氧化應(yīng)激時(shí)PeroxiredoxinⅡ膜質(zhì)轉(zhuǎn)移對(duì)紅細(xì)胞滲透脆性的影響

于佳斌,盧 悅,張津松,韓英浩

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,中國(guó)黑龍江大慶163319)

機(jī)體正常新陳代謝會(huì)產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species,ROS),由于機(jī)體存在抗氧化機(jī)制,氧化-還原系統(tǒng)相對(duì)平衡,因此產(chǎn)生的ROS并不會(huì)影響機(jī)體功能[1,2]。當(dāng)機(jī)體受到多種有害刺激,體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)多的ROS不能得到及時(shí)清除時(shí),會(huì)引起氧化-還原系統(tǒng)失衡,ROS過(guò)度累積可導(dǎo)致機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)[3～5]。紅細(xì)胞是血液系統(tǒng)中最豐富、最重要的血細(xì)胞之一,由于機(jī)體時(shí)刻都處于運(yùn)輸氧的過(guò)程,在此過(guò)程中氧合血紅蛋白的2價(jià)鐵離子失去1個(gè)電子變成3價(jià)的高鐵血紅蛋白,并產(chǎn)生1個(gè)超氧陰離子,從而使紅細(xì)胞處于氧化環(huán)境[6]。紅細(xì)胞中存在抗氧化系統(tǒng),可以保證其在氧化環(huán)境中正常行使功能,而一旦抗氧化系統(tǒng)出現(xiàn)問(wèn)題,細(xì)胞膜蛋白就容易因受到ROS攻擊而受損,進(jìn)一步影響紅細(xì)胞滲透脆性等生理功能。膜蛋白具有維持細(xì)胞骨架正常功能和膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的重要作用,紅細(xì)胞的滲透脆性是體現(xiàn)紅細(xì)胞抗壓能力的重要指標(biāo)[7],滲透脆性的改變是紅細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常的集中表現(xiàn)[8,9],臨床用紅細(xì)胞滲透脆性來(lái)作為溶血性貧血等血液疾病的初步診斷指標(biāo),可間接反映細(xì)胞膜有無(wú)異常。紅細(xì)胞膜是雙層磷脂結(jié)構(gòu),其間鑲嵌著多種膜蛋白,根據(jù)膜蛋白功能的不同,可將其分為整合蛋白、骨架蛋白、錨定蛋白。紅細(xì)胞特有的柔韌性和變形性源自其本身的膜蛋白和細(xì)胞骨架的特點(diǎn)。帶3蛋白(band 3)是整合蛋白的代表性蛋白質(zhì),與紅細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定、變形能力有緊密的聯(lián)系[10,11];血影蛋白(spectrin)是一種細(xì)胞骨架蛋白,對(duì)維持細(xì)胞骨架的穩(wěn)定、結(jié)構(gòu)、功能起著重要作用[12]。Band 3和spectrin作為最重要的整合蛋白和細(xì)胞膜骨架蛋白,在維持紅細(xì)胞的正常形態(tài)、變形性、骨架蛋白功能中起著不可或缺的作用。當(dāng)機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí),抗氧化系統(tǒng)出現(xiàn)問(wèn)題的紅細(xì)胞極易受到影響,出現(xiàn)滲透脆性增加、band 3和spectrin等關(guān)鍵膜蛋白從紅細(xì)胞膜上降解、骨架蛋白功能受損等現(xiàn)象,導(dǎo)致紅細(xì)胞穩(wěn)定性降低,增加血液疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[13]。

Peroxiredoxins(Prxs)是一類(lèi)抗氧化蛋白質(zhì),可以保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷[4,14]。Prxs家族有6個(gè)成員,分別是PrxⅠ～PrxⅥ,它們廣泛分布于哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)[15]。有研究顯示其6個(gè)成員中,僅PrxⅡ在細(xì)胞膜上表達(dá)[16],并且PrxⅡ基因敲除鼠出現(xiàn)溶血性貧血的表型[17]。PrxⅡ作為紅細(xì)胞中除血紅蛋白和碳酸酐酶外含量最為豐富的蛋白質(zhì),具有保護(hù)紅細(xì)胞免受氧自由基損害的生理功能[18]。

本研究通過(guò)比較PrxⅠ、PrxⅡ在紅細(xì)胞中的表達(dá)含量,利用Western-blot、滲透脆性實(shí)驗(yàn)等方法對(duì)氧化應(yīng)激時(shí)紅細(xì)胞的滲透脆性、PrxⅡ蛋白的膜質(zhì)轉(zhuǎn)移、膜穩(wěn)定蛋白、骨架蛋白的相應(yīng)變化進(jìn)行檢測(cè),探究了氧化應(yīng)激時(shí)PrxⅡ的膜質(zhì)轉(zhuǎn)移與紅細(xì)胞滲透脆性之間的關(guān)系,為溶血性貧血的預(yù)防和治療提供了理論基礎(chǔ)和治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

重組PrxⅠ、PrxⅡ蛋白 (上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司);磷酸鹽緩沖液(PBS,pH 7.2,美國(guó)Hy-Clone 公司);3%(V/V)H2O2、Tris、過(guò)硫酸銨、甲叉雙丙烯酰胺(Sigma公司,美國(guó));硫脲、尿素、Chaps(北京博奧拓達(dá)科技有限公司);抗PrxⅠ第一抗體、抗PrxⅡ第一抗體、抗band 3第一抗體、抗spectrin第一抗體、抗β-actin第一抗體、鼠源第二抗體、兔源第二抗體(Santa公司,美國(guó));生理鹽水(吉林省都邦藥業(yè)股份有限公司);Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒(北京雷根生物技術(shù)有限公司)。

1.2 主要儀器設(shè)備

Infinite M200pro酶標(biāo)儀購(gòu)自帝肯(上海)貿(mào)易有限公司;垂直板電泳槽購(gòu)自通用電氣醫(yī)療系統(tǒng)貿(mào)易發(fā)展(上海)有限公司;穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀購(gòu)自上海天能儀器廠;小型臺(tái)式冷凍離心機(jī)為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品;化學(xué)免疫熒光成像系統(tǒng)為美國(guó)GE公司產(chǎn)品;抗凝管購(gòu)自三力有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

129/SvJ野生型8周齡小鼠,由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)疾病模式動(dòng)物研究中心提供。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 小鼠眼眶取血

取周齡為8周的129/SvJ野生型小鼠進(jìn)行眼眶靜脈叢取血。采血者的左手拇指和食指從小鼠背部握住小鼠頸部,使其頭部固定,拇指和食指壓迫小鼠頸部?jī)蓚?cè),使右側(cè)眼球突出,眼眶后側(cè)靜脈叢充血,此時(shí)將毛細(xì)管以45°夾角旋轉(zhuǎn)刺入小鼠眼眶后側(cè),插入深度2～3 mm,取血同時(shí)放松手指,使血液順利流進(jìn)抗凝管,取血200 μL[19]。

1.4.2 H2O2濃度選擇及配制

大量研究表明,過(guò)多的氧自由基可引發(fā)紅細(xì)胞過(guò)氧化,導(dǎo)致紅細(xì)胞氧化損傷[20～22]。過(guò)氧化氫(H2O2)是活性氧的一種,體外實(shí)驗(yàn)中,H2O2是制造紅細(xì)胞氧化損傷的理想試劑,根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,H2O2誘導(dǎo)氧化損傷模型濃度一般控制在100～500 μmol/L之間,其中選用200 μmol/L較為廣泛[23,24],所以本文中選用200 μmol/L H2O2處理紅細(xì)胞30 min誘導(dǎo)紅細(xì)胞的氧化損傷。

將2 μL 3%H2O2加到8.8 mL生理鹽水中,配制成終濃度為200 μmol/L的H2O2溶液。

1.4.3 滲透脆性實(shí)驗(yàn)

梯度稀釋法制備不同濃度的生理鹽水[25]。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組,取8周齡129/SvJ野生型小鼠抗凝血液100 μL加入1.5 mL離心管中,1 467 g離心10 min,將上層透明的淡黃色血漿吸出棄去,加入1 mL 0.9%生理鹽水,1 467 g離心10 min,洗滌2～3次,至上清澄清,對(duì)照組取20 μL紅細(xì)胞加入1 mL 0.9%生理鹽水中,實(shí)驗(yàn)組取20 μL紅細(xì)胞加入1 mL 200 μmol/L H2O2溶液中,制成2%的紅細(xì)胞懸液,處理30 min,再?gòu)?%的紅細(xì)胞懸液中各取20 μL放入200 μL各濃度的NaCl溶液中,輕搖混勻,1 467 g離心5 min,取上清150 μL加到96孔板中,酶標(biāo)儀測(cè)定A540nm值,計(jì)算溶血率[26]。

1.4.4 紅細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)制備

取8周齡129/SvJ野生型小鼠抗凝血液400 μL加入1.5 mL離心管中,1 467 g離心5 min,將上層透明的淡黃色血漿吸出棄去,加入1 mL磷酸鹽緩沖液,1 467 g離心5 min,去上清,洗滌2～3次。將紅細(xì)胞平均分為兩組,對(duì)照組加入1 mL磷酸鹽緩沖液,實(shí)驗(yàn)組加入1 mL 200 μmol/L H2O2,處理30 min,處理后1 467 g離心5 min,洗滌1次,加入1 mL PB(phosphate buffer,pH=8.0)溶液,8 802 g離心10 min,分離上清及沉淀。上清液含有細(xì)胞質(zhì),留下備用;沉淀反復(fù)洗滌5～8次,至上清不再渾濁,棄上清,留細(xì)胞膜備用[27,28]。

1.4.5 Bradford法測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線

參照Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒,分別取重組PrxⅠ、PrxⅡ蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品按不同濃度稀釋,加入1 mL考馬斯亮藍(lán),混勻,用分光光度計(jì)測(cè)定595 nm處的吸光值,記錄數(shù)值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.6 蛋白質(zhì)免疫印跡分析

正常飼養(yǎng)129/SvJ野生型小鼠至8周齡,小鼠眼眶取血液200 μL,抗凝,分為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組為H2O2處理的紅細(xì)胞,對(duì)照組為正常紅細(xì)胞,利用方法1.4.4制備兩組細(xì)胞膜以及細(xì)胞質(zhì),取實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)各100 μL,加入 20 μL 裂解液以及 30 μL 5× buffer,混勻,100℃變性5 min,進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳,每孔加入變性蛋白質(zhì)15 μL,電泳后電轉(zhuǎn)移至NC膜上,室溫封閉1 h,紅細(xì)胞總蛋白質(zhì)按1∶1 000比例孵育Prx I、PrxⅡ蛋白質(zhì)一抗;細(xì)胞膜蛋白質(zhì)按 1∶1 000比例孵育 PrxⅡ、band 3、spectrin蛋白質(zhì)一抗;細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)按1∶1 000比例孵育PrxⅡ蛋白質(zhì)一抗,4℃過(guò)夜,加入1∶2 000的相應(yīng)二抗稀釋液,室溫孵育2 h,ECL發(fā)光顯影,使用TINA20分析結(jié)果[18,29]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 PrxⅠ和PrxⅡ在紅細(xì)胞中的表達(dá)水平

為比較PrxⅠ與PrxⅡ在紅細(xì)胞中表達(dá)水平,取3只129/SvJ野生型小鼠紅細(xì)胞,利用West ern-blot檢測(cè)紅細(xì)胞中PrxⅠ和PrxⅡ總蛋白質(zhì)含量,根據(jù)不同濃度重組PrxⅠ、PrxⅡ蛋白標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線(PrxⅠ：y=0.000 05*OD+0.882 16;PrxⅡ：y=0.001 30*OD-5.861 23)計(jì)算紅細(xì)胞總蛋白質(zhì)中PrxⅠ、PrxⅡ含量(圖1),結(jié)果顯示,PrxⅡ在紅細(xì)胞中的含量遠(yuǎn)高于PrxⅠ,差異極顯著(P＜0.01)。

2.2 氧化應(yīng)激對(duì)紅細(xì)胞滲透脆性的影響

為檢測(cè)氧化應(yīng)激對(duì)紅細(xì)胞滲透脆性的影響,將實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組,每組各9只小鼠。對(duì)照組將紅細(xì)胞加入生理鹽水中,實(shí)驗(yàn)組將紅細(xì)胞加入H2O2溶液中,孵育30 min,隨后將孵育的紅細(xì)胞分別加入不同濃度的生理鹽水,540 nm檢測(cè)溶液吸光值。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,生理鹽水濃度為0.32%～0.52%時(shí),實(shí)驗(yàn)組紅細(xì)胞滲透脆性明顯增加且差異顯著 (*：P＜0.05,**：P＜0.01,圖2),表明氧化應(yīng)激可引起紅細(xì)胞滲透脆性升高。

2.3 氧化應(yīng)激時(shí)紅細(xì)胞中PrxⅡ的膜質(zhì)轉(zhuǎn)移

為了進(jìn)一步探究氧化應(yīng)激時(shí)紅細(xì)胞滲透脆性增加與PrxⅡ之間的關(guān)系,分別提取實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組紅細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì),利用Westernblot檢測(cè)氧化應(yīng)激時(shí)紅細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)中PrxⅡ含量的變化。結(jié)果如圖3所示,與對(duì)照組相比,H2O2處理后,PrxⅡ在紅細(xì)胞膜上的含量顯著降低(P＜0.01),在細(xì)胞質(zhì)中的含量顯著增加(P＜0.001)。結(jié)果表明,氧化應(yīng)激導(dǎo)致紅細(xì)胞膜上PrxⅡ轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中,顯示氧化應(yīng)激時(shí)紅細(xì)胞滲透脆性的改變與PrxⅡ的膜質(zhì)轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性。

2.4 氧化應(yīng)激時(shí)紅細(xì)胞膜蛋白band 3和骨架蛋白spectrin的含量變化

為了進(jìn)一步檢測(cè)氧化應(yīng)激時(shí)紅細(xì)胞膜穩(wěn)定性蛋白質(zhì)和骨架蛋白的變化,利用Western-blot檢測(cè)維持膜穩(wěn)定相關(guān)蛋白質(zhì)band 3和保證細(xì)胞骨架正常行使功能相關(guān)蛋白質(zhì)spectrin的含量,結(jié)果如圖4所示,與對(duì)照組相比,band 3和spectrin在200 μmol/L H2O2處理30 min后表達(dá)量顯著降低(P＜0.001)。結(jié)果顯示,H2O2處理紅細(xì)胞后,伴隨著PrxⅡ的膜質(zhì)轉(zhuǎn)移,與膜穩(wěn)定性和細(xì)胞骨架功能正常行使關(guān)聯(lián)緊密的蛋白質(zhì)含量在細(xì)胞膜上明顯降低,表明氧化應(yīng)激時(shí)PrxⅡ膜質(zhì)轉(zhuǎn)移影響了膜穩(wěn)定性相關(guān)蛋白質(zhì)band 3、細(xì)胞骨架蛋白spectrin在膜上的表達(dá)含量。

圖1 PrxⅠ和PrxⅡ在紅細(xì)胞中的表達(dá)水平Fig.1 The expression levels of Prxs in normal RBCs

圖2 H2O2處理后紅細(xì)胞滲透脆性的變化Fig.2 The change of osmotic fragility of red blood cells after H2O2treatment

3 討論

圖3 H2O2處理后紅細(xì)胞中PrxⅡ膜質(zhì)轉(zhuǎn)移的Westernblot檢測(cè)結(jié)果Fig.3 The expression of PrxⅡin erythrocyte membrane and cytosol after H2O2treatment

圖4 H2O2處理后紅細(xì)胞膜蛋白的變化Fig.4 The change of erythrocyte membrane proteins after H2O2treatment

在紅細(xì)胞中,PrxⅡ以二聚體、十聚體和十二面球體的結(jié)構(gòu)形式存在[30,31]。當(dāng)紅細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí),PrxⅡ蛋白之間通過(guò)二硫鍵形成二聚體,進(jìn)一步超氧化可以形成十聚體及十二面球體,從而具備與其他蛋白質(zhì)結(jié)合的能力[15]。有研究揭示十聚體的PrxⅡ可與血紅蛋白結(jié)合保護(hù)血紅蛋白在氧化應(yīng)激時(shí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定,表現(xiàn)出分子伴侶的特性[18]。PrxⅡ廣泛分布于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)和細(xì)胞膜,雖然目前尚未明確PrxⅡ是以何種結(jié)構(gòu)定位在細(xì)胞膜上,但是PrxⅡ在氧化應(yīng)激時(shí)多種結(jié)構(gòu)形式的轉(zhuǎn)變與PrxⅡ的位置分布及其與相關(guān)蛋白質(zhì)的結(jié)合能力關(guān)系密切[32]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)紅細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí),PrxⅡ從紅細(xì)胞膜上轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中,同時(shí)在生理鹽水濃度為0.32%～0.52%時(shí),紅細(xì)胞滲透脆性顯著增加,表明PrxⅡ在紅細(xì)胞膜上的表達(dá)對(duì)于紅細(xì)胞氧化應(yīng)激時(shí)保護(hù)細(xì)胞膜免受損傷具有重要的作用。下一步通過(guò)研究PrxⅡ如何定位于細(xì)胞膜上,并且以何種結(jié)構(gòu)與細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)合,對(duì)明確PrxⅡ保護(hù)紅細(xì)胞膜及氧化應(yīng)激時(shí)膜質(zhì)之間的轉(zhuǎn)移機(jī)制具有重要的意義。

ROS作為生物體新陳代謝產(chǎn)物,不僅可以破壞血紅蛋白的結(jié)構(gòu),而且能對(duì)紅細(xì)胞膜造成不可逆的損傷。Prxs是一類(lèi)具有清除細(xì)胞內(nèi)ROS能力的蛋白質(zhì)[15]。其家族成員PrxⅡ在紅細(xì)胞內(nèi)的含量?jī)H次于血紅蛋白和碳酸酐酶的含量,且具有清除紅細(xì)胞內(nèi)多余ROS的作用,因此,PrxⅡ在紅細(xì)胞膜上的表達(dá)在氧化應(yīng)激時(shí)對(duì)于穩(wěn)定膜蛋白的結(jié)構(gòu)和功能、保護(hù)紅細(xì)胞膜免受氧化損傷具有重要意義。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,PrxⅡ?qū)t細(xì)胞具有非常重要的保護(hù)作用,但PrxⅡ如何保護(hù)紅細(xì)胞膜免受氧化應(yīng)激的影響卻鮮見(jiàn)報(bào)道,本研究發(fā)現(xiàn),氧化應(yīng)激導(dǎo)致紅細(xì)胞滲透脆性增加時(shí)PrxⅡ從細(xì)胞膜大量轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)中,而且維持膜穩(wěn)定的band 3和細(xì)胞骨架蛋白spectrin顯著減少,由此可推測(cè),氧化應(yīng)激時(shí)PrxⅡ從細(xì)胞膜上轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中,使維持膜穩(wěn)定的相關(guān)蛋白質(zhì)band 3和保證細(xì)胞骨架正常行使功能的相關(guān)蛋白質(zhì)spectrin受到活性氧的攻擊而降解,最終導(dǎo)致了紅細(xì)胞滲透脆性增加。PrxⅡ氧化應(yīng)激時(shí)膜質(zhì)轉(zhuǎn)移的特性可以為溶血性貧血的治療提供理論基礎(chǔ)和相關(guān)藥物靶點(diǎn)。