兩種分子分型技術(shù)在乳制品克諾羅桿菌污染溯源分析上的比較

郭清艷，鈕冰，楊捷琳

（1.上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200444；2.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局，上海 200135）

0 引 言

克羅諾桿菌屬Cronobacterspp.(2008年之前被稱為阪崎腸桿菌E.sakazakii)，在自然界中分布廣泛，可在嬰幼兒配方奶粉，沖調(diào)器具，奶粉加工場(chǎng)地及設(shè)備中分離到該菌[1-4]。阪崎克羅諾桿菌C.sakazakii作為Cronobacterspp.的代表菌種，易使免疫力低下的各階段人群感染患病，如腦膜炎，敗血癥和壞死性結(jié)腸炎[5]。早產(chǎn)兒，體重不足的新生兒以及嬰幼兒易感染C.

sakazakii，并造成40%～80%的致死率[6-9]。2002年，國(guó)際微生物食品標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)將E.sakazakii劃分為對(duì)部分人群存在嚴(yán)重危害的致病菌[10]。我國(guó)食藥監(jiān)局在2006版的《嬰幼兒配方奶粉生產(chǎn)許可證審查細(xì)則》中明確指出不得檢出E.sakazakii[11]。

最早E.sakazakii被認(rèn)為是腸桿菌科、腸桿菌屬(Enterobacterspp.)中陰溝腸桿菌的生物變型菌，并被命名為“黃色陰溝腸桿菌(yellow-pigmentedEnterobacter cloacae)”。直到1980年，F(xiàn)armer等做了一系列實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)“黃色陰溝腸桿菌”與檸檬酸桿菌屬和腸桿菌屬中的細(xì)菌有41%～50%的關(guān)聯(lián)，其表型和DNA與腸桿菌屬中的陰溝腸桿菌相似性更接近(50%)，由此將其歸于腸桿菌屬。但“黃色陰溝腸桿菌”與陰溝腸桿菌在個(gè)別生化反應(yīng)上不同，為此Farmer等建議將“yellow-pigmentedEnterobactercloacae”更名為“Enterobactersakazakii”[12]。此名稱被廣泛地采納，并沿用至今。2007年Iversen等通過(guò)對(duì)210株阪崎腸桿菌的多相分析方法測(cè)定，建立一個(gè)囊括了原來(lái)所有阪崎腸桿菌的新屬Cronobactergen.nov。這個(gè)新屬包括5個(gè)種分別是：Cronobactersakazakii、C.turicensis、C.malonaticus、C.muytjensii和C.dublinensis[13]。2012年對(duì)該屬的再次修訂，確定由7種菌種組成，添加C.universalis和C.condimenti。該分類是由全基因組分析支持，奠定7個(gè)菌種的分類地位[14-16]。

隨著Cronobacterspp.分類的不斷完整和細(xì)化，相應(yīng)的鑒定分型技術(shù)也在不斷發(fā)展。2002美國(guó)食品藥品管理局(U.S.Food and Drug Administration,FDA)推薦的嬰幼兒配方奶粉中阪崎腸桿菌的分析與計(jì)數(shù)檢測(cè)程序，MPN(Most Probable Number)法是阪崎腸桿菌早期的檢測(cè)方法。該方法一直被認(rèn)為是阪崎桿菌檢測(cè)的經(jīng)典方法，但耗時(shí)7 d左右，靈敏度不高且操作繁瑣[17]。API 20E(bioMe’rieux,法國(guó))是革蘭氏陰性腸道菌鑒定的常用的商品化試劑條[18]。Centinkaya[19]，Turcovsky[20]和Pan[21]都曾利用此方法對(duì)E.sakazakii進(jìn)行生化鑒定。該方法成本低，反應(yīng)快，但只可鑒定到屬的水平，且結(jié)果判定會(huì)因人而異，易產(chǎn)生誤差。脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)是針對(duì)致病菌爆發(fā)分子流行病學(xué)調(diào)查的黃金標(biāo)準(zhǔn)方法[22]。但PFGE存在一定限制,即使通過(guò)軟件分析PFGE凝膠的圖像，也需要對(duì)凝膠中位移或弱條帶進(jìn)行主觀的視覺判定，這樣就會(huì)引入人為誤差[23]。

相比之下，全基因組比較分析揭示了大量的遺傳多樣性，可用于將病原菌進(jìn)行快速準(zhǔn)確地分類，甚至到單一菌株水平。針對(duì)遺傳相關(guān)性十分接近的致病菌全基因組測(cè)序比PFGE更加準(zhǔn)確且分辨率更高，并提供許多額外的信息，包括MLST、單核苷酸多態(tài)性、功能基因分析等[24]。Antwerpen對(duì)15株土拉弗朗西斯菌(T.tularensis)的進(jìn)行全基因組測(cè)序，推出了一種新的基因研究方法MLST+[25]。McRobb結(jié)合了全基因組缺失基因分析和SNP系統(tǒng)進(jìn)化樹，對(duì)于研究流行病學(xué)致病菌提供了更高的分辨率[26]。目前對(duì)大腸桿菌已有較為深入的研究，其被分為許多亞型，每種亞型都具有不同的毒性和抗性。Ferdou發(fā)現(xiàn)對(duì)132株產(chǎn)志賀毒素的大腸桿菌分離株進(jìn)行全基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)屬于44種不同的序列類型(ST)，42種血清型和14種STX亞型組合[27]。

由于Cronobacterspp.分類地位的變化，導(dǎo)致目前對(duì)于Cronobacterspp.的溯源體系更為復(fù)雜多樣，采用何種更加有效的溯源分析方法，有效識(shí)別污染來(lái)源，對(duì)乳制品生產(chǎn)中Cronobacterspp.的防控更為重要。我們期待通過(guò)比較兩種分子分型方法，證實(shí)全基因組測(cè)序方法是對(duì)Cronobacterspp.進(jìn)行溯源分析或功能分析的重要研究手段。

1 材料與方法

1.1 材料

2005-2006年，在上?？诎秾?duì)進(jìn)口乳品進(jìn)行阪崎腸桿菌檢測(cè)，共分離獲49株阪崎腸桿菌，乳制品包括嬰幼兒奶粉，食品配料包括乳清粉和乳清蛋白粉，奶酪，奶粉以及其他類型的進(jìn)口乳制品，其中29%是乳清粉和乳清蛋白粉。乳制品來(lái)自9個(gè)不同的國(guó)家，其中新西蘭占最大比49%。樣品信息詳見表1。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離、復(fù)蘇與DNA的提取

參照美國(guó)FDA和加拿大衛(wèi)生部健康產(chǎn)品和食品部的推薦方法[28-29]，進(jìn)行樣品處理和E.sakazakii的分離。生化鑒定按API 20E試劑條產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行。按無(wú)菌操作程序進(jìn)行取樣前的樣品袋表面處理。每份樣品取約40 g，放入已預(yù)熱到45℃裝有360 mL無(wú)菌水的三角燒瓶中，輕輕搖動(dòng)使其充分溶解，36℃孵育過(guò)夜。移取上述混合液10 mL轉(zhuǎn)種到90 mL無(wú)菌腸道桿菌增菌肉湯中，36℃孵育過(guò)夜。充分混合增菌培養(yǎng)液，分別在結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板上進(jìn)行直接涂布或劃線分離，36℃培養(yǎng)過(guò)夜。過(guò)夜培養(yǎng)后，觀察平板上的菌落特征，挑取紫色及粉色疑似菌落分別劃線接種到胰蛋白酶大豆瓊脂平板，25℃培養(yǎng)48～72 h。挑取TSA瓊脂平板上所有菌落，根據(jù)API 20E試驗(yàn)指南進(jìn)行生化鑒定，同時(shí)做氧化酶試驗(yàn)。

分離獲得的所有菌株在-80℃下使用磁珠保存法儲(chǔ)存至今。49個(gè)菌株被成功復(fù)蘇，制成菌懸液。采用CTAB法提取細(xì)菌基因組DNA。

1.2.2 基因組測(cè)序組裝

采用Illumina HiSeq 2500平臺(tái)完成全基因組測(cè)序。對(duì)DNA碎片進(jìn)行環(huán)化擴(kuò)增，文庫(kù)構(gòu)建。經(jīng)末端修復(fù)、加A尾、加測(cè)序接頭、純化、PCR擴(kuò)增等步驟完成整個(gè)文庫(kù)制備。文庫(kù)構(gòu)建完成后，進(jìn)行初步定量稀釋、檢測(cè)，插入片段大小再次準(zhǔn)確定量確保文庫(kù)質(zhì)量。最后進(jìn)行測(cè)序。原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾處理后，將有效數(shù)據(jù)(Clean Data)。使用 SOAPdenovo（version 2.04）軟件進(jìn)行組裝[30-31]。

1.2.3 多位點(diǎn)序列分型

目前數(shù)據(jù)中現(xiàn)有的Cronobacterspp.記錄有2000多株，分別來(lái)自23個(gè)以上的國(guó)家，源自中國(guó)的菌株占33.26%。管家基因?yàn)榛蚪M內(nèi)400-600bp的核苷酸序列，每個(gè)位點(diǎn)根據(jù)其發(fā)現(xiàn)的時(shí)間順序賦予一個(gè)等位基因編號(hào)，每一株菌的等位基因編號(hào)按照指定的順序排列就是它的等位基因譜，也就是這株菌的序列型[32]。

Cronobacterspp.的7個(gè)管家基因分別是atpD,fusA,glnS,gltB,gyrB,infB,pps。菌株的序列型通過(guò)CronobacterMLST公共數(shù)據(jù)庫(kù)上(https：//pubmlst.org/cronobacter/)的在線工具確定，選擇Sequence query下的MLST，再將49個(gè)菌株的全基因組數(shù)據(jù)粘貼到數(shù)據(jù)庫(kù)，得到菌株的ST[33]。并在線使用geoBRUST軟件，依據(jù)7管家基因位點(diǎn)和國(guó)家生成分布圖(圖1)。

表1 49株菌株的基本信息和序列型

1.2.4 單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)分析

對(duì)32株ST13的阪崎克羅諾桿菌進(jìn)行SNP分析，使用軟件SMALT和SAMtools[29-30]。選取最早分離得到的菌株CS-1作為參考序列。使用VCFTools軟件對(duì)VCF文件過(guò)濾，參數(shù)設(shè)定為得分最低30，深度最小8.0以及等位基因頻率最小0.90[34-36]。SNP分析結(jié)果包括同義突變和反義突變。每個(gè)突變位點(diǎn)被串聯(lián)一起，依據(jù)最大似然法構(gòu)建進(jìn)化樹，最后使用Figtree v 1.3軟件進(jìn)行可視化和注釋。

2 結(jié)果

2.1 MLST分型

49個(gè)C.sakazaii菌株通過(guò)MLST分型，分為8個(gè)不同的序列型，包括 ST1，ST4，ST 13，ST375，ST12，ST21，ST233和ST42。各序列型占比極不平衡。圖1中ST13的Csakazakii(n=32，65.3%)占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，其次是 ST 4(n=6，12.2%)，ST 375占 比 8%(n=4)。 ST12，ST 233，ST42，ST 12均對(duì)應(yīng)單個(gè)菌株。ST13菌株中來(lái)源組成多樣且不平均，共6個(gè)國(guó)家，其中新西蘭來(lái)源占50%（16/32）。ST4由三個(gè)國(guó)家組成，美國(guó)占比50%。ST 375由新西蘭和波蘭占一半比例。圖2是產(chǎn)品種類與序列型之間的關(guān)系。同樣ST 13菌株的產(chǎn)品類型組成最為復(fù)雜，其中嬰幼兒奶粉占比最大，其次是ST 4菌株來(lái)自4種產(chǎn)品組成，食品配料占比最大。

圖1 菌株的序列型與國(guó)家之間的關(guān)系

圖2 菌株的序列型與產(chǎn)品類別之間的關(guān)系

2.2 CC13菌株的SNP分析

為了對(duì)ST13的C.sakazakii的深入分析，采用SNP方法進(jìn)行分型，結(jié)果分為4個(gè)Group和5個(gè)單獨(dú)的菌株。表2統(tǒng)計(jì)了各ST13菌株詳細(xì)的SNP數(shù)量，由圖3可知，Group 1包括12個(gè)菌株，CS-6和CS-37單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)最多11。Group2形成兩個(gè)明顯的分支，每個(gè)分子由4個(gè)菌株組成。Group3僅由兩個(gè)菌株組成，來(lái)自新西蘭的CS-19和CS-36。Group4由5個(gè)菌株組成，最大的SNP數(shù)仍是11。此外獨(dú)立的5個(gè)菌株分別是CS-72，CS-18，CS-71，CS-56和CS-48,其中CS-71含有5378個(gè)SNP,遠(yuǎn)高于其他菌株的SNP數(shù)。

表2 ST13 C.sakazakii菌株的SNP分析結(jié)果

圖3 ST13株阪崎克羅諾桿菌的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

一直以來(lái)，MLST多位點(diǎn)序列分型方法被認(rèn)為是區(qū)分Cronobacterspp.菌株穩(wěn)定且可靠的方法。圖1顯示8種已知不同的序列型之間的關(guān)系，并可見菌株序列型和地理位置上存在的不平衡分布，有一定相關(guān)性，相同序列型的菌株聚簇明顯跟菌株的分離國(guó)家相關(guān)[37-38]，比如說(shuō)CC13有超過(guò)一半的菌株源自新西蘭。MLST分型共得到8個(gè)不同的ST序列型，其中4個(gè)ST(ST 1，ST4，ST12，ST13)都與C.sakazakii感染臨床案例有關(guān)[39-41]。值得注意的是，ST13菌株在本研究占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)比例（65%）。1994年法國(guó)的新生兒重癥監(jiān)護(hù)室因C.sakazakii感染引發(fā)疾病爆發(fā)，調(diào)查分離得到5株ST 13的C.sakazakii菌株[40]。分離自嬰幼兒乳制品的10株C.sakazakii，全部屬于ST13。當(dāng)時(shí)未見國(guó)內(nèi)因感染阪崎腸桿菌的臨床案例報(bào)道，可能與當(dāng)時(shí)對(duì)該菌的認(rèn)識(shí)不夠透徹相關(guān)。ST4菌株的來(lái)源多樣，包括美國(guó)，意大利，和新西蘭。相隔甚遠(yuǎn)的三個(gè)國(guó)家，位于三個(gè)不同的大洲，證明在ST4C.sakazakii的分布廣泛以及較強(qiáng)的適應(yīng)性。

針對(duì)食源性致病菌流行病事件的溯源分析，多位點(diǎn)序列分析是進(jìn)行初步分型的有力工具。但對(duì)于對(duì)序列相似較高的菌株的分型，存在一定限制。單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)分析（SNP分析）被證明在DNA水平上擁有最全面最準(zhǔn)確的的分辨能力。故我們選擇SNP分析對(duì)32株ST13C.sakazakii進(jìn)一步分型分析。圖3可見由32個(gè)ST13菌株組成的最復(fù)雜的系,通過(guò)SNP分型，被分成4個(gè)Group和5個(gè)獨(dú)立的菌株。5個(gè)獨(dú)立的菌株中，源自法國(guó)的CS71含最多的SNP數(shù)，距離參考序列CS1最遠(yuǎn)。而其余4個(gè)獨(dú)立的菌株均源自新西蘭，SNP數(shù)在8～15之間。在圖3中Group1是相對(duì)最復(fù)雜的組分，其中CS61和CS32，CS14和CS66在Group1中分別擁有共同的祖先，且也源自相同國(guó)家新西蘭和美國(guó)，證明來(lái)自同一國(guó)家的菌株傾向于聚簇在一起。Group2由8個(gè)菌株組成，形成兩個(gè)明顯分支，兩個(gè)分支的傳播路徑均是從大洋洲的新西蘭，澳大利亞到歐洲的法國(guó)。Group3是源自新西蘭的兩株阪崎克羅諾桿菌，再次證明序列型與國(guó)家之間的相關(guān)性。由5個(gè)菌株組成的Group4，傳播路徑是從美國(guó)到澳大利亞，再至新西蘭。明顯Group2和Group4的傳播方向在地理上剛好構(gòu)成一個(gè)三角循環(huán)，不難想象在2005-2006年間，在歐洲，大洋洲，北美洲的乳制品之間的頻繁貿(mào)易，的確對(duì)ST13C.sakazakii的傳播有促進(jìn)作用。

通過(guò)全基因組測(cè)序，我們不僅可以獲得其MLST分型結(jié)果，還可以對(duì)相同ST的菌株做進(jìn)一步的個(gè)性化分析，如文中采用了單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)分型方法，成功對(duì)32株ST13菌株進(jìn)一步分型，為類似致病菌的溯源分析提供思路。隨著下一代測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展和普及，如今二代測(cè)序的成本已大大降低，測(cè)序時(shí)間也大為縮短，其價(jià)格基本等同于單做多位點(diǎn)序列分析的費(fèi)用，因此通過(guò)本次研究，我們提倡在對(duì)致病菌進(jìn)行溯源分析時(shí)采用全基因組分析，同時(shí)還可以深入進(jìn)行基因組的功能分析。

4 結(jié) 論

本研究為乳制品攜帶C.sakazakii致病菌污染事件的分子溯源提供了技術(shù)儲(chǔ)備,豐富了C.sakazakii的MLST數(shù)據(jù)庫(kù)，為應(yīng)用全基因組測(cè)序進(jìn)行MLST和SNP方法研究分析不同來(lái)源Cronobacterspp.的分子流行病學(xué)提供依據(jù),有助于該菌的主動(dòng)監(jiān)測(cè)和溯源,為預(yù)防和控制與該菌有關(guān)的食源性疾病發(fā)揮重要的作用。