CD47在乳腺癌及癌旁組織中的表達(dá)及其意義

陳 濤，王 璇，程 凱，馬恒輝，王婧潔，李漢君，曾慧娟，王璐璐，王少華

0 引 言

乳腺癌已經(jīng)成為女性發(fā)病率最高的腫瘤，且是女性癌癥中的頭號(hào)殺手[1-2]。隨著醫(yī)療技術(shù)不斷進(jìn)步，乳腺癌治療技術(shù)日漸成熟且多樣化，目前指南推薦的乳腺癌治療方法包括局部治療(手術(shù)、放療)，全身治療(輔助/新輔助化療、內(nèi)分泌治療及分子靶向治療)[3]。然而，對(duì)于進(jìn)展期或轉(zhuǎn)移性乳腺癌，仍然缺乏顯著有效的治療手段。近年來(lái)免疫治療作為一種新興的實(shí)體瘤治療方式漸漸成為研究熱點(diǎn)[4]。CD47是一種細(xì)胞跨膜蛋白，在人類(lèi)細(xì)胞中廣泛表達(dá)。CD47通常作為“別吃我”信號(hào)為人們所認(rèn)知，即表達(dá)CD47蛋白的細(xì)胞可通過(guò)激活吞噬細(xì)胞表面的SIRPα信號(hào)通路來(lái)防止被吞噬。乳腺癌細(xì)胞同樣有可能通過(guò)表達(dá)CD47來(lái)逃避免疫監(jiān)視。因此，本研究旨在探索CD47在乳腺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況，分析乳腺癌組織CD47的表達(dá)與患者臨床特征及預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)集收集通過(guò)cbioportal網(wǎng)站檢索TCGA(The Cancer Genome Atlas)數(shù)據(jù)庫(kù)中乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌數(shù)據(jù)集(2012，Nature)[5-6]，并從該網(wǎng)站下載數(shù)據(jù)集，包括基因數(shù)據(jù)及相關(guān)臨床數(shù)據(jù), 分析CD47基因突變及表達(dá)變異情況，其中基因數(shù)據(jù)包括4種類(lèi)型：基因擴(kuò)增、mRNA上調(diào)、mRNA下調(diào)、正常拷貝。將基因擴(kuò)增及mRNA表達(dá)上調(diào)分為上調(diào)組，mRNA下調(diào)及正?？截愓叻譃檎＝M，通過(guò)Kaplan-Meier分析法分析CD47表達(dá)與生存相關(guān)性。

1.2病例選取回顧性分析金陵醫(yī)院病理科2011-2015年的乳腺癌病例資料，隨機(jī)選取確診為乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌且術(shù)前未接受過(guò)治療的185例患者。這些患者的乳腺癌及癌旁組織均經(jīng)“中性甲醛固定-石蠟包埋”方式保存。其中Luminal A型35例，Luminal B型68例，表皮生長(zhǎng)因子受體-2(CerbB-2)過(guò)表達(dá)型28例，三陰性 54例?；颊呔鶠榕裕挲g為25～82歲，中位年齡53歲。對(duì)患者采用電話(huà)問(wèn)詢(xún)方式進(jìn)行隨訪，隨訪至2018年3月。

1.3免疫組化正常前列腺腺上皮細(xì)胞組織作為陽(yáng)性對(duì)照，前列腺細(xì)胞周?chē)Y(jié)締組織為陰性對(duì)照。兔抗人單克隆抗體抗CD47購(gòu)自SIGMA公司(稀釋濃度為1∶200)，使用EliVision法進(jìn)行免疫組化染色。

1.4結(jié)果判讀染色結(jié)果由2位病理科醫(yī)師采取雙盲法各自判讀，評(píng)估浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌細(xì)胞及正常乳腺導(dǎo)管腺上皮細(xì)胞膜蛋白及細(xì)胞質(zhì)蛋白中CD47的表達(dá)情況。判讀采用半定量法：按照染色強(qiáng)度及區(qū)域劃分四個(gè)等級(jí)，即0～3。細(xì)胞無(wú)染色為0分，細(xì)胞膜弱陽(yáng)性為1分，超過(guò)1/3細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)染色為2分，細(xì)胞膜強(qiáng)陽(yáng)性染色或超過(guò)2/3的細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)染色為3分[7]。判讀過(guò)程中僅評(píng)定乳腺腫瘤細(xì)胞及正常導(dǎo)管腺上皮細(xì)胞，而淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞不計(jì)入評(píng)定結(jié)果。依據(jù)乳腺癌細(xì)胞CD47表達(dá)情況，將患者分為陰性組及陽(yáng)性組，免疫組化染色結(jié)果判定為0分的為陰性組，1～3分的為陽(yáng)性組。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行分析，對(duì)評(píng)定結(jié)果采用二分法進(jìn)行分組。癌組織及癌旁組織CD47表達(dá)結(jié)果采用配對(duì)χ2檢驗(yàn)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)癌組織CD47表達(dá)情況與病理學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性采用χ2檢驗(yàn)方法，與生存預(yù)后的關(guān)系則采用Kaplan-Meier分析法分析，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1TCGA分析檢索TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌共825例樣本，其中CD47基因拷貝數(shù)發(fā)生突變(基因擴(kuò)增)6例(0.73%)，mRNA表達(dá)上調(diào)者16例(1.94%)，表達(dá)下調(diào)者19例(2.30%)，無(wú)變異者784例(95.03%)。對(duì)這些樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行生存分析，可見(jiàn)上調(diào)組中位總生存期為55.6個(gè)月，正常組中位總生存期為113.7個(gè)月(P=0.0256)。見(jiàn)圖1。

圖1 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中不同CD47基因突變類(lèi)型乳腺癌患者的生存分析

2.2CD47在乳腺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)形態(tài)學(xué)特征：鏡下可見(jiàn)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌呈實(shí)性巢狀或片狀分布，向四周浸潤(rùn)性推進(jìn)；腫瘤周?chē)梢?jiàn)不同程度地分布有淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，部分組織可見(jiàn)地圖樣壞死；癌細(xì)胞明顯增大呈卵圓形，核質(zhì)比增加，部分核可見(jiàn)分葉。正常乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞沿乳腺導(dǎo)管內(nèi)膜規(guī)則均勻分布排列，無(wú)核增大或分裂現(xiàn)象。CD47在乳腺癌細(xì)胞膜表面及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)比例高，染色深，正常乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞染色少見(jiàn)。見(jiàn)圖2。乳腺癌組織CD47陽(yáng)性表達(dá)率為56.21%(104/185)，癌旁組織中陽(yáng)性表達(dá)率為12.97%(24/185)，乳腺癌組織中癌細(xì)胞的CD47表達(dá)明顯高于正常乳腺上皮細(xì)胞(P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1乳腺癌組織及癌旁組織CD47表達(dá)差異(n=185)

癌旁組織癌組織+-P值+231<0.01-8180

2.3CD47表達(dá)與乳腺癌病理學(xué)特征相關(guān)性185例中，陰性組81例，陽(yáng)性組104例。通過(guò)分析乳腺癌組織中CD47的表達(dá)，<45歲乳腺癌患者CD47表達(dá)高于年齡≥45歲的乳腺癌患者(68.9%vs52.1%，P<0.05)，提示CD47可能與患者的年齡相關(guān)。而CD47在乳腺癌組織中的表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)、Ki-67指數(shù)、雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor,PR)、人類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)狀態(tài)、臨床分期未見(jiàn)相關(guān)。見(jiàn)表2。

2.4生存預(yù)后分析185例患者隨訪時(shí)間為13～89個(gè)月，中位隨訪時(shí)間59個(gè)月，其中14例失訪，所有患者3年生存率為92.6%，5年生存率為85.7%。3年無(wú)病生存率為86.5%，5年無(wú)病生存率為82.4%。Kaplan-Meier分析法分析顯示CD47陰性組與陽(yáng)性組生存未見(jiàn)明顯差異(P>0.05),未發(fā)現(xiàn)患者乳腺癌組織CD47表達(dá)與患者生存預(yù)后存在顯著相關(guān)性。見(jiàn)圖3。

表2乳腺癌組織中CD47表達(dá)與臨床病理學(xué)特征相關(guān)性(n=185)

項(xiàng)目CD47表達(dá)量-+P值年齡(歲)0.049 <451431 ≥456773ER狀態(tài)0.291 -3942 +4262PR狀態(tài)0.387 -4855 +3349腫瘤直徑(cm)0.111 <22926 ≥25278淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移0.689 無(wú)3947 有4257Ki-67指數(shù)?0.181 <202019 >205179Her2表達(dá)0.130 -6269 +1935臨床分期0.393 Ⅰ+Ⅱ4868 Ⅲ+Ⅳ3336?Ki-67指標(biāo)中,有16例患者未行Ki-67檢查

圖2 CD47在乳腺癌及癌旁組織的表達(dá)

a：總生存曲線；b：無(wú)病總生存曲線圖3 乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者CD47表達(dá)與臨床預(yù)后

3 討 論

CD47的作用之一是作為樹(shù)突細(xì)胞及巨噬細(xì)胞表面的信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白(signal regulatory protein-α，SIRPα)的配體[8]，通過(guò)與SIRPα結(jié)合避免被吞噬細(xì)胞吞噬。在細(xì)胞表面過(guò)表達(dá)CD47可能是腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視的一種生存策略。Kaur等[9]發(fā)現(xiàn)一種新型的非SIRPα依賴(lài)型的通路，通過(guò)這一信號(hào)通路，CD47抗體能夠抑制腫瘤干細(xì)胞的分化，維持腫瘤細(xì)胞干性特征。Zhang等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在離體實(shí)驗(yàn)中模擬缺氧環(huán)境，腫瘤細(xì)胞分泌的缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factors, HIFs)能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞表達(dá)CD47，HIFs和CD47相互協(xié)同下，能夠使腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視并維持癌細(xì)胞干性特征。Baccelli等[11]在檢測(cè)了Luminal A型乳腺癌的CD47表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)Luminal A型乳腺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞如果CD47和MET基因同時(shí)過(guò)表達(dá)，則患者更容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，且生存預(yù)后更差。Lo等[12]則發(fā)現(xiàn)，CD47的表達(dá)促進(jìn)了索拉非尼治療小鼠體內(nèi)肝癌時(shí)耐藥的發(fā)生。此外，應(yīng)用CD47相關(guān)抗體治療腫瘤已經(jīng)取得了一定療效，如聯(lián)合CD47抗體及利妥昔單抗，能夠促進(jìn)吞噬作用并殺滅非霍奇金淋巴細(xì)胞[13]。Willingham等[14]發(fā)現(xiàn)在CD47相關(guān)抗體的干擾下，多種人類(lèi)腫瘤在NSG小鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)均受到抑制。綜上，乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖及轉(zhuǎn)移可能與乳腺癌細(xì)胞過(guò)表達(dá)CD47相關(guān)，這提示CD47的過(guò)表達(dá)與乳腺癌患者預(yù)后相關(guān)。因此本研究的目的在于研究乳腺癌組織中CD47的表達(dá)情況，分析其與乳腺癌患者臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性。

盡管CD47在人體正常組織中廣泛表達(dá)，但有前期小樣本量研究[15]發(fā)現(xiàn)，正常乳腺組織中CD47陽(yáng)性率低，而在乳腺癌組織表達(dá)陽(yáng)性率高。本研究共入組了185例，結(jié)果表明乳腺癌組織CD47陽(yáng)性率明顯高于正常組織，與之前的研究一致。而且在年輕乳腺癌患者中(<45歲)，CD47表達(dá)率更高，但年輕乳腺癌患者CD47表達(dá)上調(diào)的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

CD47在TCGA數(shù)據(jù)中的基因檢測(cè)結(jié)果與本研究蛋白水平檢測(cè)結(jié)果存在差異，這提示CD47基因可能在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上存在調(diào)節(jié)因素。例如造血干細(xì)胞在穿過(guò)富含吞噬細(xì)胞的骨竇時(shí)，會(huì)通過(guò)表達(dá)CD47來(lái)避免被吞噬，當(dāng)其到達(dá)合適位置后，將重新下調(diào)CD47的表達(dá)[16]。腫瘤抑制基因如miR-133a[17]、miR-192[18]和癌基因MYC都能夠直接與各種腫瘤的CD47啟動(dòng)子區(qū)域相結(jié)合進(jìn)而調(diào)控CD47的表達(dá)[19]。同時(shí)有研究報(bào)道，腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein-78，GRP78)能夠通過(guò)未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)水平上調(diào)CD47的表達(dá)[20]。因此還需要進(jìn)一步探索調(diào)節(jié)CD47表達(dá)的相關(guān)機(jī)制。

在TCGA數(shù)據(jù)中，乳腺癌CD47基因擴(kuò)增或表達(dá)上調(diào)后對(duì)生存的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與部分學(xué)者的研究結(jié)果一致，提示CD47基因表達(dá)變異可以做為乳腺癌患者生存預(yù)后分析因素。但本研究中CD47免疫組化檢測(cè)結(jié)果與臨床預(yù)后的相關(guān)性并未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這可能與CD47基因可能在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上存在調(diào)節(jié)因素有關(guān)。因此CD47免疫組化結(jié)果能否作為乳腺癌患者生存預(yù)后的指標(biāo)仍需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

事實(shí)上，固有免疫僅僅是腫瘤免疫殺傷的一種方式，適應(yīng)性免疫同樣在腫瘤免疫殺傷中起著重要作用，有研究表明，乳腺癌患者是否出現(xiàn)腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與腋窩淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞構(gòu)成比相關(guān)[21]。在腫瘤細(xì)胞表面還表達(dá)有一種程序性死亡蛋白配體(programmed cell death 1 ligand，PD-L1)，通過(guò)與殺傷性T淋巴細(xì)胞表面的程序性死亡蛋白(programmed cell death 1，PD-1)結(jié)合從而抑制T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用[22]。Casey等[19]研究發(fā)現(xiàn)MYC基因能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞表面的PD-L1及CD47表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的增殖并增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)。因此，CD47對(duì)于乳腺癌的影響可能不僅僅是單因素的作用，其可能與多種其他免疫因素相互作用，共同調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究?jī)H檢測(cè)了乳腺癌組織中CD47的表達(dá)，未能得出與病理學(xué)指標(biāo)明顯相關(guān)的結(jié)論，這有可能是因?yàn)闃颖玖咳匀徊蛔阋?，也有可能是存在其他與CD47相互作用的因素從而影響了與病理特征的相關(guān)性。此外，本研究?jī)H進(jìn)行了橫斷面研究，未能進(jìn)行縱向?qū)Ρ妊芯坎〕踢M(jìn)展時(shí)CD47的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。因此CD47的表達(dá)在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及相關(guān)機(jī)制還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。

由于抗CD47抗體在多種腫瘤的體外試驗(yàn)中，尤其是治療急性粒細(xì)胞性白血病中取得了較好的效果[23]，而且除了發(fā)生貧血外，并不會(huì)對(duì)其他正常細(xì)胞或組織造成明顯影響[14]，目前世界范圍內(nèi)，已經(jīng)在進(jìn)行多項(xiàng)關(guān)于聯(lián)合CD47單克隆抗體靶向抗腫瘤的臨床試驗(yàn)。本研究通過(guò)大樣本研究了乳腺癌及癌旁組織中CD47的表達(dá)，驗(yàn)證了乳腺癌與癌旁組織中CD47表達(dá)存在顯著差異，為進(jìn)一步研究CD47在乳腺癌免疫逃逸及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用打下了基礎(chǔ)；為研究乳腺癌應(yīng)用CD47抗體進(jìn)行靶向治療提供了依據(jù)，也為乳腺癌治療提供了一種新的策略。