蠅蛆抗菌肽及其在動物生產(chǎn)中的應(yīng)用

付 杰， 宋京易， 任冠朋， 朱健， 馮興軍*

（1東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；2東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

蠅蛆是蠅類的幼蟲，常年生活在非常腐敗污穢的環(huán)境中卻可以很好的生存繁衍，表現(xiàn)出極端環(huán)境下比其他動物更強(qiáng)的抵抗力，其體內(nèi)的抗菌肽起到關(guān)鍵作用。蠅類抗菌肽是由核糖體合成，并且種類繁多，在蠅類體液免疫中發(fā)揮著重要作用。相比于傳統(tǒng)抗生素，其獨(dú)特的作用機(jī)制不但不宜產(chǎn)生耐藥性，還能高效的殺滅耐藥菌株。蠅蛆抗菌肽作為飼料添加劑可以有效促進(jìn)畜禽生產(chǎn)性能、抗病力等。蠅蛆抗菌肽的開發(fā)利用對尋求飼用抗生素替代品、促進(jìn)畜牧業(yè)綠色發(fā)展具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

1 蠅蛆抗菌肽的種類

抗菌肽數(shù)據(jù)庫（APD）目前包含2961個(gè)抗菌肽，其一級結(jié)構(gòu)之間差異很大。迄今為止，已經(jīng)分離的蠅類抗菌肽多達(dá)40種。根據(jù)蠅蛆抗菌肽功能、氨基酸的組成和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，可分為5類：天蠶素類、防御素類、富含脯氨酸的抗菌肽、富含甘氨酸的抗菌肽、抗真菌肽。

1.1 天蠶素類 天蠶素是人類發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)抗菌肽，由瑞典科學(xué)家Boman等（1972）從惜古比天蠶的血淋巴中分離得到。主要特征是N、C端存在兩性的α螺旋結(jié)構(gòu)，不含半胱氨酸（Cys），不能形成分子內(nèi)二硫鍵，也被稱為線性α螺旋肽，熱穩(wěn)定性和酶穩(wěn)定性很高。表1是目前已發(fā)現(xiàn)的蠅蛆天蠶素類抗菌肽，一般由30～42個(gè)氨基酸殘基組成，分子質(zhì)量約為5 kD，其中N端富含強(qiáng)堿性氨基酸呈強(qiáng)堿性，C末端富含疏水氨基酸構(gòu)成疏水區(qū)，此外C端氨基酸多數(shù)酰胺化，這可能與其抗菌活性有關(guān)（Yi等，2014），此類抗菌肽一般對革蘭氏陰性和革蘭氏陽性都有抑制作用，可抑制真菌的較少，只在黑腹果蠅體內(nèi)提取的Cecropin A，B（Ekengren等，1999）和在廄螫蠅體內(nèi)提取的Stonoxyn（Boulanger等，2002）對真菌具有抑制作用。

表1 蠅蛆天蠶素類抗菌肽

1.2 防御素類 蠅蛆防御素抗菌肽典型特點(diǎn)是由一個(gè)α螺旋和反向平行的β折疊構(gòu)成，富含6個(gè)保守的半胱氨酸，構(gòu)成多個(gè)C-O-O-O-O-C或C-O-C類結(jié)構(gòu)（O是任意氨基酸），通過分子內(nèi)形成的三個(gè)二硫鍵使α螺旋更加穩(wěn)定，其中兩個(gè)連接C端的α螺旋和β折疊，第三個(gè)連接N端環(huán)和第二個(gè)β折疊（Koehbach等，2017）。表2是目前已發(fā)現(xiàn)的蠅蛆防御素類抗菌肽，氨基酸殘基數(shù)一般為34～46，陽離子型，分子質(zhì)量為4～6 kD，主要作用于革蘭氏陽性菌，對革蘭氏陰性細(xì)菌、真菌及真核細(xì)胞沒有明顯殺傷力。但發(fā)現(xiàn)在廄螫蠅（Lehane 等，1997）產(chǎn)生的 Smd1、Smd2 和褐尾麻蠅 （Matsuyama等，1988）體內(nèi)產(chǎn)生的Sapecin A，B對革蘭陰性菌起到抑制作用。

表2 蠅蛆防御素類抗菌肽

1.3 富含脯氨酸的抗菌肽 已發(fā)現(xiàn)的此類抗菌肽相對較少，分子質(zhì)量為1.5～4 kD，氨基酸組成為10～30，不僅脯氨酸含量很高（25%以上），而且部分精氨酸的含量也比較高。表3是目前發(fā)現(xiàn)的富含脯氨酸的蠅蛆抗菌肽。其對革蘭氏陰性菌的作用明顯高于陽性菌，宮霞等 （2009）在研究MDL-2對細(xì)胞膜的通透性時(shí)發(fā)現(xiàn)，作用于大腸桿菌120 min時(shí)滲透率達(dá)50%，金葡萄球菌僅26%，當(dāng)240 min時(shí)，大腸桿菌的滲透率達(dá)100%，金葡萄球菌僅有66%。此類抗菌肽根據(jù)氨基酸數(shù)目一般分為長鏈和短鏈兩種，長鏈的如家蠅Diptericin（79AA）（柳峰松等，2009）、MDL-2（106AA）（宮霞等，2009）；短鏈的如從家蠅中分離純化出MD-pep9，只含有 9個(gè)氨基酸（唐麗亞，2009）。

表3 蠅蛆富含脯氨酸類抗菌肽

1.4 富含甘氨酸的抗菌肽 此類蠅蛆抗菌肽也相對較少，一般半胱氨酸含量很少或沒有，不形成二硫鍵，其一級結(jié)構(gòu)中富含甘氨酸（10%～22%），有些肽鏈的某一區(qū)域全是甘氨酸（Gly）。目前在桔小實(shí)蠅、家蠅等發(fā)現(xiàn)此類抗菌肽存在（表4）。陸婕等（2010）從果蠅蛆中分離純化的SK84，分子質(zhì)量9338 Da，含有13個(gè)甘氨酸占15.5%，其中在13～18位點(diǎn)構(gòu)成連續(xù)的6個(gè)甘氨酸域；黨向利等（2012）從桔小實(shí)蠅蛹中分離出Bactrocerin-1和Bactrocerin-2，分子質(zhì)量僅有2.3 kD，是目前已知蠅類富含甘氨酸中最小的，均含有20個(gè)氨基酸，其甘氨酸含量分別為15%和10%。此外，陸婕等（2006）從蠅蛆中鑒定出的MD7095也富含甘氨酸，是目前發(fā)現(xiàn)的少有的陰離子型抗菌肽之一。

表4 蠅蛆富含甘氨酸類抗菌肽

1.5 抗真菌肽 此類抗菌肽大多數(shù)在結(jié)構(gòu)可分為上述四類結(jié)構(gòu)，但上述四類絕大多數(shù)只對細(xì)菌具有顯著的抑制作用，而對真菌無明顯作用，而此類抗菌肽一般對細(xì)菌、真菌都有廣譜高效抑制作用，故單獨(dú)分類。Lijima等（1993）從麻蠅血淋巴中分離純化出第一個(gè)抗真菌肽AFP-1，含有67個(gè)氨基酸，其中45個(gè)是甘氨酸和組氨酸（His），比例高達(dá)51%，在鹽溶液和蒸餾水中顯示出高效的殺真菌活性，但只有與呋喃西林聯(lián)合作用才抑制白色念珠菌的生長。Gao等（2017）從家蠅蛆中分離出MAP17，含有143個(gè)氨基酸殘基，是目前少有的大分子抗菌肽之一，對白色念珠菌也起到抑制作用。除此之外，目前在蠅類發(fā)現(xiàn)的抗真菌肽還包括 drosomycin （Fehlbaum 等，1994） 和 Metchnikowin（Levashina 等，1995）

2 蠅蛆抗菌肽的體外功能

2.1 抗菌 目前已發(fā)現(xiàn)的所有蠅類抗菌肽，對革蘭氏陽性或陰性菌都有一定程度的抑制或殺滅作用，少數(shù)對真菌也有一定的抑制作用。鄭學(xué)禮等（2007）通過針刺誘導(dǎo)家蠅蛆淋巴液產(chǎn)生的抗菌蛋白，對多種革蘭氏陽性或陰性菌具有顯著的抑制作用，并且聯(lián)合氨芐青霉素，顯著加強(qiáng)了家蠅血淋巴對白色葡萄球菌的抑制作用，當(dāng)聯(lián)合抗真菌藥物氟康唑時(shí)對酵母的抑制作用也顯著提高，表明抗生素和蠅蛆抗菌肽聯(lián)合用藥具有協(xié)同作用。此外 Feng 等（2015）和 PёOppel等（2015）發(fā)現(xiàn)，抗生素和抗菌肽聯(lián)合用藥或者多種不同AMPs組合可顯著增強(qiáng)對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌抗菌活性，降低最小抑菌濃度，并有助于預(yù)防或延緩抗生素耐藥性的出現(xiàn)。

研究表明，家蠅抗菌肽對大腸埃希氏菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌等多種臨床上易產(chǎn)生耐藥性的病原菌有明顯的抑制作用，蠅蛆AMPs若能被充分的發(fā)掘和利用，這將會在治療臨床感染性疾病，尤其在治療耐藥菌感染的疾病中起到關(guān)鍵性作用（周義文等，2004）。

2.2 抗腫瘤 近年來，蠅蛆抗菌肽的抗癌作用也是一個(gè)研究熱點(diǎn)。蠅類抗菌肽能特異性抑制某些腫瘤細(xì)胞，而對正常哺乳動物細(xì)胞無不良作用。Akiyama等（2000）發(fā)現(xiàn)蠅類抗菌肽對小鼠移植的乳腺癌細(xì)胞有顯著的抑制作用；陸婕（2010）提取的家蠅蛆富含甘氨酸的SK84抗菌肽，對THP-1、MCF-1、HepG2等癌癥細(xì)胞具有明顯的抑制作用。使用掃描電鏡發(fā)現(xiàn)35μM的SK84處理人白血病THP-1細(xì)胞24 h后，癌細(xì)胞膜發(fā)生破壞，推測SK84通過柔性的N-端富含甘氨酸的區(qū)域形成彈性結(jié)構(gòu)來干擾細(xì)胞膜。金小寶等（2011）通過激光共聚技術(shù)和掃描電鏡觀察蠅蛆抗菌肽Cecropins作用后的人源性肝癌細(xì)胞BEL-7402，發(fā)現(xiàn)BEL-7402細(xì)胞膜表面微絨毛消失，Cecropin與BEL-7402細(xì)胞膜結(jié)合，部分Cecropin會連續(xù)不斷穿過細(xì)胞膜到達(dá)細(xì)胞內(nèi)部，引起細(xì)胞凋亡。程璟俠等 （2012）發(fā)現(xiàn)蠅類抗菌肽存在質(zhì)量濃度閾值，只有在高濃度作用下，慢性髓性白血病K562細(xì)胞膜才發(fā)生損傷，從而抑制K562細(xì)胞的生長。此外，焦莉萍（2013）發(fā)現(xiàn)蠅蛆抗菌肽MD可使肝癌細(xì)胞HepG2在G1期停滯，且不能進(jìn)入S期，從而抑制S期DNA合成，表明其作用方式可能是通過影響細(xì)胞周期從而抑制HepG2的生長。

2.3 抗病毒 研究證實(shí)，抗菌肽結(jié)合病毒粒子，從而抑制病毒的繁殖和生長。Chernysh等（2002）從紅頭麗蠅蛆血淋巴中分離純化出抗病毒肽Alloferon1，小鼠體內(nèi)試驗(yàn)證明，Alloferon1對肝炎病毒、甲型、乙型流感病毒和慢性髓性白血病K562細(xì)胞有明顯的抑制作用；Alloferon1可通過誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生干擾素（IFN）和激活自然殺傷細(xì)胞（NK），從而抑制病毒的代謝過程，阻斷病毒吸附于機(jī)體細(xì)胞，提高了機(jī)體免疫力。艾輝等（2013）提取的蠅蛆清蛋白在0.5 mg/mL的低濃度下對禽流感病毒H9N2（AIV）、首稽銀蚊夜蛾核型多角體病毒（AcMNPV）和家蠶核型多角體病毒（BmNPV）有高抗病毒活性。王芙蓉等（2006）發(fā)現(xiàn)15μL的家蠅幼蟲抗菌肽粗提液對流感病毒的抑制率為72.41%，而30μL劑量組對病毒的殺滅率達(dá)到80%以上。這些抗病毒試驗(yàn)表明，蠅類抗菌肽有潛力成為天然抗病毒藥物開發(fā)的良好來源。

2.4 調(diào)節(jié)免疫與消炎 抗菌肽的作用不僅在于直接殺滅入侵機(jī)體的病原微生物，而且能夠在機(jī)體免疫反應(yīng)過程的不同時(shí)期表現(xiàn)出強(qiáng)大作用。

絕大多數(shù)的蠅蛆抗菌肽都是陽離子型抗菌肽，通過靜電吸附作用與帶有負(fù)電荷的免疫原聚合，抑制其抗原性，阻斷其對機(jī)體的免疫刺激。抗菌肽在機(jī)體內(nèi)可中和脂多糖（LPS），降低其毒性作用，還可以抑制生物體內(nèi)炎癥因子的產(chǎn)生，減輕炎癥反應(yīng)（張曉宇等，2017）。此外，蠅類抗菌肽還能促進(jìn)宿主天然免疫的其他反應(yīng)，如Ai等（2013）發(fā)現(xiàn)蠅蛆抗菌肽能促進(jìn)小鼠免疫器官的生長，在非特異性免疫中顯著增強(qiáng)了吞噬細(xì)胞 （中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞）的吞噬作用和血清溶血活性，在特異性免疫中顯著促進(jìn)小鼠脾臟刀豆蛋白A和未活化的T淋巴細(xì)胞、LPS誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞增殖。

2.5 其他功能 蠅蛆抗菌肽具有廣譜的抗菌活性、抗病毒、抑制或殺滅腫瘤細(xì)胞，廣泛參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)功能，還具有機(jī)體抗氧化 （Ai等，2009）、抗動脈粥樣硬化（Chu 等，2011）、肝保護(hù)（Wang等，2007）等多種生物學(xué)功能。

3 蠅蛆抗菌肽的誘導(dǎo)與分離純化

蠅蛆抗菌肽的分離純化是深入研究其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的基礎(chǔ)與前提。但對未知蠅蛆抗菌肽的分離純化難度很大，過程復(fù)雜。在分離純化過程中，首先要保證蠅蛆抗菌肽的活性，其次要保證所分離組分單一。目前，蠅蛆抗菌肽分離純化的原則是維持其生物活性，充分利用其物理化學(xué)及生物學(xué)性質(zhì)（如分子量、熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、電荷特征、疏水性等）的不同設(shè)計(jì)純化技術(shù)方案。

3.1 誘導(dǎo)蠅蛆抗菌肽的表達(dá) 蠅蛆抗菌肽分子量小，含量通常在微克級。一般采用體外誘導(dǎo)的方式促使其免疫體系做出應(yīng)答，從而表達(dá)出大量的蠅蛆抗菌肽。目前蠅蛆抗菌肽的誘導(dǎo)方式主要有體壁損傷、熱激、針刺誘導(dǎo)、超聲誘導(dǎo)、帶菌針刺誘導(dǎo)、細(xì)菌培養(yǎng)法。但不同的誘導(dǎo)源產(chǎn)生的抗菌活性有明顯的差別，適當(dāng)刺激有助于抗菌活性的增強(qiáng)，過度刺激不能增強(qiáng)活性，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)多種刺激源相結(jié)合比單一刺激源刺激更有助于抗菌肽的表達(dá)（黃偉光，2011）。眾多研究表明，蠅蛆抗菌肽的誘導(dǎo)表達(dá)量除了與誘導(dǎo)源有關(guān)，還與誘導(dǎo)處理時(shí)間有關(guān)。安春菊（2004）在探究誘導(dǎo)最佳時(shí)間時(shí)，設(shè)置6、12、24、48、65 h 五個(gè)組別， 發(fā)現(xiàn)其抗菌活性表現(xiàn)出明顯差異。這些研究表明，蠅蛆抗菌肽誘導(dǎo)表達(dá)需要最佳刺激強(qiáng)度和時(shí)間。

3.2 蠅蛆抗菌肽的分離純化

3.2.1 蠅蛆抗菌肽的初提目前蠅蛆抗菌肽的初步提取是依據(jù)其理化性質(zhì)，通常采用適當(dāng)?shù)奶崛∫簩⒔M織勻漿浸提，高速離心、熱處理、酸堿處理、超濾、透析、硫酸銨沉淀法和等電點(diǎn)沉淀法等對樣品進(jìn)行初步分離。通過初步處理能除去樣品中大分子、熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性不好的蛋白質(zhì)，同時(shí)也除去了脂肪和顆粒物。但蠅蛆抗菌肽粗提物除含有抗菌肽成分外，其他大部分為其他種類的多肽及蛋白質(zhì)分子，要獲得具有生物學(xué)功能的抗菌肽分子，需進(jìn)一步分離純化。

3.2.2 蠅蛆抗菌肽的精提蠅蛆抗菌肽粗提物一般通過分子篩、離子交換色譜等方法進(jìn)一步分離。其原理分別是利用蠅蛆抗菌肽和其他雜質(zhì)的分子量和帶電情況的差異。分離純化的蠅蛆抗菌肽純度鑒定一般采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酞胺凝膠電泳（SDS-PAGE）、等電聚焦電泳（IEF）和毛細(xì)管電泳（CE）。如分離純化的酸性抗菌肽SK84，其分離純化步驟為：沸水浴處理10min，稀醋酸低溫浸提—海藻酸吸附—酸處理低溫洗脫—鹽析結(jié)晶—Sephadex G25凝膠過濾—弱陽離子交換柱層析—反向高效液相色譜—SDS-PAGE鑒定 （陸婕等，2010）。冉林等（2017）通過稀醋酸冰浴浸提—熱處理—高速離心—真空凍干—凝膠過濾色譜Sephadex G-50柱分離—陽離子交換樹脂CMSepharose Fast Flow柱吸附分離—凝膠過濾色譜Sephadex G25柱脫鹽、分離—反相高效液相色譜分離純化，分離出單一活性組分，分子量質(zhì)2570 D。唐麗亞（2009）基于細(xì)胞膜結(jié)合原理建立了一種分離蠅蛆抗菌肽的方法，利用抗菌肽與細(xì)菌細(xì)胞膜之間的結(jié)合的屬性，通過凝膠過濾比較與細(xì)菌結(jié)合的和未結(jié)合的蠅蛆干粉粗提物的洗脫峰，快速、準(zhǔn)確的找到目標(biāo)蠅蛆抗菌肽，最后通過反向高效液相色譜純化，分離出MDpep5、MDpep9兩個(gè)蠅蛆抗菌肽，從而擺脫了一般分離技術(shù)的多步層析和電泳聯(lián)用技術(shù)的繁瑣，步驟相對簡單，蠅蛆抗菌肽活性得以良好地保持。

4 蠅蛆抗菌肽在動物生產(chǎn)中的應(yīng)用

蠅蛆體內(nèi)存在高表達(dá)量的抗菌肽，目前國內(nèi)外通過將家蠅蛆或蠅蛆粉應(yīng)用于動物生產(chǎn)，在預(yù)防、治療動物疾病和促進(jìn)動物體生長性能方面取得了不錯(cuò)的效果。

4.1 單胃動物

4.1.1 豬由于仔豬腸道正處于發(fā)育階段，消化酶系發(fā)育不完善，消化功能不健全，自身免疫低下，體溫調(diào)節(jié)機(jī)能差，斷奶后會出現(xiàn)一系列問題，如采食量下降，抵抗力下降、生長受阻、腹瀉等。其中腹瀉是造成豬業(yè)經(jīng)濟(jì)損失的重要因素（彭凱等，2015）。郭禮榮等（2013）在仔豬飼喂期全程添加1%的蠅蛆抗菌肽，結(jié)果顯示試驗(yàn)組生長速度明顯提高，在斷奶28 d，蠅蛆抗菌肽飼喂組比對照組多增重500 g，仔豬的腹瀉率顯著低于對照組，料肉比顯著降低。

4.1.2 雞眾多研究表明，抗菌肽部分或全部取代抗生素作為飼料添加劑可有效提高雞的生產(chǎn)性能和機(jī)體免疫力。表5列舉了一些蠅蛆抗菌肽在雞養(yǎng)殖中的應(yīng)用情況。

表5 蠅蛆抗菌肽在雞養(yǎng)殖中的應(yīng)用

4.2 牛奶牛乳腺炎是乳腺組織由于病原微生物入侵引起的的炎癥，是影響奶牛生產(chǎn)的重要因素。鄒鋒（2007）通過外敷蠅蛆抗菌肽凝膠制劑治療奶牛乳腺炎，對臨床型乳房炎治愈率達(dá)到60%，有效率（包括治愈和好轉(zhuǎn)）高達(dá)85%，與青、鏈霉素合用時(shí)有效率高達(dá)100%，其治愈率和有效率均高于其他給藥組。治療隱形乳房炎治3 d時(shí)治愈率達(dá)到74%，總有效率達(dá)到88%，外敷第7天時(shí)治愈率高達(dá)90%，有效率94%，表明蠅蛆抗菌肽對兩種奶牛乳房炎均有高效的治愈率。研究表明蠅蛆抗菌肽可以成為在規(guī)?；膛鲋兄委熌膛Ｈ榉垦椎挠行緩健?/p>

4.3 水產(chǎn)動物隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖集約化和養(yǎng)殖模式工廠化的快速發(fā)展，養(yǎng)殖疾病逐年提高，水體生態(tài)逐年惡化，抗生素等藥物殘留和耐藥病菌等問題逐年突出。抗菌肽作為新型高效無殘留的飼料添加劑，可以有效的解決這類問題，并提高水產(chǎn)動物的抵抗力、免疫力和增重率，保證水產(chǎn)品質(zhì)量。對蝦白斑綜合征病毒（WSSV）是目前已知所有對蝦病毒中毒害能力最強(qiáng)、危害最大的病毒之一。李林等（2015）在基礎(chǔ)飼料中按比例添加4種不同濃度的抗菌肽提取物，結(jié)果顯示，在40、80 mg/kg濃度相對保護(hù)率達(dá)到42.42%、33.33%，顯著降低了凡納濱對蝦感染W(wǎng)SSV后的累積死亡率。陳冰等（2010）研究發(fā)現(xiàn)蠅蛆抗菌肽可促進(jìn)凡納濱對蝦體礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)代謝，改善對蝦的營養(yǎng)品質(zhì)，顯著提高對蝦的成活率、增重率、特定生長率和飼料效率。陳紅等（2015）研究結(jié)果表明飼料中添加適量蠅蛆抗菌肽，可促進(jìn)日本鰻鱺幼鰻的生長，提高其成活率，降低養(yǎng)殖成本。同時(shí)蠅蛆抗菌肽在黃穎魚（陳平潔等，2007）和鳙魚中（丘繼新等，2014）的應(yīng)用也取得了良好的結(jié)果。

5 展望

在自然界中蠅蛆數(shù)量繁多，培養(yǎng)條件簡單易行，其體內(nèi)存在高表達(dá)量的抗菌肽。相比于傳統(tǒng)抗生素，抗菌肽抗菌譜廣，不宜產(chǎn)生耐藥性，對耐藥菌也有殺傷作用。未來如能對蠅蛆抗菌肽的提取、結(jié)構(gòu)、功能和作用機(jī)制深入研究，為規(guī)模化提取或科學(xué)人工合成抗菌肽提供依據(jù)，從而為其在醫(yī)療、食品和畜牧業(yè)中代替抗生素提供有效可行的解決方案。