麥冬皂苷D預(yù)處理對(duì)PM2.5介導(dǎo)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞炎性損傷的抑制作用及其機(jī)制

王瑩，宋磊，孫立燕，張珍珍，丁會(huì)

(吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院，吉林長(zhǎng)春130021)

大氣細(xì)顆粒物(PM2.5)即空氣動(dòng)力學(xué)直徑≤2.5 μm的細(xì)顆粒物，是工業(yè)化飛速發(fā)展的毒性產(chǎn)物。正常情況下，短期低濃度PM2.5吸入可被氣道表面的黏液吸附，并通過纖毛擺動(dòng)排出；而長(zhǎng)期高濃度PM2.5吸入可損傷氣道上皮，降低其清除能力，導(dǎo)致PM2.5堆積并停留在呼吸道；且部分PM2.5可穿透氣-血屏障入循環(huán)系統(tǒng)，引起和加重肺、心血管乃至整個(gè)機(jī)體的損傷[1]。研究證實(shí)，吸入PM2.5濃度與呼吸道疾病發(fā)病率呈正相關(guān)[2,3]，而NF-κB誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)表達(dá)是PM2.5引起炎癥反應(yīng)的主要機(jī)制[4]。麥冬皂苷D是從麥冬中提取的一種甾體皂苷類化合物[5,6]。王亮等[7]發(fā)現(xiàn)，麥冬皂苷D可通過抑制NF-κB信號(hào)通路對(duì)小腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生抗炎作用，但其是否可以減輕PM2.5誘導(dǎo)的氣道炎癥反應(yīng)及其作用機(jī)制尚不清楚。為此，我們于2017年12月～2018年4月進(jìn)行了如下研究。

1 材料

細(xì)胞：肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞MLE-12購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所。主要試劑：麥冬皂苷D(含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，中國(guó)Biotoppe公司)，PM2.5、DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Corning公司)，F(xiàn)BS、PBS、雙抗、胰蛋白酶、CCK-8試劑盒(中國(guó)Transgen公司)、二甲基亞砜、細(xì)胞核蛋白提取試劑盒(美國(guó)Sigma公司)，小鼠細(xì)胞上清 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 ELISA 試劑盒(中國(guó)Bpro公司)，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、ECL試劑盒(美國(guó)Thermo公司)，NF-κB p65一抗、GAPDH、HRP-goat anti-rabbit IgG、FITC Goat anti-Rabbit(美國(guó)ABclonal公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 PM2.5懸濁液及麥冬皂苷D溶液配制 ①PM2.5懸濁液：使用顆粒采樣器采集大氣PM2.5于玻璃纖維濾膜(孔徑2.5 μm)上，濾膜剪裁成直徑約1 cm的小片濾膜，浸泡在無(wú)菌蒸餾水中。水浴超聲儀中超聲震蕩 60 min，得到含有PM2.5的懸濁液，無(wú)菌紗布過濾，真空冷凝法干燥，再用無(wú)菌PBS配置成PM2.5懸濁液。應(yīng)用前超聲震蕩滅菌30 min，使顆粒物充分混勻。②麥冬皂苷D溶液：將麥冬皂苷D用DMSO配成質(zhì)量濃度為10 μmol/L的原液，實(shí)驗(yàn)時(shí)再用DMEM培養(yǎng)基稀釋至所需濃度(DMSO濃度小于總體積的0.01%)。

2.2 麥冬皂苷D安全用藥范圍觀察 采用CCK-8法。將MLE-12細(xì)胞接種于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MLE-12細(xì)胞，以5×103個(gè)/mL接種于96孔板，每孔100 μL，恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。每孔中加入麥冬皂苷D，使其終濃度分別為0、5、10、20、40、80、160、320 μmol/L。以不含藥物的細(xì)胞為陰性對(duì)照組，以含DMSO培養(yǎng)基的細(xì)胞為空白對(duì)照組，分別加入含0.01% DMSO的細(xì)胞培養(yǎng)液，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。37 ℃孵育24 h，加入CCK-8溶液10 μL/孔。作用2 h后使用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處的吸光度(A)值。細(xì)胞活性=(A藥物組-A空白對(duì)照組)/(A陰性對(duì)照組-A空白對(duì)照組)×100%。結(jié)果顯示，加入終濃度分別0、5、10、20、40、80、160、320 μmol/L麥冬皂苷D的MLE-12細(xì)胞活性分別為(100.37±1.02)%、(101.29±3.04)%、(100.05±2.53)%、(96.65±2.54)%、(96.87±2.80)%、(95.09±1.53)%、(88.53±1.95)%、(77.18±2.95)%；麥冬皂苷D濃度≤80 μmol/L時(shí)對(duì)MLE-12細(xì)胞活性無(wú)明顯影響(P均>0.05)，麥冬皂苷D濃度≥160 μmol/L時(shí)MLE-12細(xì)胞活性明顯下降(P均<0.01)。選取10、20、40、80 μmol/L麥冬皂苷D進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 麥冬皂苷D預(yù)處理對(duì)PM2.5介導(dǎo)的MLE-12細(xì)胞炎性因子及NF-κB p65表達(dá)影響的觀察

2.3.1 麥冬皂苷D預(yù)處理 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MLE-12細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為3×105個(gè)/mL，接種于6 孔板，每孔3 mL。將MLE-12細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照組、PM2.5組及麥冬皂苷D組，麥冬皂苷D組分別加入濃度為10、20、40、80 μmol/L麥冬皂苷D預(yù)處理1 h。預(yù)處理后麥冬皂苷D組及PM2.5組分別加入PM2.5混懸液，并調(diào)整其終濃度為80 μg/mL，作用24 h；空白對(duì)照組不作任何處理。

2.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)基上清炎性因子表達(dá)檢測(cè) 采用ELISA法。干預(yù)24 h 收集各組細(xì)胞培養(yǎng)基上清，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋后加樣、溫育、洗滌、酶標(biāo)顯色，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置空白孔消除背景差異。嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測(cè)各組培養(yǎng)基上清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的表達(dá)量。加終止液后10 min內(nèi)檢測(cè)各組450 nm波長(zhǎng)處的光密度(OD)值，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計(jì)算相應(yīng)濃度。結(jié)果顯示：PM2.5組培養(yǎng)基上清IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α表達(dá)均明顯高于空白對(duì)照組(P均<0.01)，加入80 μmol/L麥冬皂苷D的麥冬皂苷D組培養(yǎng)基上清IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α表達(dá)均低于PM2.5組(P均<0.01)。加入不同濃度麥冬皂苷D的麥冬皂苷D組培養(yǎng)基上清IL-8、TNF-α表達(dá)均高于對(duì)照組，加入10、20、40 μmol/L麥冬皂苷D的麥冬皂苷D組培養(yǎng)基上清IL-1β、IL-6表達(dá)均高于對(duì)照組(P<0.05或<0.01)。加入80 μmol/L麥冬皂苷D的麥冬皂苷D組培養(yǎng)基上清IL-1β、IL-6表達(dá)與對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 各組培養(yǎng)基上清炎性因子表達(dá)比較

注：與PM2.5組比較，*P<0.01；與對(duì)照組比較，#P<0.05，△P<0.01。

2.3.3 細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)NF-κB p65蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。干預(yù)24 h收集各組細(xì)胞，按細(xì)胞核蛋白提取試劑盒說明加入裂解液，依次提取細(xì)胞質(zhì)蛋白和細(xì)胞核蛋白。BCA法進(jìn)行蛋白定量，加入上樣緩沖液煮沸變性10 min，經(jīng)SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、封閉；加入NF-κB p65兔源一抗(稀釋倍數(shù)為1∶1 000)，4 ℃過夜，PBST洗3次后加入HRP標(biāo)記的抗兔二抗(稀釋倍數(shù)為1∶5 000)，室溫孵育1 h，PBST洗3次。加入ECL顯影液顯色，化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)下顯影成像，Image J軟件對(duì)目的條帶進(jìn)行灰度掃描。細(xì)胞核NF-κB p65蛋白以lamin B為內(nèi)參，細(xì)胞質(zhì)NF-κB p65蛋白以GAPDH為內(nèi)參；以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示,PM2.5組細(xì)胞核NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，細(xì)胞質(zhì)NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組(P均<0.01)；加入不同濃度麥冬皂苷D的麥冬皂苷D組細(xì)胞質(zhì)NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于PM2.5組，加入20、40、80 μmol/L麥冬皂苷D的麥冬皂苷D組細(xì)胞核NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于PM2.5組(P均<0.01)。見表2。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，麥冬皂苷D在人肺癌細(xì)胞中可通過調(diào)節(jié)NF-κB、PI3K/AKT及AP-1等多種信號(hào)通路，抑制腫瘤細(xì)胞增殖及化療增敏性，發(fā)揮抗腫瘤作用[8]；通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路，抑制氧化應(yīng)激改善糖尿病患者鈦合金植入物的成骨融合[9]；還可通過下調(diào)CYP2J2/EETs系統(tǒng)相關(guān)因子表達(dá)發(fā)揮抗炎作用[10]。近期研究發(fā)現(xiàn)，麥冬皂苷D可通過上調(diào)細(xì)胞色素450表氧化酶基因表達(dá)而抑制體內(nèi)炎癥反應(yīng)，從而減輕大鼠心肌肥厚[11]。本研究結(jié)果顯示，麥冬皂苷D干預(yù)濃度≤80 μmol/L時(shí)對(duì)MLE-12細(xì)胞活性無(wú)明顯影響，≥160 μmol/L時(shí)則可導(dǎo)致細(xì)胞活性明顯下降；表明高濃度麥冬皂苷D對(duì)MLE-12細(xì)胞生長(zhǎng)具有明顯抑制作用，其安全用藥范圍為≤80 μmol/L，此時(shí)細(xì)胞毒性較小。

表2 各組細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

注：與PM2.5組比較，*P<0.01；與對(duì)照組比較，#P<0.05，△P<0.01。

PM2.5能刺激肺上皮細(xì)胞及免疫細(xì)胞，促進(jìn)局部炎癥因子TNF-α、IL-6及IL-1等釋放，啟動(dòng)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)及放大肺組織局部炎癥反應(yīng)[12～14]。本研究結(jié)果顯示，PM2.5組培養(yǎng)基上清IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α表達(dá)均高于對(duì)照組，說明PM2.5可導(dǎo)致MLE-12細(xì)胞發(fā)生炎性損傷；加入80 μmol/L麥冬皂苷D的麥冬皂苷D組培養(yǎng)基上清IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α表達(dá)均低于PM2.5組，說明80 μmol/L麥冬皂苷D可明顯減輕PM2.5引起的MLE-12細(xì)胞炎性損傷。本研究加入不同濃度麥冬皂苷D的麥冬皂苷D組IL-8、TNF-α表達(dá)均高于對(duì)照組，加入10、20、40 μmol/L麥冬皂苷D的麥冬皂苷D組IL-1β、IL-6表達(dá)均高于對(duì)照組，而加入80 μmol/L麥冬皂苷D的麥冬皂苷D組IL-1β、IL-6表達(dá)與對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；說明安全范圍內(nèi)高濃度麥冬皂苷D可減輕PM2.5引起的MLE-12細(xì)胞炎性損傷，以80 μmol/L麥冬皂苷D的作用效果最好。

NF-κB是一種廣泛表達(dá)的炎癥調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子，其中NF-κB p65是NF-κB的活性形式，在某些有效刺激的作用下，激活的NF-κB會(huì)迅速由細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核，結(jié)合至TNF-α、IL-1β、IL-6等多種促炎基因啟動(dòng)子區(qū)的作用位點(diǎn)，從而激活上述基因的轉(zhuǎn)錄翻譯，導(dǎo)致多種炎癥因子的表達(dá)和釋放增加，促進(jìn)炎癥的發(fā)生；同時(shí)這些炎性因子反過來又可以激活NF-κB，形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致廣泛而持續(xù)的炎癥損傷[15]。細(xì)胞內(nèi)NF-κB p65總量處于恒定水平，細(xì)胞核內(nèi)活性NF-κB p65蛋白表達(dá)升高必然伴隨細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)降低，也伴隨NF-κB相關(guān)信號(hào)通路的啟動(dòng)激活。本研究結(jié)果顯示，PM2.5組細(xì)胞核NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，而細(xì)胞質(zhì)NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，說明PM2.5介導(dǎo)的MLE-12細(xì)胞發(fā)生炎性損傷可能與NF-κB入核及其相關(guān)信號(hào)通路激活有關(guān)。本研究中加入10、20、40、80 μmol/L麥冬皂苷D的麥冬皂苷D組細(xì)胞質(zhì)NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于PM2.5組，并呈劑量依賴性升高，而其細(xì)胞核NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量則呈相反趨勢(shì)；加入80 μmol/L麥冬皂苷D的麥冬皂苷D組細(xì)胞核NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于PM2.5組并與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；說明麥冬皂苷D可抑制PM2.5介導(dǎo)的MLE-12細(xì)胞NF-κB入核及其相關(guān)信號(hào)通路激活，以80 μmol/L濃度時(shí)的效果最明顯。

綜上所述，麥冬皂苷D預(yù)處理可減輕PM2.5引起的MLE-12細(xì)胞炎性損傷，80 μmol/L濃度時(shí)作用最明顯且細(xì)胞毒性較??；其機(jī)制可能與抑制NF-κB p65入核及其相關(guān)信號(hào)通路激活有關(guān)。