青海藏族肺結(jié)核患者與健康者循環(huán)miRNA表達(dá)差異性及海拔變化對患者miRNA表達(dá)水平的影響☆

久 太，顏然然，馮喜英，李玉紅，安文靜，劉洪千，王玉清，張 娟，韓曉茹，林宗斌

(1.青海大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科；2.青海大學(xué)，青海 西寧 810000；3.青海省第四人民醫(yī)院)

臨床研究顯示，青海藏族人群罹患肺結(jié)核者較多，本研究選用miRNA基因芯片法、實時熒光定量PCR(qRT-PCR)法等，對青海地區(qū)藏族結(jié)核病患者循環(huán)血中miRNA在表達(dá)水平上做比較分析，篩選出差異性表達(dá)的目的基因并對其作用做相關(guān)研究。

1 對象與方法

1.1 研究對象

1.2 主要儀器與試劑

實時熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)，Thermo NanoDrop2000C核酸檢測儀(美國Thermo公司)，超低溫冰箱(美國Thermo Fisher Scuentific公司)，離心機(jī)(5810R，德國eppendorf公司)，PCR儀(6325，德國eppendorf公司)，RNA血樣試管PAXgene RNA Tubes(貨號：762165，美國BD公司)，miRNA提取試劑試劑盒PAXgene Blood RNA Kit(貨號：763134，德國QIAGEN公司)，miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒miScript II RT Kit(貨號：218160，德國QIAGEN公司)，實時熒光定量PCR試劑miScript SYBR Green PCR Kit(貨號：218073，德國QIAGEN公司)，Human miFinder miscript miRNA PCR芯片(貨號：MIHS-001ZA，德國QIAGEN公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 血液采集

受試者于晨起空腹時用PAXgene RNA Tubes采集靜脈血2.5 mL，混勻，置-80 ℃冰箱保存。

1.3.2 血漿miRNA提取

按照Qiagen miRNeasy PAXgene RNA Kit 說明書進(jìn)行RNA提取，血樣融化后離心(4000g)15 min，留取試管底部的沉淀，經(jīng)無RNA酶水洗滌沉淀后加入Resuspension Buffer，沉淀轉(zhuǎn)入潔凈的EP管。依次加入Binding Buffer、PK溶液，渦旋使試劑與PBMC充分混勻，震蕩孵育(55℃)10 min。充分裂解細(xì)胞，釋放出miRNA。離心后將溶解有miRNA的上清液轉(zhuǎn)移至離心柱，使miRNA掛留于離心柱的芯片膜上。用DNA消解液除去DNA雜質(zhì)，洗去RNA消解液后極速離心(干燥離心柱芯膜)，滴加RNase-free water，極速離心收集液體。采用核酸檢測儀檢測最終收集的含miRNA的溶液的質(zhì)量，并記錄OD、miRNA濃度值和A260/A280等測定結(jié)果。miRNA穩(wěn)定性欠佳，各個樣品檢測完畢后要迅速儲存于-80 ℃冰箱。同時在實驗過程中應(yīng)盡量避免反復(fù)凍融。

1.3.3 PCR陣列芯片檢測

采用SYBR Green熒光染料檢測病例組和對照組的血漿樣品。嚴(yán)格按照SYBR Green qPCR Mastermix說明書進(jìn)行操作，待逆轉(zhuǎn)錄試劑解凍后，依次將逆轉(zhuǎn)錄引物、反應(yīng)底物、酶等等比配置反應(yīng)體系，將提取的miRNA模板加入體系中混勻后離心，收集反應(yīng)液使之聚于試管底部。用eppendorf 6325-PCR儀行逆轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)條件：37 ℃下孵育60 min，使miRNA與試劑充分進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，85 ℃下孵育5 min后終止反應(yīng)。試驗結(jié)束后所得轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋后行PCR熒光定量。cDNA溶液置-20 ℃冰箱保存(避免反復(fù)凍融，避免污染)。

以逆轉(zhuǎn)錄合成的第一鏈cDNA為模板進(jìn)行基因芯片檢測。反應(yīng)試劑溶解混勻后按比例移取反應(yīng)底物、聚合酶、SYBR Green熒光染料、PCR引物，混勻后加入模板cDNA，混勻離心，取室溫下平衡好的96孔 qPCR基因陣列芯片加樣。反應(yīng)板置入ABI7500熒光定量PCR儀中，選取Quantitation-comparative Ct，即△△Ct選項，選擇SYBR?Green Reagents選項，以標(biāo)準(zhǔn)速度進(jìn)行PCR反應(yīng)檢測。充分激活DNA聚合酶反應(yīng)條件設(shè)定為95.0 ℃，10 min，循環(huán)階段采用95.0 ℃，10 s，使基因變性；62.5 ℃，20 s，退火，使反應(yīng)酶與模板結(jié)合(準(zhǔn)備基因逆轉(zhuǎn)錄)；72.0 ℃，10 s，延伸復(fù)制，設(shè)定40個循環(huán)，并在延伸階段進(jìn)行熒光檢測。

1.3.4 qRT-PCR驗證

用實時熒光PCR法(結(jié)果結(jié)合文獻(xiàn)資料)篩選出差異表達(dá)倍數(shù)較大的miRNA進(jìn)行實時熒光定量PCR驗證。提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄后采用SYBR熒光染料定量檢測。選取U6作為內(nèi)參，反應(yīng)條件設(shè)定為95 ℃，15 min；94 ℃，15 s；55 ℃，30 s；70 ℃，30 s。同樣在延伸階段采集熒光檢測信號。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 miRNA提取的質(zhì)量與數(shù)量

所有納入研究對象的基本信息如表1所示。高、低海拔病例組白細(xì)胞數(shù)無差異，提示白細(xì)胞總數(shù)對高、低海拔肺結(jié)核患者發(fā)病影響不大。而高海拔組患者中性粒細(xì)胞百分比卻顯著低于低海拔組。高海拔結(jié)核組紅細(xì)胞數(shù)顯著高于低海拔，這些結(jié)果提示，以滲出、增生、壞死為基本病理變化的結(jié)核性病變因影響肺功能而加重缺氧程度，促進(jìn)代償性的紅細(xì)胞數(shù)目增加。加之高海拔低氧環(huán)境重疊影響，機(jī)體氧供降低，代償性紅細(xì)胞增多。中性粒細(xì)胞是白細(xì)胞組成成分，中性比增高表明體內(nèi)可能有細(xì)菌感染存在。低海拔病例組中性比高于高海拔地區(qū)，考慮與機(jī)體miRNA表達(dá)調(diào)控有關(guān)。所有樣本提取的miRNA經(jīng)Thermo Nanodrop2000C核酸檢測儀進(jìn)行質(zhì)量檢測，結(jié)果表明A260/280均>2.0，提取的miRNA樣品純凈，miRNA含量>30 ng。所提取的miRNA符合芯片檢測和qRT-PCR檢測的要求。

Table 1General data of the study

*：與健康組比較，P<0.05；◆：與結(jié)核組比較，P<0.05。

2.2 血漿miRNA芯片PCR陣列檢測結(jié)果

樣品參數(shù)檢測結(jié)果均達(dá)到質(zhì)控要求。將高、低海拔地區(qū)病例組分別與其對應(yīng)的對照組血漿miRNA表達(dá)結(jié)果對比。miRNA含量采用相對定量方法(2＾-△△Ct)表示，PCR陣列芯片檢測結(jié)果用Ct值表示，高海拔病例組樣本相對于低海拔樣本中miRNA的變化倍數(shù)(Fold Change，F(xiàn)C)用2＾-△△Ct計算表達(dá)。FC>1.5表明miRNA表達(dá)量明顯上調(diào)，F(xiàn)C<1.5表達(dá)量明顯下調(diào)，代表兩組間差異表達(dá)明顯[2]；設(shè)定篩選標(biāo)準(zhǔn)：CT值35，差異表達(dá)倍數(shù)FC>2[3]?；蛐酒琍CR陣列檢測結(jié)果顯示：共檢測到84個基因。分析基因表達(dá)譜，高海拔病例組血漿中miRNA有15種表達(dá)上調(diào)，低海拔病例組22種表達(dá)下調(diào)。采用聚類分析方法處理獲得實驗結(jié)果，結(jié)果以miRNA聚類熱圖表示(圖1)，本圖直觀地看出檢測基因中每一個檢測樣本的變化趨勢。

圖1miRNA差異表達(dá)聚類熱圖

Figure1ClusterheatmapofdifferentialmiRNAexpression

病例組與對照組miRNA表達(dá)結(jié)果以條形圖表示(圖2)，本圖直觀地得出高海拔地區(qū)病例組與對照組的比較結(jié)果。

圖2病例組、對照組miRNA差異表達(dá)圖

Figure2DifferenceofMiRNAexpressionbetweenthecasegroupandthecontrolgroup

不同海拔病例組間miRNA表達(dá)分析結(jié)果以散點圖表示(圖3)，本圖顯示，高海拔病例組miRNA較低海拔組有8種表達(dá)上調(diào)。

圖3不同海拔病例組miRNA表達(dá)散點圖

Figure3ScatterplotofmiRNAexpressionindifferentaltitudecasegroups

不同海拔病例組miRNA的比較情況以直條圖表示(圖4)，本圖顯示了高、低海拔病例組miRNA的表達(dá)比較結(jié)果。

圖4高低海拔結(jié)核組miRNA的比較圖

Figure4ComparisonofmiRNAbetweenhighandlowaltitudetuberculosisgroup

2.3 血漿miRNA樣品的qRT-PCR驗證結(jié)果

miRNA表達(dá)譜檢測結(jié)果顯示高海拔地區(qū)藏族肺結(jié)核患者與低海拔地區(qū)患者相比，miRNA表達(dá)有差異性。篩選出的基因按照FC降序排列，參照張衛(wèi)芳研究結(jié)論選取差異表達(dá)倍數(shù)較大且與低氧相關(guān)的miRNA(let-7e-5p、miR-144-3p[13])進(jìn)一步驗證。引物分別是，let-7e-5p：5′-AACTATACAATCTACTACCTCA-3′，5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTGAGGTAGTAGATTGTATAGTT-3′；miR-144-3p：5′-AGTACATCATCATCTATACTGTA-3′，5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTACAGTATAGATGATGTACT-3′。

以U6為內(nèi)參，計算采用 Ct(樣本基因)減去Ct(內(nèi)參基因)計算出每個樣本的△Ct，再將高海拔地區(qū)病例組樣本△Ct減去對照組△Ct，取所得結(jié)果的相反數(shù)，得到-△△Ct。此時所得結(jié)果有正負(fù)數(shù)不同的結(jié)果，mRNA表達(dá)量增加，上調(diào)則結(jié)果為正值，反之為負(fù)值，用-△△Ct表示表達(dá)量。高海拔地區(qū)藏族肺結(jié)核患者血漿miRNA表達(dá)量變化情況(表2)顯示，高海拔病例組miR-30e-5p、miR-302-3p、let-7f-5p、let-7e-5p、miR-144-3p較正常對照組變化較大，且其變化倍數(shù)高于低海拔藏族肺結(jié)核患者。與芯片PCR陣列檢測結(jié)果一致。

表2高海拔病例組miRNA差異表達(dá)的變化倍數(shù)(FC)

Table 2Variation multiples of miRNA differential expression in patients at high altitude

參照參考文獻(xiàn)及相關(guān)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)miRWalk、Pathway及功能富集分析[4，18]，miR-144-3p同時參與MAPK、JAK-STAT及Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制IFN-γ和TNF-α產(chǎn)生而抑制T細(xì)胞增殖[8]。而let-7e-5p作用于NF-κB通路。

3 討論

目前，參與炎癥調(diào)控的miRNA分子在高海拔藏族肺結(jié)核發(fā)病過程中的調(diào)控機(jī)制不明，也無針對性的關(guān)于藏族人群肺結(jié)核的基因標(biāo)志物研究。因此，本研究針對青海高、低海拔地區(qū)藏族肺結(jié)核患者血液miRNA表達(dá)情況進(jìn)行初步研究，并對差異miRNA的表達(dá)機(jī)制進(jìn)行相關(guān)分析。

基因芯片篩選出差異表達(dá)miRNA，從高表達(dá)的基因中篩選出高海拔藏族肺結(jié)核患者表達(dá)差異較大且相關(guān)性較低的兩個基因。如let-7e-5p在高海拔地區(qū)呈明顯高表達(dá)，F(xiàn)old Regulation為4.89，而較低海拔則為-1.08；miR-144-3p分別為4.89、-1.08；選定基因在高海拔藏族肺結(jié)核組明顯高表達(dá)，F(xiàn)C>2，而在低海拔藏族肺結(jié)核組表達(dá)水平不高，甚至低表達(dá)。基因通路富集結(jié)果提示靶基因主要集中于JAK-STAT、MAPK、NF-κB等結(jié)核感染后免疫相關(guān)的信號通路上[5]。本研究結(jié)果提示，高低不同海拔藏族肺結(jié)核患者血漿miRNA表達(dá)譜存在明顯的差異，且其可能通過調(diào)控免疫系統(tǒng)相關(guān)靶基因發(fā)揮作用。

MTB感染后誘發(fā)復(fù)雜的免疫反應(yīng)。miR-144-3p、let-7e-5p的靶基因主要集中在IL-10、IPAK1、TRAF6的mRNA影響巨噬細(xì)胞。Toll樣受體(Toll like receptor，TLR)作為巨噬細(xì)胞表面糖蛋白，可特異性識別入侵的MTB表面抗原決定簇，激活Jak-STAT、MAPK、NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，引起非特異性免疫應(yīng)答[6]。其中Jak-STAT通路激活后誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞自我凋亡，降低機(jī)體抗結(jié)核免疫能力。同時釋放出吞噬的MTB而感染擴(kuò)散，降低機(jī)體免疫力而罹患肺結(jié)核。MAPK通道激活后，促進(jìn)TNF-α、IL-10、MCP-1(單核細(xì)胞促化因子) 合成分泌，增強(qiáng)抗結(jié)核能力。同時激活NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，經(jīng)IPAK1、TRAF6蛋白調(diào)節(jié)后誘導(dǎo)產(chǎn)生NO合酶、NO，發(fā)揮抗結(jié)核殺菌作用。本研究中高表達(dá)的miR-144通過與IPAK1、TRAF6蛋白的mRNA相結(jié)合，抑制或降解靶基因mRNA，IL-1受體相關(guān)激酶1(IRAK1)和TNF受體相關(guān)因子6(TRAF6)合成減少，TLR識別MTB功能降低，同時其靶基因IL-6、IL-8、IL-1b和TNF-α的表達(dá)降低[7]；抑制MTB感染后機(jī)體的非特異性免疫反應(yīng)[8]，致免疫應(yīng)答功能降低。同時高表達(dá)的miR-144作用于MAPK通路，抑制TNF-α、IFN-γ等細(xì)胞因子的合成分泌，降低獲得性免疫應(yīng)答，導(dǎo)致機(jī)體感染發(fā)病。由上可知，miRNA在結(jié)核感染發(fā)病過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

時永輝研究發(fā)現(xiàn)[9]，高原缺氧環(huán)境對血漿miRNA的表達(dá)有一定的影響。參考以往研究，可知環(huán)境低氧或缺氧性疾病情況下，血漿miRNA也會發(fā)生差異性表達(dá)。例如，同時參與低氧、炎癥反應(yīng)，且評分較高又與我們研究結(jié)果具有交集的miR-let-7家族、miR-130家族和miR-144[10]等，在低氧情況下，參與低氧誘導(dǎo)因子(Hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)活動。HIF-1作為參與抗炎反應(yīng)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[11]，活化后與低氧反應(yīng)元件相結(jié)合，激活靶基因，由MAPK和胞外信號調(diào)節(jié)激酶作用于基因、酶等，調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞(DC)，激活T細(xì)胞，影響免疫細(xì)胞分化、免疫細(xì)胞功能[12]。過表達(dá)的HIF-1同時通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子3和IL-12調(diào)節(jié)，抑制1型輔助T細(xì)胞分化，降低免疫應(yīng)答[13]。全面分析可發(fā)現(xiàn)高原地區(qū)低氧環(huán)境作為誘導(dǎo)因素，可刺激HIF-1增多，調(diào)整機(jī)體狀態(tài)適應(yīng)高原環(huán)境。其中已知let-7e-5的表達(dá)與機(jī)體中HIF-1α具有明確的相關(guān)性[13]。低氧因素刺激HIF-1α高表達(dá)，高表達(dá)的HIF-1α作用于肺結(jié)核慢性炎癥激活機(jī)制中NF-κB通路上重要調(diào)節(jié)蛋白IPAK1、TRAF6，使其表達(dá)量降低，抑制機(jī)體免疫機(jī)制。因此，當(dāng)結(jié)核分枝桿菌感染后，與高表達(dá)的miRNA共同作用于巨噬細(xì)胞，減低識別吞噬作用，抵抗結(jié)核能力減弱，導(dǎo)致機(jī)體易感，出現(xiàn)高海拔地區(qū)藏族人群中肺結(jié)核發(fā)病率較高情況[1]。

綜上所述，高原地區(qū)藏族人群肺結(jié)核高發(fā)可能與其特有高表達(dá)的基因有關(guān)。高原低氧誘導(dǎo)高表達(dá)的let-7e-5p、miR-144-3p等作用于免疫反應(yīng)，抑制MTB感染后免疫應(yīng)答使機(jī)體易感。這些特異表達(dá)的基因有可能成為高海拔地區(qū)藏族人群結(jié)核病的生物標(biāo)志物。