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    低氧預處理人胎盤絨毛膜間充質干細胞環(huán)狀RNA篩選

    2018-09-26 11:35孫遜沙吳潔瑩陳勁松陸琰喻秋霞李茹王丹李焱吳韶清
    中國醫(yī)藥導報 2018年18期
    關鍵詞:環(huán)狀充質絨毛

    孫遜沙 吳潔瑩 陳勁松 陸琰 喻秋霞 李茹 王丹 李焱 吳韶清

    [摘要] 目的 探討環(huán)狀RNA在人胎盤絨毛膜間充質干細胞低氧預處理和常氧培養(yǎng)中表達譜的差異。 方法 利用芯片技術檢測3例低氧預處理人胎盤絨毛膜間充質干細胞及其相應對照的常氧培養(yǎng)細胞的環(huán)狀RNA表達,分析兩者差異表達的環(huán)狀RNA及其結合miRNA。 結果 在檢測的13 617條環(huán)狀RNA中,有分析結果的環(huán)狀RNA 12 114條,低氧和常氧培養(yǎng)人胎盤間充質干細胞差異表達環(huán)狀RNA共102條,其中低氧中表達上調的85條,下調的17條(倍數(shù)變化>1.5倍且P < 0.05),而表達差異倍數(shù)變化大于2倍以上的環(huán)狀RNA有27條,且均為上調表達。每個環(huán)狀RNA預測到5個結合miRNA。 結論 低氧預處理使得人胎盤絨毛膜間充質干細胞的環(huán)狀RNA表達譜發(fā)生了顯著變化,這些環(huán)狀RNA可能和低氧預處理有關。

    [關鍵詞] 低氧;人胎盤絨毛膜間充質干細胞;環(huán)狀RNA;表達譜

    [中圖分類號] R394.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210(2018)06(c)-0009-03

    [Abstract] Objective To analyze the expression profile variation of circular RNA (circRNA) between hypoxia preconditioned human placenta chorionic mesenchymal stem cells (H-hpcMSCs) and normoxic preconditioned hpcMSCs (N-hpcMSCs). Methods Human circRNA microarray was performed to detect the difference of circRNA expression between 3 paired specimens of H-hpcMSCs and its N-hpcMSCs. The circRNA differental expression and the predicted miRNA of differentially expressed circRNA were analyzed. Results Of the 13 617 circRNAs, 12 114 circRNAs with analytical results. In H-hpcMSCs, a total of 102 circRNAs showed differentially expressed which have more than 1.5 times variation and significant difference (P < 0.05). Among them, 85 increased and change′s fold more than 1.5 times, while 17 reduced and change′s fold more than 1.5 times, a total of 27 circRNAs showed a greater than 2-fold change and all were up-regulated. Five miRNAs of each with differentially expressed circRNA were predicted according to specific base pairing. Conclusion The circRNA expression profile of H-hpcMSCs changed significantly in comparison with N-hpcMSCs, the circRNA may be associated with the hypoxia precondition.

    [Key words] Hypoxia precondition; Human placenta chorionic mesenchymal stem cells; Circular RNA; Expression profile

    環(huán)狀RNA是一類特殊的內源性RNA分子,大量存在于真核生物細胞中,是RNA領域最新的研究熱點之一[1-3]。已有研究表明,circRNA參與了多種疾病、衰老等生理病理現(xiàn)象的發(fā)生發(fā)展過程[4]。目前,circRNA參與調控間充質干細胞生理過程的研究報道較少,而低氧預處理對間充質干細胞中circRNA表達的影響未見報道。因此,本研究預期篩選出低氧預處理人胎盤絨毛膜間充質干細胞差異表達的circRNA,為circRNA參與間充質干細胞的生物學功能提供實驗數(shù)據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試劑與儀器

    TRIzol試劑(Invitrogen life technologies),無RNA酶的水(Invitrogen life technologies),RNase R(Epicentre),人circRNA芯片v2.0(Arraystar),Arraystar Supper RNA Labeling試劑盒(Arraystar),二氧化氮培養(yǎng)箱(Labotect),基因芯片掃描儀(Agilent),計算機圖像分析系統(tǒng)(Leica),基因芯片雜交儀(Illumina)

    1.2 標本收集和分組

    人胎盤絨毛膜間充質干細胞按照已有實驗室方法提取并驗證為合格的間充質干細胞[5]。本研究中,復溫3例不同孕婦胎盤來源的P3代人胎盤絨毛膜間充質干細胞,接種培養(yǎng)至80%融合時消化傳代,1∶2分離培養(yǎng),一瓶置于1%體積分數(shù)CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),為本次研究的實驗組;一瓶置于21%體積分數(shù)CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),為本次研究的對照組。

    1.3 環(huán)狀RNA芯片實驗操作流程

    實驗組和對照組細胞培養(yǎng)至70%~80%融合度時,用TRIzol提取總RNA,經RNase R處理,去除線性RNA,富集circRNA,然后用隨機引物對circRNA進行擴增并轉錄為熒光cRNA。cRNA純化后在circRNA芯片上65℃雜交17 h。雜交后的芯片洗片后,應用Agilent Scanner G2505C掃描。

    1.4 數(shù)據(jù)采集與分析

    將芯片掃描圖片導入Agilent Feature Extraction軟件提取原始數(shù)據(jù),應用R軟件包進行標準化和分析,兩組樣本間差異表達的circRNA通過變化倍數(shù)進行篩選。應用預測軟件TargetScan和miRanda,對于每個差異倍數(shù)大于1.5倍的circRNA預測5個高匹配值的miRNA。

    1.5 統(tǒng)計學方法

    采用Rv.3.3統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析,以標準化處理后數(shù)據(jù)為基礎,兩組間比較采用t檢驗,以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義;篩選出倍數(shù)變化大于1.5,P < 0.05的circRNA為差異表達circRNA。

    2 結果

    2.1 散點圖分析circRNA表達譜變化

    用實驗組和對照組表達的circRNA繪制散點圖,平行于對角線的1.5倍線有效區(qū)分兩組樣本中表達一致和差異表達的circRNA。見圖1(封四)。

    2.2 火山圖分析circRNA表達譜變化

    用實驗組和對照組表達的環(huán)狀RNA繪制火山圖,紅色區(qū)域代表的circRNA符合差異表達條件的環(huán)狀RNA(倍數(shù)變化>1.5倍,且P < 0.05)。見圖2(封四)。

    2.3 分層聚類分析circRNA表達譜的差異

    用實驗組和對照組表達的circRNA進行分層聚類分析,紅色表示circRNA表達上調,藍色表示circRNA表達下調。結果顯示分層聚類分析能夠正確區(qū)分實驗組和對照組中circRNA的差異表達。見圖3(封四)。

    2.4 實驗組和對照組差異表達circRNA篩選

    實驗組和對照組差異表達的circRNA共102條,其中實驗組中表達上調的85條,下調17條(倍數(shù)變化>1.5倍,P < 0.05),每條circRNA均預測5個高配值的miRNA。見表1。

    3 討論

    circRNAs(Circular RNAs,circRNA分子)是一類不具有5'末端帽子和3'末端poly(A)尾巴、并以共價鍵形成環(huán)形結構的內源性RNA分子。自從20世紀70年代Sanger等[6]首次在植物類病毒中發(fā)現(xiàn)circRNA以來,雖然經過幾十年的發(fā)展,circRNA研究一直進展緩慢。隨著高通量測序技術和生物信息學的發(fā)展,人們在大規(guī)模研究轉錄組數(shù)據(jù)時,發(fā)現(xiàn)了大量的circRNA[7-9]。當Hansen等[10]報道circRNA作為分子“海綿”吸附miRNA從而影響基因功能,引起科研人員對circRNA的極大關注,circRNA不再被認為是基因轉錄后錯誤剪接的產物,使得circRNA成為目前生物醫(yī)學領域研究熱點之一[1-3]。已有研究表明,circRNA過高或過低表達,都與機體穩(wěn)態(tài)失衡以及疾病有關,circRNA參與疾病發(fā)生發(fā)展、衰老等生理病理過程的研究成果不斷報道[11-13],但circRNA參與間充質干細胞相關生理過程的研究報道較少[14-15],低氧預處理對間充質干細胞circRNA表達的影響未見報道。

    已有研究表明,低氧對MSCs的細胞周期、凋亡、遷移、增殖和分化均有影響[16-17]。在氧體積分數(shù)<5%時,低氧預處理可以作為在一定程度上克服MSCs的增殖緩慢、移植后遷移率低、基因不穩(wěn)定等細胞治療缺陷的有效手段,可以提高其臨床應用的有效性及安全性,對再生醫(yī)學的研究有至關重要的意義[18]。

    本研究中,對13 617條circRNA進行檢測,獲得有檢測分析結果的circRNA為12 114條,通過同常氧條件下培養(yǎng)的hpcMSCs相比較分析,低氧條件下培養(yǎng)的hpcMSCs在circRNA表達譜上存在差異表達,按照差異表達倍數(shù)>1.5倍且P < 0.05的標準進行篩選,共獲得102條差異表達circRNA,其中表達上調的85條,下調17條,表達差異達到2倍以上的27條,均為表達上調。提示這些差異表達的circRNA可能參與低氧條件下hpcMSCs的各種生物過程和分子調控機制。通過生物信息學技術分析差異表達circRNA的靶結合位點,軟件預測顯示多個circRNA和miR-150結合。文獻檢索分析表明,miR-150是一個重要的分子元件,涉及到影響間充質干細胞歸巢的SDF-1/CXCR4軸通路[19-20]。因此,在目前的基礎上,需要用qRT-PCR驗證獲得的circRNA,然后借助生物信息學技術、文獻檢索分析和LOF/GOF操作,上調或下調相關circRNA表達,觀察細胞的生物學特征和功能,以及進一步用實驗研究來驗證circRNA引起hpcMSCs產生的具體生物過程。這些有待開展的研究將闡明低氧培養(yǎng)條件下hpcMSCs發(fā)生變化的一系列生理生物過程的發(fā)生機制,為間充質干細胞的臨床細胞治療提供科學依據(jù)。

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