新疆不同地區(qū)開菲爾粒中乳酸菌的分離鑒定及篩選

王江月，王亮，鞏小芬，高恩燕，張恩鵬，劉朋龍，李陽

（1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013，2.新疆天潤生物科技股份有限公司，烏魯木齊 830088）

0 引 言

乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是一類能利用碳水化合物發(fā)酵并且產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌的總稱，是革蘭氏染色陽性、不運(yùn)動、無芽孢、過氧化氫酶陰性、發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生50%以上乳酸，而且在無氧的環(huán)境中生長良好的兼性厭氧細(xì)菌[1]。乳酸菌是主要的酸乳發(fā)酵菌種，產(chǎn)生多種風(fēng)味物質(zhì)及有益物質(zhì)。乳酸菌是于人體內(nèi)存在的益生菌，它可以調(diào)節(jié)人體胃腸道菌群，維持腸道內(nèi)微生物動態(tài)平衡，改善乳糖不耐癥，降低膽固醇，降低腫瘤發(fā)病率等[2]。

開菲爾粒（Kefir grains）是一種傳統(tǒng)的酒精發(fā)酵乳飲料——開菲爾（Kefir）的發(fā)酵劑，可以用于家庭或工業(yè)化的開菲爾生產(chǎn)[3]。開菲爾粒的主要組成菌為乳酸菌、酵母菌和醋酸菌等。開菲爾可調(diào)節(jié)腸道免疫系統(tǒng)[4]，具有抑菌[5]及抗腫瘤活性[6]。這與開菲爾粒中包含的大量益生菌有密不可分的關(guān)系。

在開菲爾飲品的生產(chǎn)過程中，由于傳統(tǒng)的開菲爾粒的特性，離開開菲爾粒就無法增殖傳代，且活力不穩(wěn)定，容易發(fā)生雜菌污染，共生菌群失衡導(dǎo)致品質(zhì)下降[7]。從中分離出益生乳酸菌進(jìn)行酸乳發(fā)酵，可避免此類現(xiàn)象發(fā)生并保留其益生性能。

本試驗(yàn)以新疆開菲爾粒為研究對象，對開菲爾粒發(fā)酵過程中的乳酸菌進(jìn)行分離、培養(yǎng)、發(fā)酵性能測定和篩選，以期獲得產(chǎn)酸性好、風(fēng)味濃郁的優(yōu)良乳酸菌菌株，其目的為工業(yè)化酸乳復(fù)合菌種發(fā)酵劑的研制提供優(yōu)良備選菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

開菲爾粒采集于新疆不同地區(qū)牧民家庭。

MRS肉湯培養(yǎng)基，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；過氧化氫、酚酞、乙醇、氫氧化鈉、三氯乙酸、鄰苯二胺、鹽酸、亞硫酸氫鈉、可溶性淀粉、0.10 mol/L碘標(biāo)準(zhǔn)溶液、0.01 mol/L碘8標(biāo)準(zhǔn)溶液、碳酸氫鈉、瓊脂，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；瓊脂糖、引物、LA酶Mix、溴化乙錠、TE緩沖液、細(xì)菌DNA提取試劑盒，上海生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超凈工作臺（AIRTECH垂直送風(fēng)SW-CJ-2FD），蘇凈安泰；全溫空氣搖床（QYC200），上海福瑪設(shè)備有限公司；小型高速離心機(jī)（Eppendorf 5418R），德國Eppendorf；p H計(jì)（FE20K），梅特勒-托利多；微量紫外分光光度計(jì)（UV-1601），北京瑞利分析儀器有限公司；手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器，上海三申醫(yī)療器械有限公司；高速冷凍離心機(jī)，凱特試驗(yàn)儀器公司；電泳儀（Mini-Sub cell GT），美 國 BIO-RAD；厭 氧 罐（AG0025A）、厭氧袋（AN 0025A），英國OXOID。

1.3 方法

1.3.1 開菲爾粒的活化

將開菲爾粒按3%比例接種到經(jīng)滅菌的牛乳中，37℃、140 r/min搖瓶培養(yǎng)24 h，用已滅菌的篩子過濾出開菲爾粒，用生理鹽水沖洗干凈，加入到新的滅菌乳中37℃、140 r/min搖瓶培養(yǎng)24 h。循環(huán)三次。

1.3.2 菌種的分離純化

將活化后的開菲爾粒加入到新的滅菌乳中，37℃、140 r/min搖瓶培養(yǎng)48 h，每隔4 h取樣1 mL開菲爾加入9 mL無菌水中，混勻后用無菌水按10倍比例逐級稀釋。吸取合適梯度的開菲爾稀釋液100μL涂布接種于MRS培養(yǎng)基平板上，37℃厭氧培養(yǎng)，待菌落長出后挑取優(yōu)勢菌落在MRS平板上反復(fù)劃線分離至菌落純，并進(jìn)行過氧化氫酶和革蘭氏染色試驗(yàn)，將過氧化氫酶陰性和革蘭氏陽性菌株接種到MRS斜面培養(yǎng)基中，經(jīng)培養(yǎng)后置4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。挑取單菌落于MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，吸取1 mL菌液于2 mL凍存管中，然后添加1 mL滅菌30%甘油，封口膜密封好后置于-75℃超低溫冰箱中凍存[8]。

1.3.3 乳酸菌16SrDNA序列鑒定和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

使用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取分離的乳酸菌DNA，采用16Sr DNA通用引物（正向引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；反向引物 1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將在1 500 bp處有清晰的條帶的PCR產(chǎn)物送往南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，將測得的DNA序列提交Gen Bank數(shù)據(jù)庫，使用NCBI的BLAST檢索系統(tǒng)（http：//www.ncbi.nlm.Gov/Blast/）對序列同源性進(jìn)行對比分析，99%～100%全序列相似性的細(xì)菌，判定為同一個種[9]。使用軟件MEGA5.05進(jìn)行序列分析，采用Neighbor-Joining法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析并構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.3.4 發(fā)酵性能測定

1.3.4.1 初級篩選

凝乳時間。挑取一環(huán)菌落，接種到MRS培養(yǎng)基中，37℃、140 r/min培養(yǎng)24 h。在滅菌牛乳中接入菌液，接種量為1×106cfu/mL，37℃靜置培養(yǎng)至凝乳，并記錄時間。最長靜置時間不能超過72 h。

酸度測定。滅菌牛乳凝固后，放入冰箱4℃冷藏，冷藏24 h后測定滴定酸度（GB 5009.239-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品酸度的測定》[10]）。

持水率測定。滅菌牛乳凝固后，將其4℃冷藏24 h后，測定其持水率。取一定量的酸乳，8 000 r/min，4℃離心15 min。棄上清液后稱重，并計(jì)算沉淀所占酸乳百分比。

感官評價。乳酸菌發(fā)酵的牛乳凝固后，放入冰箱4℃冷藏，冷藏24 h后組織20名具有感官評價資質(zhì)的專家對酸乳的甜度、酸度、組織狀態(tài)和香味進(jìn)行感官評價，每項(xiàng)5分。取適量試樣于50 mL燒杯中，在自然光下觀察色澤和組織狀態(tài)，再聞氣味，然后用溫開水漱口，品嘗樣品的滋味。

1.3.4.2 次級篩選

后酸化能力測定。牛乳凝固后放入4℃冰箱中保存，測定酸奶冷藏 1、5、10、15、20 d后的酸度（GB 5009.239-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品酸度的測定》[10]）。

產(chǎn)香能力的測定。滅菌牛乳凝固后，將其4℃冷藏24 h后，測定乙醛和雙乙酰的含量[11]。

冷藏期間活菌數(shù)的測定。牛乳凝固后放入4℃冰箱中保存，將冷藏1、5、10、15、20 d后的酸乳稀釋至合適梯度，涂布于MRS培養(yǎng)基上進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離及鑒定結(jié)果

將過氧化氫酶陰性和革蘭氏染色陽性的菌株進(jìn)行16SrDNA測序并且使用NCBI的BLAST檢索系統(tǒng)對序列同源性進(jìn)行對比分析后，得到22株開菲爾乳桿菌，3株腸膜明串珠菌和2株假腸膜明串珠菌。

圖1 分離出的乳酸菌基于16Sr DNA序列構(gòu)建的分子系統(tǒng)發(fā)育樹

由圖 1可以看出，NR 2、NR 3、XR 2、XR 3、XR 4、SXR 1、SXR 2、SXR 3、SXR 4、SXR 5、SKR 1、SKR 2、SKR 3、SKR 4、TXR 1、TXR 2、TXR 3、TXR 4、FXR 1、FXR 2、FXR3、FXR 4與Lactobacilluskefiristrain NM 180-3的距離非常接近；乳酸菌XR 1、NR 1、NR 4與LeuconostocmesenteroidesSD 7015的距離非常接近；T2、T 8與Leuconostocpseudomesenteroidesstrain 607非常接近，因此，NR 2、NR 3、XR 2、XR 3、XR 4、SXR 1、SXR 2、SXR 3、SXR 4、SXR 5、SKR 1、SKR 2、SKR 3、SKR 4、TXR 1、TXR 2、TXR 3、TXR 4、FXR 1、FXR 2、FXR 3、FXR 4被鑒定為Lactobacilluskefiri，XR 1、NR 1、NR 4被鑒定為Leuconostocmesenteroides，T2、T8被鑒定為Leuconostocpseudomesenteroides。

表1 開菲爾乳桿菌的初級篩選結(jié)果

2.2 發(fā)酵性能測定

2.2.1 初級篩選

在酸乳生產(chǎn)過程中凝乳時間過短或過長，都會對酸乳的風(fēng)味、質(zhì)構(gòu)等產(chǎn)生影響。凝乳時間過快，產(chǎn)酸速率過快，不利于香氣成分的形成，并且對凝乳狀態(tài)也會有不利的影響；凝乳時間過長，雖然有利于香氣成分的形成，但容易導(dǎo)致雜菌污染和生產(chǎn)效率下降[12]。SXR 2、SXR 5、 SKR 1、 SKR 3 和SKR 4在72h沒有出現(xiàn)凝乳，說明這幾株菌凝乳性能差。開菲爾乳桿菌中凝乳時間最短的是SXR 1和FXR 3，為 10 h。腸膜明串珠菌中T2和T8凝乳時間最短分別為8 h和10 h。

酸度是影響酸乳加工周期的長短、生產(chǎn)效率的快慢和風(fēng)味優(yōu)劣的一個重要指標(biāo)，產(chǎn)酸能力是酸奶生產(chǎn)用菌種篩選的重要指標(biāo)，一般以產(chǎn)酸能力中等，同時前產(chǎn)酸力較強(qiáng)，后產(chǎn)酸較弱為優(yōu)良菌種篩選標(biāo)準(zhǔn)[13]。開菲爾乳桿菌中酸度最高的是 FXR 3，高達(dá)144.1°T；最低為SKR 2，65.6°T。根據(jù)GB 5009.239-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品酸度的測定》[10]，酸乳中的滴定酸度不得小于 70°T，SKR 2小于70°T。酸度在公認(rèn)的較合適范圍 70～110°T[14]的有NR 2、 NR 3、 XR 2、 XR 3、XR 4、SXR 3、SXR 4、TXR 1、TXR 2、TXR 4、FXR 2、FXR 4。明串珠菌中T 2和T 8發(fā)酵酸度超過110°T，但可用于發(fā)酵干酪及其他用途，或與其他菌株復(fù)配可以抑制其發(fā)酵酸度過高的現(xiàn)象。XR 1、NR 1和 NR 4的發(fā)酵酸度均滿足70～110°T的要求。

持水率也是酸乳的的一個重要評價指標(biāo)。持水率過低會有乳清析出，乳清析出會直接影響酸乳的組織形態(tài)，不能成型，從而口感也會相應(yīng)下降。開菲爾乳桿菌中持水率最高的是FXR 3，高達(dá)81.8%；最低的是SKR 2，39.6%，和酸度的高低呈一定的相關(guān)性。明串珠菌中除NR 4外，其余四株菌持水率均能達(dá)到70%以上，持水率較高。

表2 明串珠菌的初級篩選結(jié)果

開菲爾乳桿菌中風(fēng)味較好的有NR 2、XR 3、SXR 1、TXR 3。其中甜度最高的是NR 3、SXR 4，最低的是XR 2、XR 4；酸度最高的是FXR 3，最低的是SKR 2;組織狀態(tài)最好的是FXR 3，最差的是NR 3、SKR 2、FXR 4，可以看出組織狀態(tài)與持水率和酸度都有一定的相關(guān)性；香味最好的是NR 2，最差的是XR 4。明串珠菌中風(fēng)味最好的是XR 1，NR 1次之。

以風(fēng)味優(yōu)劣為首要標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合酸度和持水率，初步篩選出比較合適作為發(fā)酵劑候選菌株的有開菲爾乳桿菌 NR 2、XR 3、SXR 1、SXR 3、SXR 4、TXR 2、TXR 3、TXR 4、FXR 1、FXR 3風(fēng)味較好并且發(fā)酵時間、產(chǎn)酸和持水率都較優(yōu)，腸膜明串珠菌NR 1、XR 1風(fēng)味好并且酸度持水率都較好。

2.2.2 次級篩選

2.2.2.1 后酸化能力

后酸化能力的強(qiáng)弱對于酸乳的保質(zhì)期的長短是一個決定性的因素。優(yōu)良的乳酸菌一般后酸化能力比較弱，抗后酸化能力強(qiáng)，產(chǎn)品貨架期長，酸乳4℃儲藏3周酸度僅增加7.5～10°T[15]。由表3可以看出，在21 d內(nèi)酸度在 110°T以下的有 NR 2、XR 3、SXR 3、TXR 2、TXR 3、TXR 4、FXR 1、XR 1。 酸 度 增 加 最 少 的 是SXR 3，僅增加了6.3°T；酸度增加最多的是SXR 4，增加了34.9°T。酸度增加在7.5～10°T范圍內(nèi)的有NR 2、TXR 4、XR 1。XR 3的酸度增加了10.5，僅高于最大范圍0.5°T，所以將其納入接受范圍內(nèi)。FXR 3酸度增加并不多，但因其初始酸度過高，以至于在冷藏期間一直保持較高的酸度，其滋味可能難以被消費(fèi)者接受。

表3 后酸化能力

2.2.2.2 產(chǎn)香能力

影響酸乳風(fēng)味的物質(zhì)種類繁多，而且并不是每一種風(fēng)味物質(zhì)都對食品的風(fēng)味起決定性作用，乳酸菌中與風(fēng)味有關(guān)的物質(zhì)主要有乳酸、醋酸、乙醛、雙乙酰、3-羥基-2-丁酮等[16]。為此，人們在研究風(fēng)味時，多是選擇幾種主要的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行研究。乙醛和雙乙酰是構(gòu)成酸乳典型風(fēng)味的重要化合物。乙醛的產(chǎn)生可以使酸乳具有典型的、新鮮的香味。要使酸乳達(dá)到典型的香味，乙醛的濃度需要在10～15μg/mL[17]。雙乙酰是酸乳的另一個重要的風(fēng)味物質(zhì)，乳酸菌利用檸檬酸生成雙乙酰，賦予酸乳一種堅(jiān)果果仁香味，即使含量甚微，但是仍可大大改善酸乳的風(fēng)味[18]。分析乙醛及雙乙酰含量，對酸乳的生產(chǎn)有著重要的意義。

表4 產(chǎn)乙醛和雙乙酰能力

由表4可以看出，除XR 3和FXR 3外，其余菌株的乙醛濃度均在10～15μg/mL范圍內(nèi)，產(chǎn)乙醛能力較好。10株菌雙乙酰含量均一般，但是即使含量低，也可大大改善酸乳風(fēng)味，并且乙醛和雙乙酰之間的比例也影響酸乳的風(fēng)味。雖然酸乳的風(fēng)味主要受乙醛、雙乙酰含量影響，但與酸奶中其他風(fēng)味物質(zhì)也有關(guān)系。

2.2.2.3 冷藏期間活菌數(shù)

活菌數(shù)是體現(xiàn)乳酸菌發(fā)酵制品是否具有保健性的重要指標(biāo)之一，產(chǎn)品中具有高的活菌數(shù)才能確保最終

有較多的乳酸菌進(jìn)入人體內(nèi)發(fā)揮其保健功能[19]。由圖2可以看出，10株菌的活菌數(shù)在3周內(nèi)都呈下降狀態(tài)，但都維持在1×106cfu/mL以上。SXR 3和TXR 3相對來說活菌數(shù)較少，在冷藏初期活菌數(shù)分別有3.5×107cfu/mL和1.3×107cfu/mL，冷藏3周后活菌數(shù)分別有2×106cfu/mL和2.7×106cfu/mL。在冷藏初期活菌數(shù)最高的是XR 3，活菌數(shù)為3.8×108cfu/mL；在冷藏3周后活菌數(shù)最高的是SXR 4，活菌數(shù)有1.0×108cfu/mL。FXR 1活菌數(shù)下降程度最小，XR 3活菌數(shù)下降程度最大。其中SXR 4和FXR 3在冷藏期間酸度一直處于較高的水平，但活菌數(shù)下降程度并不大，可能因其耐酸性比較好。

圖2 冷藏期間活菌數(shù)

3 結(jié) 論

對來自新疆不同地區(qū)的7種開菲爾粒中的乳酸菌進(jìn)行了的分離鑒定，共分離出22株開菲爾乳桿菌(Lactobacilluskefiristrain)，3株腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)和2株假腸膜明串珠菌(Leuconostocpseudomesenteroides)。經(jīng)初級篩選得到發(fā)酵時間較短、酸度適宜、持水率高并且風(fēng)味及組織狀態(tài)好、感官評價高的10株乳酸菌。然后再根據(jù)冷藏3周酸度變化、冷藏期間乳酸菌活菌數(shù)的測定以及產(chǎn)乙醛和雙乙酰能力，最終挑選出NR 2、XR 3、TXR 4、XR 1。其中NR 2和XR 3冷藏期間活菌數(shù)一直維持在較高水平，冷藏3周酸度升高程度較小，產(chǎn)乙醛能力較強(qiáng)，并且感官評價較好。TXR 4持水率高，冷藏3周酸度升高程度較小，產(chǎn)乙醛能力較強(qiáng)，并且感官評價較好。XR 1產(chǎn)酸能力強(qiáng)，持水率高，組織狀態(tài)好，冷藏3周酸度升高程度較小。因此，NR 2、XR 3、TXR 4、XR 1四株菌可作為為酸乳復(fù)合菌種發(fā)酵劑的配伍菌種使用。同時，本研究中發(fā)現(xiàn)幾株產(chǎn)酸性能強(qiáng)的菌株FXR 3、T 2、T 8等，可用于干酪或酸飲料的生產(chǎn)。