限制性酶解—鈣融合制備高鈣豆粉的工藝研究

尋崇榮，范志軍，王冬梅，王中江，江連洲，李 楊

(1東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030；2黑龍江省北大荒綠色健康食品有限責(zé)任公司，哈爾濱 150036)

豆乳粉中含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及大豆低聚糖、大豆異黃酮、大豆卵磷脂等功能性成分，易于人體消化吸收，深受消費(fèi)者的喜愛(ài)。目前，制備豆乳粉最常用的是傳統(tǒng)濕法工藝[1]。但傳統(tǒng)工藝技術(shù)制得的豆乳粉含鈣量較低，鈣離子的吸收利用低，不利于豆乳粉在國(guó)內(nèi)外的市場(chǎng)推廣[2]。

研究表明，酶解大豆蛋白可提高與鈣離子的結(jié)合能力，小分子肽、氨基酸等與鈣鰲合，形成可溶性鰲合物，阻止小腸內(nèi)鈣的沉淀，以促進(jìn)鈣的吸收利用[3]。大豆蛋白水解物對(duì)碳酸鈣晶體生長(zhǎng)有抑制作用，其抑制作用與大豆肽結(jié)構(gòu)有關(guān)，且大豆肽分布到碳酸鈣粒子表面會(huì)使粒子通過(guò)親水作用均勻分散在溶液中提高鈣分散性[3-4]。許慧等[5]利用堿性蛋白酶水解大豆蛋白改善對(duì)磷酸鈣的融合性，但需對(duì)蛋白水解物進(jìn)行脫苦處理。包小蘭等[6]對(duì)大豆蛋白酶解物進(jìn)行脫酰胺化處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，脫酰胺化作用可增加大豆蛋白水解物的鈣融合量，抑制胃蛋白酶消化作用。張美玲等[7]對(duì)大豆分離蛋白的堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物進(jìn)行類蛋白反應(yīng)修飾，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大豆分離蛋白酶解聯(lián)合類蛋白反應(yīng)修飾可提高鈣離子螯合能力，但會(huì)影響多肽的功能性及口感風(fēng)味。周小玲[8]對(duì)比研究了不同鈣鹽對(duì)大豆蛋白聚集的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，離子形式的CaCl2和CaSO4會(huì)增大蛋白溶液濁度，而分子形式的Ca3(PO4)2和CaCO3則對(duì)大豆蛋白聚集的影響較弱。目前，植物蛋白水解后會(huì)產(chǎn)生苦味肽[9]，葛文靜等[10]研究表明，利用木瓜蛋白酶酶解大豆分離蛋白可得到粘度較低、苦味較弱的多肽。風(fēng)味蛋白酶可有效水解苦味肽，但對(duì)完整大豆蛋白的酶解效果較弱，因此可聯(lián)合木瓜蛋白酶使用，且木瓜蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶酶解最優(yōu)參數(shù)相似，因此本研究采用木瓜蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶聯(lián)合酶解，以降低豆粉苦味[11]。

目前，已有酶解法提高豆乳粉溶解性的研究，然而采用限制性酶解—鈣融合制備高溶解性高鈣豆粉的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本文以傳統(tǒng)濕法加工技術(shù)制備豆乳粉為基礎(chǔ)，利用限制性酶解及鈣融合技術(shù)改善高鈣豆粉的溶解性及鈣吸收效率，為高鈣豆粉的生產(chǎn)加工提供科學(xué)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

大豆，哈爾濱九三油脂集團(tuán)；大豆磷脂，周口慧洋飼料有限公司；木瓜蛋白酶(酶活力800 U/mg)、風(fēng)味蛋白酶(20 U/mg)，丹麥novo公司；食品級(jí)碳酸鈣，上海圣昆化工有限公司；實(shí)驗(yàn)所需基礎(chǔ)試劑均為分析純，北京化學(xué)試劑公司。

1.2 儀器

FDM-Z80豆?jié){機(jī)，上海偉業(yè)儀器廠；Ultra-Turrax T25高速分散器，德國(guó)IKA公司；噴霧干燥機(jī)，無(wú)錫昂益達(dá)機(jī)；AL204型分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；pHS-25型酸度計(jì)，上海江儀儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋，余姚市東方電工儀器廠；XW-80A旋渦混合器，上海青浦滬西儀器廠；HYP-Ⅱ八孔消化爐，上海纖檢儀器有限公司；LNK-871型凱氏定氮快速自動(dòng)蒸餾器，江蘇省宜興市科教儀器研究所。

1.3 豆乳粉的制備

大豆→浸泡→熱燙→磨漿→漿渣混合物→漿渣分離→豆乳→酶解→滅酶→鈣融合→均質(zhì)→調(diào)配→濃縮→噴霧干燥→豆乳粉。

參照齊寶坤等[1]的方法稱取50 g大豆于燒杯中，用濃度為0.5%的NaHCO3水溶液浸泡10 h左右后用沸水熱燙5 min，按豆水比1∶7的比例添加pH為6.5～7.0的90℃弱堿水進(jìn)行磨漿得漿渣混合物，然后漿渣分離得豆乳，調(diào)節(jié)豆乳溫度55℃和pH 7.0，加入一定量木瓜蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解后95℃滅酶5 min，向酶解后的豆乳中加入0.6%的食用級(jí)碳酸鈣(占豆乳固形物含量的百分比)，一定壓力下均質(zhì)處理，添加1.5%的大豆磷脂進(jìn)行調(diào)配混勻，將調(diào)配好的豆乳進(jìn)行真空濃縮至豆乳固形物含量達(dá)15%左右，然后在進(jìn)口溫度為180℃、出口溫度為80℃條件下進(jìn)行噴霧干燥即得高鈣豆乳粉。

1.4 限制性酶解工藝的單因素確定試驗(yàn)

保持均質(zhì)壓力為25 MPa、均質(zhì)時(shí)間為8 min，在其他條件不變的情況下，分別選取酶解時(shí)間為0.5、1、1.5、2、2.5h，酶添加量為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%(豆乳質(zhì)量的百分比)，木瓜蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶的質(zhì)量添加比為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5進(jìn)行單因素試驗(yàn)。確定酶解工藝對(duì)蛋白質(zhì)分散指數(shù)(%)和可溶性鈣結(jié)合量(mg/g)的影響。

1.5 鈣融合工藝的單因素確定試驗(yàn)

保持酶解時(shí)間為1.5 h、酶添加量為1.5%、木瓜蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶的質(zhì)量添加比為1∶4，在其他條件不變的情況下，選取均質(zhì)壓力為10、15、20、25、30 MPa，均質(zhì)時(shí)間為2、5、8、11、14 min進(jìn)行單因素試驗(yàn)。確定鈣融合工藝對(duì)蛋白質(zhì)分散指數(shù)(%)和可溶性鈣結(jié)合量(mg/g)的影響。

1.6 固形物含量的測(cè)定

豆乳中固形物含量按照商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SB/T 10633-2011進(jìn)行測(cè)定。

1.7 蛋白質(zhì)分散指數(shù)的測(cè)定

參照齊寶坤等[1]的方法取一定量豆乳粉樣品以1∶20的料液比分散于去離子水中，充分?jǐn)嚢?0 min，待分層后將溶解液于3 000 r/min下離心10 min，離心后取上清液測(cè)定蛋白含量(凱氏定氮法)。蛋白質(zhì)分散指數(shù)的計(jì)算公式如式(1)：

(1)

1.8 可溶性鈣結(jié)合量的測(cè)定

參照包小蘭[6]的方法，稱取0.01 g豆粉樣品溶于3 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液中(pH 7.4)，離心0.5h(6 000 r/min離心)，收集上清液至透析袋(MWCO∶500 Da)中，然后將透析袋移到Tris-HCl(pH7.4)緩沖液中，用保鮮膜密封，用磁力攪拌器在冰箱中(4℃)流動(dòng)透析，透析結(jié)束后，將透析液移到25 mL容量瓶中并定容，通過(guò)空氣—乙炔火焰原子吸收光譜法測(cè)定鈣含量(參數(shù)與包小蘭[6]的設(shè)置一致)，即為可溶性結(jié)合鈣質(zhì)量，計(jì)算公式如式(2)：

(2)

1.9 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)都進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，并將試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行誤差分析。采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 18對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、相關(guān)性和差異顯著性分析；采用Origin 8.5軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解工藝對(duì)豆粉蛋白質(zhì)分散指數(shù)和可溶性鈣結(jié)含量的影響

2.1.1復(fù)合酶質(zhì)量添加比對(duì)蛋白質(zhì)分散指數(shù)和可溶性鈣結(jié)合量的影響 蛋白質(zhì)分散指數(shù)可表征豆粉的溶解性，其值越高，豆粉的溶解性越好[1]；可溶性鈣結(jié)合量可表征豆粉中鈣離子的人體吸收效率，其值越高，人體對(duì)鈣離子的吸收效果越好[12，19]。由圖1可知，酶解可顯著提高豆粉的蛋白質(zhì)分散指數(shù)及可溶性鈣結(jié)合量[14-15]，但木瓜蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶的質(zhì)量添加比對(duì)蛋白質(zhì)分散指數(shù)的影響不顯著(P>0.05)，這兩種酶的質(zhì)量添加比從1∶1增加到1∶2時(shí)，可溶性鈣結(jié)合量隨這兩種酶質(zhì)量添加比的增加而顯著提高(P<0.05)，而繼續(xù)增加這兩種酶的質(zhì)量添加比，鈣結(jié)合量變化不顯著(P>0.05)，且比值超過(guò)1∶3時(shí)，鈣結(jié)合量有下降趨勢(shì)。推測(cè)木瓜蛋白酶對(duì)豆粉蛋白質(zhì)分散指數(shù)及可溶性鈣結(jié)合量的效果高于風(fēng)味蛋白酶，但風(fēng)味蛋白酶對(duì)鈣結(jié)合量有一定促進(jìn)作用。原因可能是木瓜蛋白酶對(duì)豆粉蛋白的酶解較充分，產(chǎn)生大量多肽，風(fēng)味蛋白酶繼續(xù)酶解產(chǎn)生的多肽，形成更多的小分子肽，促進(jìn)與鈣離子的結(jié)合，增加了鈣結(jié)合量[6，13]，但風(fēng)味蛋白酶相對(duì)添加過(guò)多，導(dǎo)致部分多肽進(jìn)一步水解成分子量小于8 KDa的小分子肽，減少多肽與鈣離子的結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致豆粉的鈣結(jié)合量降低[13，18]。

圖1 復(fù)合酶質(zhì)量添加比對(duì)蛋白質(zhì)分散 指數(shù)和可溶性鈣結(jié)合量的影響

2.1.2酶解時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)分散指數(shù)及可溶性鈣結(jié)合量的影響 由圖2可知，當(dāng)酶解時(shí)間從0.5 h增加到1.5 h時(shí)，豆粉蛋白質(zhì)分散指數(shù)和鈣結(jié)合量隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增加(P<0.05)，酶解時(shí)間超過(guò)1.5 h后，蛋白質(zhì)分散指數(shù)及鈣結(jié)合量有下降趨勢(shì)，但兩者變化均不顯著(P>0.05)，說(shuō)明適當(dāng)增加酶解時(shí)間可改善豆粉的溶解性及鈣結(jié)合量[18]。原因可能是酶解初期，底物相對(duì)含量較高，酶促反應(yīng)效率較快，豆乳中大分子蛋白逐漸降解為小分子肽，蛋白乳化性增加，繼而增加與鈣離子的結(jié)合量[18]及蛋白質(zhì)分散指數(shù)[16]；但隨著酶解時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，風(fēng)味蛋白酶不斷降解大豆蛋白肽為小分子肽及氨基酸，導(dǎo)致小分子肽增多，不易吸附于油水界面，多肽乳化性降低，繼而降低豆粉的蛋白質(zhì)分散指數(shù)，且多肽分子量過(guò)小會(huì)減少鈣離子結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致鈣結(jié)合量有降低趨勢(shì)[18]。這與Bao等[18]的研究結(jié)果一致，即部分水解可使大豆球蛋白的緊密結(jié)構(gòu)松弛，增加鈣結(jié)合位點(diǎn)，但過(guò)度水解會(huì)降低結(jié)合位點(diǎn)，降低鈣結(jié)合能力。

圖2 酶解時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)分散指數(shù)及 可溶性鈣結(jié)合量的影響

2.1.3酶添加量對(duì)蛋白質(zhì)分散指數(shù)及可溶性鈣結(jié)合量的影響 由圖3可知，當(dāng)酶添加量從0.5%升高到1.5%時(shí)，豆粉蛋白質(zhì)分散指數(shù)和可溶性鈣結(jié)合量隨著酶添加量的增加而顯著增加，當(dāng)加酶量達(dá)到1.5%后，繼續(xù)增加酶添加量，蛋白質(zhì)分散指數(shù)和鈣結(jié)合量變化不顯著，說(shuō)明適當(dāng)增加酶添加量可提高豆粉的溶解性及鈣結(jié)合量。原因可能是相對(duì)底物含量的限制及酶分子之間相互碰撞減少了底物與酶碰撞機(jī)會(huì)，降低酶促效應(yīng)效率，抑制蛋白質(zhì)分散指數(shù)和鈣結(jié)合量的增加，這與徐錦麗[17]及包小蘭[6]的研究結(jié)果一致，即適度增加酶添加量可改善大豆蛋白的溶解性及可溶性鈣結(jié)合量。

圖3 酶添加量對(duì)蛋白質(zhì)分散指數(shù) 及可溶性鈣結(jié)合量的影響

2.2 鈣融合工藝對(duì)豆粉蛋白質(zhì)分散指數(shù)和可溶性鈣結(jié)含量的影響

圖4 均質(zhì)壓力對(duì)蛋白質(zhì)分散指數(shù)及 可溶性鈣結(jié)合量的影響

2.2.1均質(zhì)壓力對(duì)蛋白質(zhì)分散指數(shù)和可溶性鈣結(jié)合量的影響 由圖4可知，豆粉蛋白質(zhì)分散指數(shù)隨著均質(zhì)壓力的增加而顯著增加(P<0.05)；當(dāng)均質(zhì)壓力從10 MPa升高到25 MPa時(shí)，可溶性鈣結(jié)合量隨均質(zhì)壓力的增加而顯著增加(P<0.05)，均質(zhì)壓力達(dá)到25 MPa后，繼續(xù)增加壓力，豆粉中鈣結(jié)合量無(wú)顯著變化(P>0.05)，說(shuō)明提高均質(zhì)壓力，可在一定程度上改善豆粉的溶解性、提高鈣結(jié)合量。原因可能是在的高速分散作用下大豆多肽與大豆磷脂及鈣離子充分接觸，促進(jìn)多肽與磷脂及多肽與鈣離子的相互作用，提高多肽的乳化性及鈣融合性，且將豆乳分散為更小的乳液滴，以致豆粉蛋白質(zhì)分散指數(shù)及鈣結(jié)合量提高[14]。壓力增大，可提高分散效果[14]，在均質(zhì)壓力大于25 MPa時(shí)，繼續(xù)增加壓力鈣結(jié)合量變化不明顯，原因可能是達(dá)到鈣結(jié)合位點(diǎn)上限。綜合考慮加工成本，選擇均質(zhì)壓力為25 MPa。

2.2.2均質(zhì)時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)分散指數(shù)和可溶性鈣結(jié)合量的影響 由圖5可知，均質(zhì)初期，隨著均質(zhì)時(shí)間的延長(zhǎng)，豆粉蛋白質(zhì)分散指數(shù)及鈣結(jié)合量顯著增加(P<0.05)，均質(zhì)時(shí)間超過(guò)8 min后，豆粉蛋白分散指數(shù)無(wú)顯著變化，11 min后，鈣結(jié)合量變化不大。說(shuō)明適當(dāng)增加均質(zhì)時(shí)間可改善豆粉的溶解性與鈣結(jié)合量。綜合考慮蛋白質(zhì)分散指數(shù)、鈣結(jié)合量的變化及加工成本，選擇均質(zhì)時(shí)間為8 min。

圖5 均質(zhì)次數(shù)對(duì)蛋白質(zhì)分散指數(shù)和豆乳表觀粘度的影響

3 結(jié)論

本文對(duì)限制性酶解—鈣融合制備高鈣豆粉工藝進(jìn)行研究，分別采用離心法及原子吸收光譜法測(cè)定豆粉的蛋白質(zhì)分散指數(shù)和可溶性鈣結(jié)合量。單因素試驗(yàn)表明，酶解時(shí)間、酶添加量、均質(zhì)壓力、均質(zhì)時(shí)間對(duì)豆粉蛋白質(zhì)分散指數(shù)及可溶性鈣結(jié)合量具有顯著影響。酶解可顯著提高豆粉的蛋白質(zhì)分散指數(shù)及可溶性鈣結(jié)合量，但木瓜蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶的質(zhì)量添加比對(duì)蛋白質(zhì)分散指數(shù)的影響不顯著；適當(dāng)增加酶解時(shí)間、酶添加量，適當(dāng)提高均質(zhì)壓力及均質(zhì)時(shí)間，可在一定程度上改善豆粉的溶解性、提高鈣結(jié)合量?！?/p>