一種新型α-甘露糖苷酶的異源表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)表征

楊 帆， 李 鶴， 楊 蘭， 李 憲 臻

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

黃原膠(xanthan)是一種重要的陰離子雜多糖[1-3]，其分子質(zhì)量在2×103～2×104ku[4]，由重復(fù)的五糖單元組成，其主鏈?zhǔn)怯搔?(1，4)-糖苷鍵相連接而成的纖維二糖，側(cè)鏈則由β-D-甘露糖-(1，4)-β-D-葡萄糖醛酸-(1，2)-α-D-甘露糖連接[5-7]。這種復(fù)雜的分子結(jié)構(gòu)賦予黃原膠其他凝膠不可比擬的特性，是目前國際上集增稠、懸浮、乳化、穩(wěn)定于一體，性能較為優(yōu)越的生物膠，廣泛應(yīng)用于食品、石油和制藥行業(yè)[8-10]。

研究表明，黃原膠三糖側(cè)鏈不同程度的截?cái)鄷x予黃原膠分子新的理化特性。由側(cè)鏈截?cái)嗟狞S原膠降解所產(chǎn)生的寡糖不僅具有植物誘抗活性，還能夠有效抑制X.campestris的生長，對黑腐病的防治具有多重功效[11-13]。現(xiàn)階段，黃原膠寡糖主要是由微生物降解黃原膠獲得[14-15]。天然菌株降解黃原膠獲得的寡糖產(chǎn)物為聚合度分散、側(cè)鏈結(jié)構(gòu)多樣的混合物。加之后續(xù)寡糖分離純化困難[16]，目前黃原膠寡糖的活性研究均以寡糖混合物為對象，因此難以闡明其構(gòu)效關(guān)系。由于黃原膠的生產(chǎn)和應(yīng)用細(xì)化，使得開發(fā)能夠水解其三糖側(cè)鏈的酶制劑以獲取改性黃原膠具有很好的研究價(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)對一株性能優(yōu)良的新型黃原膠降解菌株Microbacteriumsp. XT11中α-甘露糖苷酶編碼的基因MiMan進(jìn)行克隆、表達(dá)及純化并進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)表征。作為一種特異性水解黃原膠側(cè)鏈的酶，α-甘露糖苷酶通過切割黃原膠側(cè)鏈和主鏈之間的糖苷鍵實(shí)現(xiàn)對黃原膠的修飾。以期為工業(yè)化應(yīng)用側(cè)鏈修飾黃原膠提供有效、可靠的生物酶制劑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

微桿菌Microbacteriumsp. XT11，大連工業(yè)大學(xué)微生物資源與生物催化實(shí)驗(yàn)室保藏。EscherichiacoliDH5α，大連寶生物有限公司；E.coliBL21(DE3)、質(zhì)粒pET-28a(+)獲贈于大連化學(xué)物理研究所趙宗保研究員課題組。PrimeSTAR HS DNA Polymerase、250 bp DNA Marker、1 kb DNA Marker、Protein Marker (High)限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ、基因組提取試劑盒，TaKaRa生物工程(大連)有限公司。

黃原膠發(fā)酵培養(yǎng)基：食品級黃原膠3 g/L，酵母浸粉3 g/L，無水葡萄糖0.5 g/L；無機(jī)鹽溶液：MgSO425 mg/L，NaCl 800 mg/L，K2HPO450 mg/L，KNO3700 mg/L，pH 7.0；LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母浸粉5.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L；LB固體培養(yǎng)基：瓊脂粉15.0 g/L，其余成分同LB液體培養(yǎng)基。

TGL-16高速臺式冷凍離心機(jī)，湘儀離心機(jī)廠；JY92-IIN超聲破碎儀，寧波新芝生物技術(shù)有限公司；AKTA蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)，GE Healthcare；UV5200紫外分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

甘露糖苷酶編碼基因MiMan的克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建、鑒定所用引物均合成于上海生工生物有限公司。所使用的引物序列及功能如表1所示。

表1 引物序列及功能

1.2.2 甘露糖苷酶編碼基因MiMan的克隆

取出搖床培養(yǎng)發(fā)酵12 h后的微桿菌Microbacteriumsp. XT 11菌液，4 ℃、6 000 r/min離心去除上清，超純水清洗菌體2遍。采用基因組提取試劑盒按照標(biāo)準(zhǔn)流程提取XT11基因組DNA，并以之為模板進(jìn)行甘露糖苷酶編碼基因的擴(kuò)增。反應(yīng)體系：基因組DNA模板100 ng，上下游引物20 μmol/L，5×Primer STAR Buffer 10 μL，dNTPs 2.5 mmol/L，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 1.25 U，DMSO(保護(hù)劑)5 μL，加無菌水至總體積50 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 3 min 10 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min，20 ℃結(jié)束反應(yīng)。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增片段，并采用膠回收試劑盒進(jìn)行回收。將回收的MiMan基因片段通過TA克隆連接至pMD19-T Simple Vector構(gòu)建質(zhì)粒pT-man，并進(jìn)行測序驗(yàn)證。

1.2.3 pET-MiMan表達(dá)載體的構(gòu)建

以質(zhì)粒pT-man為模板，利用引入EcoRⅠ和Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)的引物man-F2和man-R2進(jìn)行帶有酶切位點(diǎn)的編碼基因的擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件與“1.2.2”相同。將表達(dá)載體pET-28a(+)和回收后的PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切，并用回收試劑盒回收，將回收的線性化質(zhì)粒與目的片段按濃度比3∶1進(jìn)行T4連接，16 ℃反應(yīng)2 h，轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α熱激感受態(tài)細(xì)胞中，并涂布于30 μg/mL卡那霉素的LB平板上，挑選陽性克隆并提取質(zhì)粒測序驗(yàn)證，構(gòu)建正確的表達(dá)質(zhì)粒即為pET-MiMan。

1.2.4 甘露糖苷酶MiMan的表達(dá)純化

將表達(dá)質(zhì)粒pET-MiMan電擊轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR鑒定，正確的轉(zhuǎn)化子BL21(DE3)-MiMan進(jìn)行目的蛋白表達(dá)。

將BL21(DE3)-MiMan種子液按1∶100轉(zhuǎn)接于1 L含30 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8，加入IPTG至終濃度0.5 μmol/L；16 ℃、200 r/min誘導(dǎo)20 h；70 mL Native Binding Buffer重懸菌體并采用超聲破碎細(xì)胞。帶有6His標(biāo)簽的甘露糖苷酶MiMan利用Ni-NTA填料進(jìn)行純化。具體步驟：將Ni Sepharose 6 Fast Flow填料裝入直徑為1 cm 的純化柱中，用8倍柱體積超純水洗滌，4倍柱體積Native Binding Buffer平衡填料，加入濃縮液在室溫下充分結(jié)合約1 h，分別流加Native Binding Buffer和Native Wash Buffer約8倍柱體積至無蛋白質(zhì)。緩慢流加Native Elution Buffer，及時(shí)收集洗脫蛋白。蛋白質(zhì)樣品均采用SDS-PAGE電泳進(jìn)行成分分析，并用Bradford法[17]測定蛋白質(zhì)濃度。

1.2.5 甘露糖苷酶MiMan的酶活測定

100 μL酶液與100 μL 0.4 mmol/L pNP-α-D-Man混勻，40 ℃反應(yīng)10 min，立即加入400 μL 0.25 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)，測定OD405，以煮沸滅活5 min的酶液作為陰性對照。酶活力單位定義：每分鐘釋放1 μmol/L pNP所需的酶量為1 U。

1.2.6 甘露糖苷酶MiMan的最適溫度及熱穩(wěn)定性測定

酶的最適溫度測定實(shí)驗(yàn)是分別在25、30、35、40、45、50、55、60 ℃反應(yīng)10 min后，立即加入400 μL 0.25 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)，測定OD405。以測定出最高的酶活力為100%，得到該酶的最適溫度；酶的溫度穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)是將酶液分別在30、40、50、60、70 ℃溫育30 min后測定剩余酶活力，以測定出最高的酶活力為100%，得出該酶溫度穩(wěn)定性曲線。

1.2.7 甘露糖苷酶MiMan的最適pH及pH穩(wěn)定性測定

用緩沖液分別將酶液pH調(diào)節(jié)為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、11.0、12.0，與pNP-α-D-Man于40 ℃反應(yīng)10 min，立即加入400 μL 0.25 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)，測定各pH下的OD405。以測定最高的酶活力為100%，得到該酶的最適pH；取100 μL酶液+100 μL不同pH的緩沖液，于10 ℃溫育20 h，在pH 7.0、40 ℃條件下反應(yīng)10 min后測定酶活，得到該酶的pH穩(wěn)定性曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 MiMan基因的PCR擴(kuò)增和序列分析

以微桿菌Microbacteriumsp. XT 11基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增出一條3 000 bp左右的特異性條帶，大小與甘露糖苷酶目的基因片段一致，瓊脂糖凝膠電泳如圖1所示。

1，MiMan基因目的條帶；M，DNA marker

將構(gòu)建好的質(zhì)粒pT-man送至吉林庫美生物測序，經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫比對證明為甘露糖苷酶的編碼基因，大小為3 042 bp，含有1 014個(gè)氨基酸殘基，理論分子質(zhì)量為112.4 ku。N端含有200 aa 的功能未知非催化域，204～1 006 aa為糖苷水解酶GH38家族催化域，如圖2所示。

經(jīng)比對，微桿菌Microbacteriumsp. XT11來源的甘露糖苷酶與Arthrobactersp. Soil736、Microbacteriumtestaceum、Pseudarthrobacterchlorophenolicus、Pseudarthrobacterequi的甘露糖苷酶的同源性分別為57.4%、61.3%、58.0%、58.7%，說明本研究的酶與其他來源的甘露糖苷酶相似度不高，因此很可能屬于具有新性能的分支酶類。

2.2 甘露糖苷酶MiMan表達(dá)載體及菌株的構(gòu)建

將經(jīng)過EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切的表達(dá)載體pET-28a(+)與甘露糖苷酶基因片段于16 ℃連接2 h，轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α中，并涂布于含有相應(yīng)抗生素的平板上。從平板上挑取陽性克隆子進(jìn)行質(zhì)粒提取，并用EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切驗(yàn)證。1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖3所示，2號質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后(2′)有3.0和5.3 kb大小的兩條特異性條帶，結(jié)果符合預(yù)期。將驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒送吉林庫美生物測序，結(jié)果表明黃原膠甘露糖苷酶重組質(zhì)粒pET-MiMan構(gòu)建成功。將表達(dá)質(zhì)粒pET-MiMan電擊轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于平板后37 ℃靜置培養(yǎng)12 h，并挑取陽性克隆進(jìn)行后續(xù)表達(dá)工作。

白色區(qū)域代表高同源性序列區(qū)；波浪線注釋區(qū)域?yàn)镚H38家族催化域

1、2，pET-MiMan；1′、2′，pET-MiMan酶切條帶；M，DNA Marker

2.3 MiMan基因的異源表達(dá)及純化

將甘露糖苷酶表達(dá)菌株BL21(DE3)-pET-MiMan種子液按1∶100轉(zhuǎn)接于含30 μg/mL 卡那霉素的LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8后加入終濃度0.5 μmol/L的IPTG，于16 ℃、200 r/min培養(yǎng)20 h。離心棄上清之后進(jìn)行超聲細(xì)胞破碎，獲得粗酶液。利用Ni Sepharose 6 Fast Flow親和填料和DEAE對目的蛋白MiMan進(jìn)行純化。SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖4所示，MiMan在大腸桿菌中能夠高水平的可溶性表達(dá)。經(jīng)純化后，雜蛋白被有效去除，獲得純度大于90%的目的蛋白。如表2和圖4所示，目的蛋白MiMan分子質(zhì)量約為110 ku。質(zhì)量濃度為0.23 mg/mL，回收率為8.96%，相對酶活為0.224 U/mg。

1，粗酶液；2，穿出液；3、4，清洗液； 5、6，洗脫液；M，蛋白marker

表2 重組MiMan蛋白的純化結(jié)果

2.4 甘露糖苷酶MiMan的酶學(xué)性質(zhì)

如圖5所示，MiMan在40 ℃時(shí)達(dá)到最大酶活力，在25～50 ℃保持較高的酶活力。當(dāng)反應(yīng)溫度為55 ℃時(shí)，酶活力迅速下降。熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，當(dāng)溫度低于40 ℃時(shí)，MiMan能夠保持很高的酶活力；而溫度高于40 ℃時(shí)，酶活力急劇下降，表明MiMan對于高溫耐受力較低。

如圖6所示，MiMan在pH 7.0時(shí)表現(xiàn)出最大酶活力，pH在6.5～9.0保持最大酶活(70%以上)。在pH 6.5～11.0的緩沖液中溫育20 h后，殘存的酶活力均超過最大酶活的80%。在pH 12.0條件下，酶活在最大酶活的70%以上，說明MiMan具有很好的堿性環(huán)境耐受能力。

圖5 甘露糖苷酶MiMan的最適溫度及熱穩(wěn)定性

圖6 甘露糖苷酶MiMan的最適pH及pH穩(wěn)定性

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以一株性能優(yōu)良的微桿菌Microbacteriumsp. XT11為出發(fā)菌株，從基因組DNA中克隆出甘露糖苷酶編碼基因MiMan，在大腸桿菌BL21(DE3)中成功表達(dá)了融合His親和純化標(biāo)簽的甘露糖苷酶MiMan，得到了可溶性表達(dá)水平較高的酶液，純化回收率達(dá)8.96%。純化MiMan酶學(xué)性質(zhì)分析結(jié)果表明，該酶最適作用溫度為40 ℃，最適pH 7.0，對高溫的耐受力較低；而酶液在pH 5.0～12.0的緩沖液10 ℃溫育20 h后仍能保持較高活力，說明該酶對堿性環(huán)境具有一定的耐受力。Microbacteriumsp. XT11菌株是實(shí)驗(yàn)室新篩選出的黃原膠降解菌株，因其高效的黃原膠降解能力，為黃原膠降解途徑的解析及重建提供了良好的研究模型。本實(shí)驗(yàn)對來源于XT11的黃原膠側(cè)鏈修飾酶——甘露糖苷酶的表達(dá)純化和酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究，為進(jìn)一步性質(zhì)表征及酶液制備打下基礎(chǔ)。