綠原酸緩解鎘暴露致大鼠腸道損傷

黃 芳，劉文惠，吳 軼，鄢雅麗，阮 征*

鎘元素于1817年被德國的化學(xué)家Strohmeier發(fā)現(xiàn)，關(guān)于鎘暴露最早的毒性作用觀察來自臨床醫(yī)學(xué)[1]。鎘由于其性質(zhì)柔韌和良好的抗氧化性而被廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代工業(yè)生產(chǎn)中，故其對環(huán)境造成的污染日趨嚴(yán)重。鎘主要通過食物鏈、煙草煙霧以及鎘礦工業(yè)等進入人體和動物體中[2]，在體內(nèi)的生物半衰期長達(dá)10～30 年，在動物和人類的血液、腎臟、肝臟、腸道、骨骼和生殖器官中不斷蓄積[3]。鎘會使肝和腎等重要器官產(chǎn)生嚴(yán)重的畸變和癌變[4]，被國際癌癥研究機構(gòu)界定為人類致癌物。研究顯示，鎘造成的毒性與其引起機體產(chǎn)生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）緊密相關(guān)，說明氧化應(yīng)激參與鎘引起的毒性損傷。腸道是鎘進入機體的第一個器官，只有3%左右的攝入鎘可以被吸收[5]，鎘在胃腸道絨毛的最長停留時間集中在4～68 h之間[6-7]。早期的體外實驗表明腸道屏障對限制鎘的吸收至關(guān)重要[8-9]，腸道屏障被破壞會增加鎘的吸收。這些事實表明腸道是一個保護機體免受無機毒物損害的重要器官。

綠原酸（chlorogenic acid，CGA）是天然的膳食酚類物質(zhì)，廣泛存在于杜仲、金銀花、咖啡與向日葵等多種植物性食品及藥食同源性食物中，是日常膳食中攝入量最多的一類酚酸[10]。早期研究表明綠原酸具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、降血壓、降血脂、清除體內(nèi)自由基及免疫調(diào)節(jié)等作用，是一種重要的生物活性物質(zhì)，其抗氧化作用最受關(guān)注[11-13]。綠原酸是一種酚型抗氧化劑，其抗氧化作用與其分子結(jié)構(gòu)中的R—OH有關(guān)，它可以清除羥自由基和超氧陰離子自由基等，保護組織免受自由基的損害。

本實驗通過構(gòu)造鎘暴露導(dǎo)致的腸損傷大鼠模型，添加膳食綠原酸干預(yù)，從大鼠的生長性能、組織形態(tài)學(xué)、黏膜損傷評分、絨毛高度和隱窩深度等方面來探討鎘對大鼠腸道的損傷作用，及綠原酸對鎘損傷的緩解作用。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級SD雌性大鼠購自長沙天勤生物技術(shù)有限公司，許可證編號：SCXK（湘）2016-0002。

綠原酸（純度98%） 阿拉丁試劑有限公司；葵花仁提取物（sunflower seed extract，SSE；含綠原酸33.27%，提取率為3.04%） 內(nèi)蒙古沃禾泥農(nóng)業(yè)科技有限公司；氯化鎘 西隴化工股份有限公司；蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒 長沙艾杰生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

YP202N電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；SC-3614臺式離心機 科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；UV-160A紫外分光光度計 日本島津公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇市城西曉陽電子儀器廠；BN-803生物組織攤片烤片機 湖北貝諾醫(yī)療科技有限公司；Power Tome-XL超薄切片機 美國RMC公司；RM2235切片機 德國Leica公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組與喂養(yǎng)

實驗選取32 只健康SD雌性大鼠，按照隨機分配的原則分為4 組，預(yù)喂養(yǎng)1 周，1 周后分別對每組進行灌胃給藥?？瞻讓φ眨╟ontrol，CON）組：只灌胃蒸餾水；鎘損傷模型（CdCl2，Cd）組：灌胃6 mg/kg mbCdCl2；鎘損傷模型+綠原酸干預(yù)（Cd+CGA）組：灌胃6 mg/kg mbCdCl2+50 mg/kg mbCGA；鎘損傷模型+葵花仁提取物干預(yù)（Cd+SSE）組：灌胃6 mg/kg mbCdCl2+50 mg/kg mbSSE。參照GB 14924.3—2001《實驗動物 大鼠小鼠配合飼料》營養(yǎng)需要量配制本實驗的基礎(chǔ)日糧（表1）。實驗周期為14 d，之后禁食12 h后麻醉斷頭處死。

表1 飼料營養(yǎng)成分表Table 1 Composition and nutrients of experimental diet

1.3.2 檢測指標(biāo)和方法

1.3.2.1 組織器官的采集和處理

大鼠于正式實驗第14天晚上采用麻醉斷頭的方式處死，然后解剖，分別取出內(nèi)臟器官肝臟、腎臟、脾、小腸和大腸組織；小腸又分為十二指腸、空腸和回腸3 段，取出的所有器官和組織，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%的生理鹽水清洗干凈并除去異物，再用吸水紙吸干后用電子天平稱質(zhì)量，用以計算臟器指數(shù)，剪取部分組織用錫箔紙包好并標(biāo)記，放入充滿液氮的泡沫盒中暫時保存，再用剪刀剪取空腸組織1.5 cm左右放入10%福爾馬林固定液中待用。

1.3.2.2 血樣的采集和處理

實驗大鼠采用麻醉斷頭的方式處死，收集血液，為防止所取得的血液凝固，立即4 000 r/min離心15 min，取上清液并分裝在2.5 mL的EP管中，標(biāo)記后置于－80 ℃冰箱中保存待用。

1.3.2.3 生長性能指標(biāo)的測定

在大鼠正式造模后每7 d稱量1 次大鼠的體質(zhì)量和剩余飼料質(zhì)量，記錄下大鼠的體質(zhì)量和進食量。計算大鼠平均每周體質(zhì)量增加量和進食量情況。

1.3.2.4 臟器指數(shù)的測定

取出的肝臟、脾臟、腎臟、空腸、回腸和結(jié)腸在除去其表面或內(nèi)部異物后用電子天平分別稱其質(zhì)量，根據(jù)下式計算臟器指數(shù)。

式中：m1為器官質(zhì)量/g；m2為大鼠體質(zhì)量/kg。

1.3.2.5 血液生化指標(biāo)的測定

取存于－80 ℃冰箱中的血清200 μL放入全自動生化分析儀中，并加入檢測試劑測定谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）活力及血清白蛋白（serum albumin，ALB）水平。

1.3.2.6 腸道黏膜HE染色

所取空腸樣本采用10%福爾馬林溶液固定、乙醇逐級脫水、二甲苯透明處理、石蠟包埋，切片并做HE染色[14]，在電子顯微鏡下觀察組織的損傷切片。用ISCpicture 3.0系統(tǒng)進行圖像采集，收集放大200 倍條件下觀察到的圖片，采用顯微圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0測量空腸絨毛高度和隱窩深度。絨毛高度是從腸絨毛基部至絨毛頂端的長度，隱窩深度是從腸腺絨毛聯(lián)結(jié)處至腸腺基部的距離。收集數(shù)據(jù)，做后續(xù)統(tǒng)計學(xué)分析。

1.3.2.7 腸道的評分

腸道病理損傷程度的評價采用Chiu氏評分法[15]。0 分：正常腸黏膜；1 分：絨毛頂部出現(xiàn)上皮下間隙；2 分：上皮下間隙繼續(xù)擴展；3 分：上皮層大塊分離伴部分絨毛頂部缺失；4 分：絨毛消失伴固有層、擴張的毛細(xì)血管裸露；5 分：固有層潰瘍、解體。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

將經(jīng)過初步處理后的數(shù)據(jù)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析以及Tukey氏多重比較，最終結(jié)果以 ±s表示，以P＜0.05為差異顯著性的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠原酸對鎘暴露大鼠生長性能的影響

表2 綠原酸對鎘暴露大鼠體質(zhì)量和進食量的影響（n＝8）Table 2 Effect of chlorogenic acid on body mass and feed intake of rats with cadmium exposure (n= 8)

由表2可知，鎘損傷造模1 周后，造模組第一周的體質(zhì)量增加量和進食量與空白對照組相比均無顯著性差異，綠原酸干預(yù)1 周后，Cd+CGA組第一周的體質(zhì)量增加量、進食量與模型組相比也無顯著性差異。鎘損傷造模2 周后，與空白對照組相比，Cd組的體質(zhì)量增加量和進食量顯著降低（P＜0.05）；與Cd組相比，Cd+CGA組的體質(zhì)量增加量與進食量顯著增加（P＜0.05），Cd+SSE的體質(zhì)量增加量與進食量也顯著增加（P＜0.05）。

表3 綠原酸對鎘暴露大鼠臟器指數(shù)的影響（n＝8）Table 3 Effect of chlorogenic acid on organ indexes of rats with cadmium exposure (n= 8)

由表3可知，重金屬鎘損傷造模2 周后肝臟指數(shù)較空白對照組、Cd+CGA組和SSE+CGA組顯著降低（P＜0.05）；腎臟指數(shù)也較空白對照組和Cd+CGA組顯著降低（P＜0.05）；空腸指數(shù)較空白對照組和Cd+CGA組顯著升高（P＜0.05）；回腸指數(shù)較空白對照組、Cd+CGA組和Cd+SSE組顯著升高（P＜0.05）。

2.2 綠原酸對鎘暴露大鼠血液生化指標(biāo)的影響

由表4可以看出，重金屬鎘損傷造模2 周后，血液中ALT活力較空白對照組、Cd+CGA組和Cd+SSE組顯著升高（P＜0.05），AST活力較空白對照組、Cd+CGA組和Cd+SSE組也顯著升高（P＜0.05），ALB的水平則較其他組均無顯著性變化。

表4 綠原酸對鎘暴露大鼠血液生化指標(biāo)的影響（n＝8）Table 4 Effect of chlorogenic acid on blood biochemical indicators of rats with cadmium exposure (n= 8)

2.3 綠原酸對鎘暴露大鼠腸道黏膜形態(tài)的影響

圖1 大鼠空腸黏膜形態(tài)（200×）Fig. 1 Mucosal morphology of rat jejunum (200 ×)

圖2 大鼠空腸絨毛高度（A）及隱窩深度（B）Fig. 2 Jejunum villus height (A) and crypt depth (B) in rats

空白對照組大鼠空腸黏膜的形態(tài)基本正常，腸黏膜絨毛結(jié)構(gòu)完整，絨毛排列整齊，上皮細(xì)胞排列整齊，間質(zhì)無水腫（圖1A）；Cd組大鼠空腸黏膜絨毛完整性被破壞，絨毛間質(zhì)疏松，腸絨毛排列極不規(guī)則，絨毛上皮壞死脫落，上皮層與固有層可見分離，固有層出現(xiàn)水腫（圖1B）；Cd+CGA組大鼠空腸黏膜形態(tài)基本正常，腸黏膜絨毛結(jié)構(gòu)比較完整，絨毛排列較造模組整齊，間質(zhì)無明顯水腫（圖1C、D）。由圖2A、B可以看出Cd組大鼠的絨毛高度和隱窩深度較空白對照組顯著降低（P＜0.05），Cd+CGA組和Cd+SSE組較Cd組絨毛高度和隱窩深度顯著升高（P＜0.05）。

2.4 腸道評分

圖3 大鼠空腸評分Fig. 3 Jejunum mucosal injury scores

Chiu氏評分法的結(jié)果見圖3，此評分體系中，得分越高組表明腸道黏膜損傷越嚴(yán)重?？瞻讓φ战M平均評分為0.75；Cd組平均評分為4，表明腸黏膜損傷很嚴(yán)重；Cd+CGA組平均評分為2.13，表明腸黏膜損傷較造模組得到了一定程度的改善；Cd+SSE組平均評分為2.38，表明腸黏膜損傷較造模組也得到了一定程度的改善。

3 討 論

生長性能是反映機體動物生長和營養(yǎng)狀態(tài)的比較直觀的指標(biāo)。鎘進入機體后會在機體內(nèi)大量蓄積，進而產(chǎn)生一系列毒性反應(yīng)，會嚴(yán)重影響生長期動物的食欲，從而使體質(zhì)量增加量受到影響。王靜[16]研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，染鎘組能顯著降低小鼠日平均增長體質(zhì)量，添加花青素可顯著增加染鎘大鼠的體質(zhì)量；Shim等[17]研究發(fā)現(xiàn)染鎘組日平均采食量與對照組相比顯著下降，添加小球藻粉末后可顯著使采食量增加；歐陽彩群[18]研究發(fā)現(xiàn)染鎘組大鼠肝臟指數(shù)與對照組相比存在顯著性差異；王林[19]研究發(fā)現(xiàn)染鎘組大鼠腎臟指數(shù)與對照組相比有顯著性差異，這些結(jié)論與本實驗得出的結(jié)果一致。腸道是鎘進入機體途經(jīng)的第一個器官，在腸道產(chǎn)生大量活性氧，這些自由基會使腸道上皮結(jié)構(gòu)被破壞，細(xì)胞產(chǎn)生水腫。結(jié)腸指數(shù)無顯著性差異的可能原因是鎘主要在小腸段被吸收，對結(jié)腸的損傷相對較小[20]。

肝功能是由肝酶標(biāo)記的等離子體（ALT和AST）決定的，Abdel-Rahim等[21]研究發(fā)現(xiàn)染鎘組大鼠可顯著刺激ALT和AST等離子體大量生成，這意味著鎘抑制了肝的活性，添加龍葵汁可顯著降低鎘引起的ALT和AST的增加量，這與本實驗結(jié)果是一致的。說明綠原酸能顯著抑制染鎘大鼠ALT和AST的大量合成，保護肝臟功能，降低鎘的毒性。

本實驗觀察的腸道黏膜形態(tài)與Zhao Zhaohui等[22]的研究結(jié)果是一致的。鎘暴露會使線粒體腫脹，從而使吸收細(xì)胞壞死[23]。從死細(xì)胞中釋放的細(xì)胞碎片或者酶可能傷害或者殺死相鄰的完整的細(xì)胞，從而放大鎘的毒性[24]。染鎘后大鼠腸道結(jié)構(gòu)的完整性遭到破壞，腸道絨毛高度降低，絨毛脫落，會減少腸道內(nèi)表面營養(yǎng)物質(zhì)的吸收面積，直接影響著動物生長發(fā)育。同時絨毛高度與上皮細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)，只有成熟的腸道絨毛上皮細(xì)胞才有吸收養(yǎng)分的功能。因此大鼠染鎘后絨毛高度降低，會使成熟的絨毛上皮細(xì)胞減少，則其養(yǎng)分吸收能力會降低[25-27]。本實驗結(jié)果表明綠原酸可顯著增加染鎘大鼠腸道絨毛的高度。小腸隱窩是絨毛根部的上皮陷入固有層而形成的管狀腺。隱窩深度主要是反映腸道上皮細(xì)胞的生成率。隱窩變淺時，成熟的細(xì)胞生成量會降低，分泌能力減弱，消化液的分泌隨之減弱，腸道吸收功能則也會減弱[28]。本實驗結(jié)果顯示染鎘大鼠隱窩深度較空白對照組顯著降低，使上皮細(xì)胞生成率下降，影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，而添加綠原酸可顯著使染鎘大鼠隱窩變深。

本實驗的研究結(jié)果表明，綠原酸可以改善染鎘大鼠腸道黏膜損傷，增加絨毛高度和隱窩深度，從一定程度上增加體質(zhì)量增加量和進食量，緩解器官指數(shù)失衡，能顯著抑制鎘造成的ALT和AST大量合成，保護大鼠肝臟功能，降低鎘的毒性作用。