調(diào)整升溫速率為2 ℃/s；使用熱蓋設(shè)定為105 ℃，樣品體積設(shè)置為40 μL

1.5.3 ddPCR反應(yīng)定量分析方法

將PCR擴(kuò)增后的96孔板放入數(shù)字PCR儀微滴分析器中，并在軟件QuantaSoft上設(shè)定檢測(cè)模式，檢測(cè)FAM和HEX的熒光信號(hào)，結(jié)合泊松分布統(tǒng)計(jì)原理，由軟件自動(dòng)統(tǒng)計(jì)發(fā)生PCR反應(yīng)的陽(yáng)性微滴的比例，并對(duì)PCR反應(yīng)體系中的起始模板進(jìn)行定量.

1.5.4 ddPCR定量限

根據(jù)HBoV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品(puc57-HBoV)吸光度計(jì)算質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度為53.3 ng/μL，依次將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍的梯度稀釋，取10-5～10-9稀釋樣品4 μL作為ddPCR反應(yīng)的模板，確定人博卡病毒微滴數(shù)字PCR定量限.

1.5.5 人博卡病毒ddPCR特異性檢驗(yàn)

提取由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院病毒所保存的兒童易感病毒的基因組，包括：RSV,Adv,RV,H1N1和CMV引物序列見(jiàn)表3，按照上述優(yōu)化條件進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證ddPCR擴(kuò)增反應(yīng)的特異性，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照(NTC)和陽(yáng)性對(duì)照(陽(yáng)性質(zhì)粒).

表3 兒童易感病毒PCR引物序列

1.6 微滴數(shù)字PCR檢測(cè)臨床樣本

利用所設(shè)計(jì)的引物、探針和建立的微滴數(shù)字PCR反應(yīng)體系，對(duì)182例住院患兒咽拭子樣本和24例健康兒童咽拭子樣本，進(jìn)行ddPCR檢測(cè)，每個(gè)樣本重復(fù)3次，另設(shè)有陰性對(duì)照(NTC)和陽(yáng)性對(duì)照(陽(yáng)性質(zhì)粒).

2 結(jié)果與分析

2.1 ddPCR反應(yīng)條件優(yōu)化和檢測(cè)定量限

根據(jù)1.5.1優(yōu)化引物、探針濃度和退火溫度，確定引物和探針最終濃度分別為900 nM和250 nM，退火溫度為57 ℃.取4 μL 10倍梯度稀釋HBoV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，進(jìn)行ddPCR反應(yīng)，確定定量檢測(cè)限，各樣品稀釋倍數(shù)與ddPCR檢測(cè)HBoV拷貝數(shù)見(jiàn)圖1.

圖1 HBoV微滴數(shù)字PCR定量限Fig.1 Limit of quantitation of droplet digital PCR for HBoV

由圖1可知，HBoV的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y= -1.035x+ 9.011,R2=1, 表明樣品模板濃度在0.5～6800 copies/μL，ddPCR具有良好的線性和精確度；HBoV的ddPCR定量限低至0.5 copies/μL樣品ddPCR反應(yīng)液，可用來(lái)進(jìn)行未知樣本的HBOV拷貝數(shù)定量檢測(cè).

2.2 ddPCR特異性檢測(cè)

將RSV,Adv,RV,H1N1和CMV進(jìn)行ddPCR方法特異性檢測(cè)，編號(hào)分別為D01,D02,D03,D04和D05，結(jié)果表明:除了HBoV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品(puc57-HBoV)有特異性擴(kuò)增外，5種病毒和NTC擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，表明建立的ddPCR擴(kuò)增體系特異性高(見(jiàn)圖2).

圖2 HBoV ddPCR特異性檢測(cè)微滴信號(hào)圖Fig.2 ddPCR droplet signal diagram for HBoV specificity detection

2.3 臨床樣本檢測(cè)

采用ddPCR方法對(duì)182例臨床樣本和24例健康對(duì)照組樣本進(jìn)行HBoV檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖3.由圖3可見(jiàn)，182例臨床樣本檢出15例陽(yáng)性，陽(yáng)性率8.24%，陽(yáng)性樣本在每次重復(fù)中均能穩(wěn)定檢測(cè)，拷貝數(shù)為(0.5±0.2)～(76.0±5.4)copies/μL，HBoV陽(yáng)性樣本的ddPCR定量結(jié)果和臨床診斷見(jiàn)表4；陰性樣本無(wú)微滴出現(xiàn)；在24例健康對(duì)照組樣本的72次反應(yīng)中，只有1個(gè)樣品1次技術(shù)重復(fù)中有1個(gè)信號(hào)值相對(duì)較低的疑似陽(yáng)性微滴，其他2次重復(fù)無(wú)疑似陽(yáng)性微滴出現(xiàn)，可能為非特異性擴(kuò)增或異常的熒光物質(zhì)導(dǎo)致，表明健康對(duì)照組未發(fā)現(xiàn)HBoV感染(見(jiàn)圖3d).

a)15例陽(yáng)性樣本; b)單例陽(yáng)性樣本圖; c)部分陰性樣本; d)24例健康對(duì)照組圖3 臨床樣本HBoV ddPCR檢測(cè)微滴信號(hào)圖Fig.3 ddPCR droplet signal diagram for HBoV clinical samples detection

病例編號(hào)年齡性別臨床診斷 ddPCR定量(copies/μL)13月男支氣管肺炎22.5±2.723歲女支氣管肺炎14.0±2.331歲1月女支氣管肺炎6.5±1.541歲1月男急性支氣管炎0.6±0.352歲5月男毛細(xì)支氣管炎1.8±0.862月女喘息性支氣管炎3.5±1.171歲10月女毛細(xì)支氣管炎4.2±1.288月男支氣管肺炎76.0±5.4910月男支氣管肺炎23.0±3.1105月男支氣管肺炎0.5±0.21111月女急性支氣管炎18.5±2.4122月女急性支氣管炎34.5±3.4132歲2月男支氣管肺炎8.0±1.7144歲女支氣管肺炎5.5±1.4151歲7月女支氣管肺炎20.5±2.7

3 討論

在我國(guó)，HBoV流行病學(xué)特征與國(guó)外報(bào)道類似，呼吸道感染者HBoV的感染率為1.4%～19.3%[11]，但目前對(duì)HBoV的檢測(cè)還存在著諸多問(wèn)題.林峰和Dijkman R等[12,13]采用人類假?gòu)?fù)層上皮細(xì)胞，成功培養(yǎng)了HBoV，但細(xì)胞成本高昂、來(lái)源困難，且實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、對(duì)標(biāo)本的運(yùn)輸和存儲(chǔ)條件要求高、培養(yǎng)陽(yáng)性率低，難以滿足臨床檢測(cè)的要求.目前對(duì)HBoV的分子結(jié)構(gòu)、免疫原性、免疫反應(yīng)等尚不完全清楚，制備HBoV單克隆抗體過(guò)程復(fù)雜、成本高昂、缺乏合適的動(dòng)物模型，難以檢測(cè)特異抗體.而免疫印跡技術(shù)因價(jià)格昂貴、實(shí)驗(yàn)制備過(guò)程復(fù)雜、技術(shù)難度大、干擾因素較多等，使對(duì)HBoV VP2 蛋白抗體的檢測(cè)運(yùn)用臨床受限[14,15].巢式PCR(Nest-PCR)特異性強(qiáng)，但此技術(shù)操作復(fù)雜，不能定量，臨床檢測(cè)受限.

實(shí)時(shí)熒光定量PCR應(yīng)用廣泛，但檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，必須依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線才能定量[16].目前，新一代ddPCR迅速發(fā)展成為一種替代方案，近年不少報(bào)道證實(shí)了其理論上更高的精確度，能廣泛運(yùn)用于臨床樣本檢測(cè)[17-19].Choi J H等[4]利用real-time PCR方法檢測(cè)HBoV其定量限為5 copies/μL)；Lu X等[5]建立Taqman PCR方法檢測(cè)HBoV定量限為2 copies/μL.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：ddPCR無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)曲線即可確定靶分子的起始濃度或拷貝數(shù)，能有效檢測(cè)HBoV含量低至(0.5±0.2) copies/μL的臨床樣本，陽(yáng)性樣本拷貝數(shù)范圍是(0.5±0.2)～(76.0±5.4)copies/μL，HBoV感染的陽(yáng)性率為8.24%.可見(jiàn)ddPCR方法在檢測(cè)低含量病毒核酸序列具有更高的靈敏度，不受樣品基質(zhì)和擴(kuò)增效率的影響，對(duì)于滿足臨床精準(zhǔn)檢測(cè)要求更具優(yōu)勢(shì).

綜上所述，本研究建立了HBoV的ddPCR檢測(cè)方法，具有更低的定量限，能夠快速、精確地定量檢測(cè)出兒童咽拭子標(biāo)本中的HBoV，對(duì)HBoV等低豐度病毒的診治提供了更為迅速、準(zhǔn)確的檢測(cè)和研究方法.