探討二甲雙胍對(duì)T2DM患者外周血白細(xì)胞NF—κB和IL—1β的抑制作用

許曉玲

【摘要】 目的：檢驗(yàn)二甲雙胍應(yīng)用是否影響T2DM患者外周血白細(xì)胞NF-κB和IL-1β的表達(dá)。方法：本研究募集汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科2015年11月-2016年10月收住的T2DM患者117例，根據(jù)使用二甲雙胍與否分為對(duì)照組（未用二甲雙胍）和二甲雙胍組（口服二甲雙胍，500～2 000 mg/d）。收集所有患者的外周血標(biāo)本以檢測(cè)外周血白細(xì)胞（PBLs）數(shù)量、生化參數(shù)和C肽。并從PBLs中分離取得總mRNA。半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）用于檢測(cè)PBLs中NF-κB和IL-1β的表達(dá)。結(jié)果：二甲雙胍組空腹血糖、糖基化血紅蛋白、低密度脂蛋白膽固醇均明顯低于對(duì)照組，2小時(shí)C肽高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而兩組總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇和PBLs比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。相比對(duì)照組，二甲雙胍組FBG、HbA1c和LDL-C水平較低，而2 h C肽較高（P<0.05）。二甲雙胍組NF-κB和IL-1βmRNA表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：結(jié)果顯示二甲雙胍不止改善血糖、血脂及胰島素β細(xì)胞分泌功能，還通過(guò)抑制NF-κB/IL-1β信號(hào)通路而在T2DM患者中發(fā)揮抗炎作用，這為二甲雙胍在T2DM的抗炎益處提供了證據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 2型糖尿??； NF-κB； IL-1β； 二甲雙胍

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2018.16.009 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 B 文章編號(hào) 1674-6805（2018）16-00-04

The Discussion about the Effect of Metformin on the Expression of NF-κB and IL-1β in Peripheral Blood Leukocytes from Patients with Type 2 Diabetes/XU Xiaoling.//Chinese and Foreign Medical Research，2018，16（16）：-23

【Abstract】 Objective：To test whether metformin application affected peripheral blood leukocyte NF- B and il-1 in T2DM patients.Method：In this study，117 cases of T2DM patients in the department of endocrinology of the First Affiliated Hospital of Shantou University were collected from November 2015 to October 2016.According to the use of metformin，they were divided into the control group （without Metformin） and Metformin group （oral Metformin，500～2 000 mg/d）.

Peripheral blood samples were collected from all the patients for testing PBL counts，biochemicalparametersand C peptide.Total RNA was isolated from PBLs.RT-PCR was used to examine the expression of NF-κB and IL-1β in PBLs.Result：The fasting blood glucose，glycosylated hemoglobin and LDL cholesterol in metformin group were significantly lower than those in the control group，2 h C-peptide level was higher than that in control group，the difference was statistically significant（P<0.05）.The expression of NF- κ B and IL-1 β mRNA in metformin group was significantly lower than that in control group，the difference was statistically significant（P<0.05）.Conclusion：The results showed that metformin not only improved blood glucose，blood lipid and insulin β cell secretion，but also played an anti-inflammatory role in T2DM patients by inhibiting NF- κ B/IL-1 β signaling pathway，which provided evidence for the anti-inflammatory benefits of metformin in T2DM.

【Key words】 Type 2 diabetes； NF-κB； IL-1β； Metformin

First-authors address：Shantou Chaonan Minsheng Hospital，Shantou 515144，China

研究顯示T2DM是一種自身炎癥性疾病[1]。NF-κB/IL-1β炎癥信號(hào)通路在T2DM中發(fā)揮重要作用[2]，可能成為T(mén)2DM抗感染治療的潛在靶點(diǎn)，然而以炎癥作為靶點(diǎn)的治療還未應(yīng)用于臨床。有趣的是，現(xiàn)今用于降糖的藥物，一些具有抗炎活性，這可能有助于改善臨床結(jié)局。二甲雙胍是臨床治療T2DM的一線、基礎(chǔ)藥物，不止改善高血糖癥和胰島素抵抗，也具有抗炎、抗腫瘤和抗老化作用，并改善其他的心血管風(fēng)險(xiǎn)因素，如超重狀態(tài)或肥胖、致動(dòng)脈粥樣硬化血脂異常、高血壓、促凝狀態(tài)和頸動(dòng)脈內(nèi)膜厚度[3]。研究顯示二甲雙胍治療IGT患者能減少單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞各種促炎因子的釋放[4]。二甲雙胍應(yīng)用是否影響T2DM患者細(xì)胞NF-κB和IL-1β的表達(dá)，這需要進(jìn)一步印證。因此，筆者將T2DM患者分為二甲雙胍組及對(duì)照組，觀察二甲雙胍應(yīng)用對(duì)T2DM患者外周血白血病NF-κB/IL-1β信號(hào)表達(dá)的作用，并闡述其潛在的抗炎作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究募集汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科2015年11月-2016年10月收住的T2DM患者117例，診斷符合1999年WHO糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)，排除糖尿病急性并發(fā)癥和其他嚴(yán)重的系統(tǒng)性疾病。根據(jù)使用二甲雙胍與否，分為對(duì)照組（未用二甲雙胍）及二甲雙胍組（二甲雙胍500～2 000 mg/d）。對(duì)照組54例，男28例，女26例，年齡22～71歲，平均（53.22±10.70歲）；二甲雙胍組63例，男27例，女36例，年齡42～80歲，平均（61.08±7.78歲）。兩組患者一般性資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。本臨床研究已通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 PBLs分離 取新鮮外周抗凝血3～15 ml離心管中，400～500 g離心5 min，棄上清。加入6～10倍細(xì)胞體積的紅細(xì)胞裂解液（KHCO3 1.0 g，NH4C 18.3 g，EDTA-Na 0.037 g，加水至1 000 ml），輕輕吹打混勻，裂解4～5 min。400～500 g離心5 min，棄紅色上清。重復(fù)裂解一次。加入適量PBS（至少為細(xì)胞沉淀體積的5倍）洗滌1～2次，重懸沉淀，400～500 g離心2～3 min，棄上清。得到白細(xì)胞沉淀，用于提取總mRNA。

1.2.2 PBLs內(nèi)總mRNA的提取 根據(jù)TaKaRa Total RNA提取試劑盒的要求和配置，提取白細(xì)胞總RNA，用于RT-PCR實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 RT-PCR檢測(cè)PBLs中NF-κB和IL-1βmRNA表達(dá)水平 用所提取的白細(xì)胞總RNA合成cDNA一鏈（EasyScript First-Stand cDNA Synthesis SuperMix Kit Promega Biotech），進(jìn)行PCR擴(kuò)增（2*Taq PCR MasterMix kit TIANGEN Biotech）。PCR循環(huán)：94 ℃，3 min；循環(huán)28次（94℃，30 s；59 ℃，30 s；72 ℃，1 min）；最后72 ℃，10 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠成像系統(tǒng)拍照，Quantity-one軟件分析計(jì)算條帶灰度值，GAPDH作為內(nèi)參。引物序列見(jiàn)表1。

1.3 觀察指標(biāo)

比較兩組空腹血糖（FBG）、糖基化血紅蛋白（HbA1c）、2 h

C肽（2 h C-P）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白-膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白-膽固醇（LDL-C）、外周血白細(xì)胞（PBLs），以及兩組NF-κB/GAPDH和IL-1β/GAPDH表達(dá)水平等。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以（x±s）表示，組間比較采用兩組非獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組臨床資料檢查結(jié)果比較

二甲雙胍組空腹血糖、糖基化血紅蛋白、低密度脂蛋白-膽固醇均明顯低于對(duì)照組，2 h C肽高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而兩組總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白-膽固醇和PBLs比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表2。

2.2 兩組NF-κB/GAPDH和IL-1β/GAPDH表達(dá)水平比較

二甲雙胍組NF-κB和IL-1βmRNA表達(dá)水平均顯著低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表3、圖1。

3 討論

研究證明，炎癥在T2DM的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用[5]。橫斷面和前瞻性的研究顯示在肥胖和T2DM中具有高水平的急性時(shí)相標(biāo)志物（包括C-反應(yīng)蛋白、血清淀粉樣-A和唾液酸）、白細(xì)胞、血漿凝固因子（纖維蛋白和纖溶酶原活化劑抑制劑-1）、促炎因子（TNF-α、IL-1β和IL-6）和趨化因子[6]。在胰腺胰島，局部炎癥能減少胰島素釋放和觸發(fā)β-細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致胰島質(zhì)量下降，而這在T2DM病情進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[7]。因此，炎癥在T2DM的病理機(jī)制中發(fā)揮重要作用。

NF-κB在調(diào)節(jié)炎癥中發(fā)揮重要作用。在靜息狀態(tài)，NF-κB通過(guò)結(jié)合于細(xì)胞中kappa輕鏈多肽基因增強(qiáng)子抑制劑a（IkBa）而定位于胞漿。當(dāng)細(xì)胞受到炎癥等刺激時(shí)，kappa輕鏈多肽基因增強(qiáng)子抑制劑激酶b（IKKb）激活，磷酸化IkBa蛋白并使其降解，NF-κB得以被釋放并進(jìn)入細(xì)胞核，通過(guò)結(jié)合特定的基因啟動(dòng)子和增強(qiáng)子kB序列而轉(zhuǎn)錄激活一系列的炎癥基因[8]。研究顯示T2DM患者肌肉細(xì)胞IκBa含量降低，這提示增強(qiáng)的NF-κB信號(hào)[9]。NF-κB激活后，可增強(qiáng)TNF-a和IL-1β等的基因轉(zhuǎn)錄，促使其產(chǎn)生和釋放增加，后者又導(dǎo)致NF-κB的進(jìn)一步激活，構(gòu)成一個(gè)正反饋回路，造成不斷惡化的促炎癥反應(yīng)環(huán)境。

IL-1β是研究的最多的IL-1家族成員，因?yàn)槠湓诮閷?dǎo)自身炎癥性疾病中的作用[10]。研究發(fā)現(xiàn)，游離脂肪酸包括油酸、棕櫚酸和硬脂酸等可以刺激胰島Beta細(xì)胞產(chǎn)生IL-1[11]。而且IL-1可以刺激自身的表達(dá)，構(gòu)成一個(gè)嚴(yán)重的惡性循環(huán)[12]。

綜上所述，NF-κB/IL-1炎癥信號(hào)通路在T2DM中發(fā)揮重要作用，使其可能成為潛在的治療靶點(diǎn)以對(duì)抗T2DM疾病炎癥誘導(dǎo)的損傷。

二甲雙胍是治療2型糖尿病的基礎(chǔ)、一線、全程藥物，主要通過(guò)抑制肝臟糖異生而改善高血糖癥，同時(shí)提高肝臟和外周組織的胰島素敏感性[13]。前期研究顯示，除了在糖代謝中的作用，二甲雙胍也調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和發(fā)揮抗炎作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示二甲雙胍通過(guò)活化AMPK而抑制NF-κB活性，從而減輕細(xì)胞因子誘導(dǎo)的促炎因子和粘附分子基因的表達(dá)[14]。另外，在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊分離出的人類血管平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞中，二甲雙胍通過(guò)抑制NFκB 活性而抑制IL-1β誘導(dǎo)的IL-6和IL-8的釋放[15]。在實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈粥樣硬化家兔的大動(dòng)脈血管壁細(xì)胞中，二甲雙胍抑制IκB磷酸化和NF-κB活化，提示其潛在的抗炎特性。

在本研究中，二甲雙胍顯著降低T2DM患者的FBG和LDL，提高2 h C肽水平，并抑制PBLs中NF-κB和IL-1β的mRNA表達(dá)水平，這與前期細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的研究結(jié)果是相符合的。研究提示二甲雙胍不止改善血糖、血脂及胰島素β細(xì)胞分泌功能，還通過(guò)抑制NF-κB/IL-1β信號(hào)通路而在T2DM患者中發(fā)揮抗炎作用，這為二甲雙胍在T2DM的抗炎益處提供了證據(jù)。

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（收稿日期：2017-11-28）