藏北退化高寒草原土壤細(xì)菌和真菌多樣性分析

榮新山，何敏，王從彥*，李彥，戴志聰，梁止水，萬(wàn)凌云，郜志勇，姜坤，伍丙德，張璐，周嘉偉

1. 江蘇大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院/環(huán)境健康與生態(tài)安全研究院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2. 東南大學(xué)土木工程學(xué)院 江蘇 南京 210096；3. 青海碧城生態(tài)環(huán)境科技有限公司, 青海 西寧 810001

草原生態(tài)系統(tǒng)是全球面積最大的陸地生態(tài)系統(tǒng)，約占全球陸地面積的1/2，在全球生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定方面扮演著極其重要的角色（Reeder et al.，2002）。藏北高原擁有遼闊的天然草地資源，各類天然草地面積達(dá)4.8×106hm2，占羌塘高原（即藏北高原）土地面積的 81%和西藏自治區(qū)天然草地面積的59%，為西藏自治區(qū)的主要牧區(qū)（胡自治，2000）。然而，由于青藏高原高寒地區(qū)的氣候和地理位置具有特殊性，形成高寒草原獨(dú)有的生態(tài)特性，即結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、修復(fù)能力差、穩(wěn)定性弱，且易受外界因素干擾（白瑪玉珍，2016）。其中，高寒草原是青藏高原17種草地類型中面積最大的草地類型，但也是生態(tài)環(huán)境最為敏感和脆弱的亞類（曹櫻子等，2012）。因此，在人類因素（如過(guò)度放牧、圍欄定居、城鎮(zhèn)道路建設(shè)和野生生物資源的亂挖濫采等）和自然因素（如病蟲害、風(fēng)蝕、水蝕、凍融、氣候變化等）雙重作用下，藏北高寒草地退化程度比較高，不僅嚴(yán)重影響當(dāng)?shù)厣鐣?huì)、經(jīng)濟(jì)和環(huán)境健康與生態(tài)安全的可持續(xù)發(fā)展，而且對(duì)青藏高原以及全國(guó)的江河、氣候、生態(tài)環(huán)境均有直接和間接的多重影響（邵偉等，2008；高清竹等，2010；趙貫鋒等，2013）。

草原退化的重要標(biāo)志之一是草原土壤質(zhì)量退化，特別是土壤微生物多樣性明顯下降（邵偉等，2008；趙貫鋒等，2013）。土壤微生物是生態(tài)系統(tǒng)能量流動(dòng)和物質(zhì)循環(huán)進(jìn)程的主要參與者（Wang et al.，2017a，2017b）。作為生物圈與非生物圈物質(zhì)與能量交換的重要樞紐（單文俊等，2016），土壤微生物對(duì)生態(tài)環(huán)境的微小變化非常敏感，可提前警示生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的變化（Wang et al.，2017a）。其中，細(xì)菌和真菌共同組成超過(guò)90%的土壤微生物生物量（Rinnan et al.，2009）。因此，探究藏北退化高寒草原土壤細(xì)菌和真菌群落的多樣性和結(jié)構(gòu)組成對(duì)評(píng)價(jià)其生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能具有重要意義。

基于此，本研究運(yùn)用宏基因組學(xué)方法，基于高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)藏北退化高寒草原土壤細(xì)菌和真菌多樣性進(jìn)行對(duì)比分析。

1 研究地區(qū)概況和研究方法

1.1 研究區(qū)概況

藏北那曲地區(qū)位于西藏自治區(qū)北部，總面積3.954×105km2，占西藏自治區(qū)總面積的32.82%，孕育了長(zhǎng)江、怒江、瀾滄江等多條大江大河及藏北高原的內(nèi)流河與眾多湖泊。年平均氣溫-2.9～3.4 ℃，年平均降水298.6～708.4 mm，年蒸發(fā)量高于1500 mm，年日照時(shí)數(shù) 2400～3200 h。自然條件具有冬季寒冷且多風(fēng)沙、夏季溫度不高但日溫差大、高寒、少雨、干旱、缺氧和紫外線強(qiáng)等特點(diǎn)（高清竹等，2010；白瑪玉珍，2016）。主體土壤類型為高山草甸土，植被類型主要屬高寒草甸類型（趙玉紅等，2012）。草原是該地區(qū)生態(tài)重要性最高、面積最大的生態(tài)系統(tǒng)（高清竹等，2010），但該地區(qū)未退化的草原面積占比已低于50%，其中輕度退化草原占比約30%，中度退化草原占比約15%，而重度或極重度退化草原占比約 10%，且草原退化速度每年達(dá)3%～5%（白瑪玉珍，2016）。

1.2 土壤樣品采集

取樣地位于那曲地區(qū)申扎縣約10 km的藏北退化高寒草原（30°55′～30°56′N，88°37′～88°38′E）。采用五點(diǎn)混合取樣法采集土壤樣品，取樣深度為0～10 cm，3次重復(fù)。首先，隨機(jī)選取5個(gè)10 m×10 m的樣區(qū)，將每一樣區(qū)平均分為九格，然后在中間一格以及任意周邊兩格采集3份土壤樣品，而后將每一樣區(qū)采集的3份土壤樣品進(jìn)行均勻化處理后形成一份總的土壤樣品。本試驗(yàn)共收集5份土壤樣品。去除土壤樣品中的根系、碎石等雜物后將土壤樣品裝入滅菌的封口聚乙烯袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室，于-20 ℃保存，以進(jìn)行后續(xù)處理。

1.3 土壤化學(xué)成分組成和土壤粒徑分布分析

土壤化學(xué)成分組成委托玄武巖纖維生產(chǎn)及應(yīng)用技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心進(jìn)行分析，分析方法為全譜直讀等離子光譜分析法。土壤粒徑分布采用篩分法進(jìn)行分析。

1.4 土壤細(xì)菌和真菌多樣性分析

土壤細(xì)菌和真菌多樣性委托北京百邁客生物科技有限公司以高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行測(cè)定分析，并進(jìn)一步利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)土壤細(xì)菌（16S rDNA V3和 V4 區(qū)域）（Hugerth et al.，2014）和真菌（ITS1區(qū)域）（Shi et al.，2014）群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)比分析。

1.5 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用IBM SPSS Statistics（version 22.0；IBM Corp.，Armonk，NY，U.S.A.）進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，其中數(shù)據(jù)指標(biāo)間的差異水平采用One-way ANOVA分析（3組及以上數(shù)據(jù)指標(biāo)間的差異水平采用Student-Newman-Keuls test多重比較進(jìn)行分析），顯著性水平均設(shè)置為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤化學(xué)成分組成和土壤粒徑分布

藏北退化高寒草原土壤化學(xué)成分組成以 SiO2為主，占比為63.5%（圖1）。

圖1 土壤化學(xué)成分組成Fig. 1 Soil chemical composition

藏北退化高寒草原土壤顆粒粒徑分布介于10～0.1 mm之間，其中介于5～1 mm之間土壤顆粒占比為51%（圖2）。

2.2 土壤細(xì)菌和真菌多樣性分析

藏北退化高寒草原土壤中，細(xì)菌的多樣性（以Shannon’s diversity index表征）、豐富度（以O(shè)TU richness表征）和相對(duì)豐度（以 ACE index(Abundance-based coverage estimator)和Chao1 index表征）均顯著高于真菌（P＜0.0001；圖3）。

在門分類級(jí)別，放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）和酸桿菌門（Acidobacteria）是相對(duì)豐度最高的3類土壤細(xì)菌種類（P＜0.05），占比分別為44.9%、16.4%和14.5%（圖4a）；而子囊菌門（Ascomycota）、其他類（Other）和擔(dān)子菌門（Basidiomycota）是相對(duì)豐度最高的 3類土壤真菌種類（P＜0.05），占比分別為71.5%、14.3%和8.3%（圖4b）。

圖2 土壤顆粒級(jí)配曲線示意圖Fig. 2 Diagram of soil particle grading curven=3

3 討論

由于嚴(yán)酷的水熱條件、強(qiáng)烈的風(fēng)化和微弱的生物作用等，藏北高寒草原形成了具有原始性和粗骨性等諸多特點(diǎn)的高山草原土（董玉祥，2001），而這些土壤是在疏松的殘坡積物、洪積物、沖洪積物、湖積物和冰積物等沉積物基礎(chǔ)上形成的，含沙量比較豐富，物理性沙礫含量高達(dá) 70.44%（董玉祥，2001）。本研究結(jié)果也表明，SiO2是藏北退化高寒草原土壤的主要化學(xué)組成成分，且土壤顆粒粒徑分布介于10～0.1 mm之間，其中介于5～1 mm之間的土壤顆粒占比高達(dá)51%。因此，在藏北特殊的高寒自然條件下，土壤礦物風(fēng)化程度低、粗骨性強(qiáng)、石礫含量高（范宇等，2006）。

圖3 土壤細(xì)菌和真菌α多樣性差異比較Fig. 3 Differences in the alpha diversity of soil bacterial and fungal communities

圖4 土壤細(xì)菌（A）和真菌（B）群落在門分類級(jí)別上的相對(duì)豐度差異比較Fig. 4 Differences in the relative abundance of soil bacterial (Subgraph A) and fungal (Subgraph B) community proportions at the phylum level

相關(guān)研究表明，青藏高原高寒草原土壤細(xì)菌的數(shù)量顯著高于真菌（彭岳林等，2007）；同時(shí)，土壤細(xì)菌的多樣性也顯著高于真菌（牛磊等，2015）。本研究結(jié)果表明，藏北退化高寒草原土壤細(xì)菌的多樣性、豐富度和相對(duì)豐度均顯著高于真菌。細(xì)菌的α多樣性顯著高于真菌的主要原因可能是由于細(xì)菌是土壤中數(shù)量最多的微生物種類（Wang et al.，2016），而真菌更易受到植物有機(jī)質(zhì)輸入的影響（Wang et al.，2018a；Delgado-Baquerizo et al.，2018），且藏北退化高寒草原的植被稀少、植被生產(chǎn)力低下，植物有機(jī)質(zhì)輸入量明顯偏低。因此，土壤真菌的多樣性顯著低于細(xì)菌。細(xì)菌的α多樣性顯著高于真菌的第二個(gè)原因可能是在輕度退化草地中，一定程度的土壤風(fēng)化導(dǎo)致土壤生態(tài)微環(huán)境發(fā)生一定程度的改變，進(jìn)而促進(jìn)土壤細(xì)菌的繁殖和活動(dòng)，從而使土壤細(xì)菌數(shù)量明顯上升（彭岳林等，2007）。一般情況下，植被的種類和豐富度越高，土壤微生物的多樣性也越高（Wang et al.，2015，2018a）。但是，由于嚴(yán)酷的水熱條件、強(qiáng)烈的風(fēng)化、過(guò)度放牧等諸多因素的綜合作用，藏北高寒草原退化程度較嚴(yán)重，導(dǎo)致植被較單一。所以，藏北退化高寒草原土壤微生物的多樣性明顯低于其他植被類型的（Wang et al.，2018a，2018b）。同時(shí)，藏北高寒草原的低降雨量和高蒸發(fā)量等獨(dú)特特點(diǎn)也是導(dǎo)致其土壤微生物多樣性明顯偏低的主因之一，因?yàn)楦珊祵?dǎo)致土壤微生物的多樣性指數(shù)顯著降低（Guenet et al.，2012；Maestre et al.，2015）。此外，真菌/細(xì)菌比是評(píng)價(jià)土壤肥力和健康程度的重要指標(biāo)之一（Wang et al.，2016；Kumar et al.，2017），且土壤真菌/細(xì)菌比越高代表土壤肥力越高、土壤生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定程度也越高（de Vries et al.，2006）。本研究結(jié)果顯示，真菌的多樣性、豐富度和相對(duì)豐度均顯著小于細(xì)菌。通過(guò)對(duì)細(xì)菌和真菌多樣性、豐富度和相對(duì)豐度進(jìn)行計(jì)算，得出真菌/細(xì)菌比僅分別為0.725、0.260和0.258，比值偏低。這表明，藏北高寒草原土壤肥力已比較低下，且生態(tài)系統(tǒng)已退化，而干旱的環(huán)境條件也是造成真菌細(xì)菌比低下的重要因素之一（Guenet et al.，2012），且真菌比細(xì)菌對(duì)干旱更為敏感（Gordon et al.，2008）。

放線菌門和酸桿菌門是高寒區(qū)域土壤細(xì)菌群落的優(yōu)勢(shì)門類，如北極苔原永久凍土（Wilhelm et al.，2011）、南極 Lake Zub附近土壤（Shivaji et al.，2004）、加拿大高緯度北極苔原（Neufeld et al.，2004）、阿爾卑斯山地苔原（Zinger et al.，2009）、青藏高原草地（陳偉等，2011）和青藏高原的Chaka湖、Athalassohaline湖（Jiang et al.，2006）以及其他20個(gè)湖泊（Xiong et al.，2012）。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果基本一致，且與其他類型的陸地生態(tài)系統(tǒng)相類似（Barnard et al.，2013）。此外，部分研究結(jié)果顯示：放線菌門的相對(duì)豐度在干旱地區(qū)相對(duì)較高（Maestre et al.，2015；Wang et al.，2015），而本研究中，放線菌門是土壤細(xì)菌群落相對(duì)豐度最高的，這也印證了藏北高寒草原的退化。

土壤真菌群落的優(yōu)勢(shì)門類主要為子囊菌門及擔(dān)子菌門（Maestre et al.，2015；Ren et al.，2018）。在高寒區(qū)域的相關(guān)研究結(jié)果也驗(yàn)證了這一點(diǎn)，如科羅拉多高山苔原（Schadt et al.，2003），而本研究結(jié)果也得到與之一致的結(jié)論。這表明藏北高寒草原的微生物組成與其他類型的生態(tài)系統(tǒng)具有很大的相似性。因此，若加以環(huán)境保護(hù)與生態(tài)恢復(fù)，藏北高寒草原有望形成良好循環(huán)的生態(tài)系統(tǒng)，若再任之持續(xù)退化，一旦植被與土壤微生物之間的互作反饋關(guān)系被徹底破壞，很可能形成不可逆的生態(tài)破壞。

4 結(jié)論

（1）藏北退化高寒草原土壤化學(xué)成分組成以SiO2為主，占比為63.5%。土壤顆粒粒徑分布介于10～0.1 mm之間，其中介于5～1 mm之間土壤顆粒占比為51%。

（2）細(xì)菌多樣性、豐富度和相對(duì)豐度均顯著高于真菌。放線菌門、變形菌門和酸桿菌門是藏北退化高寒草原土壤細(xì)菌群落的優(yōu)勢(shì)門類。

（3）土壤真菌群落的優(yōu)勢(shì)門類主要為子囊菌門、其他類和擔(dān)子菌門。

（4）通過(guò)對(duì)細(xì)菌和真菌多樣性、豐富度和相對(duì)豐度進(jìn)行計(jì)算，得出真菌/細(xì)菌比僅分別為 0.725、0.260和0.258，這說(shuō)明藏北高寒草原土壤肥力已比較低下，且生態(tài)系統(tǒng)也已呈退化趨勢(shì)。