青海湖裸鯉腸道乳酸菌多樣性與抗生素抗性的研究

王露瑩，齊博文，趙晨曦，崔美巖，談重芳

（鄭州大學物理工程學院 鄭州 450001）

0 引 言

乳酸菌是革蘭氏陽性菌，可發(fā)酵可溶性碳水化合物產生乳酸、乙酸，廣泛存在于人和動物腸道、植物表面、發(fā)酵乳制品、酸泡菜、青貯飼料等環(huán)境中，在食品加工中具有悠久的應用歷史，被公認為安全性菌株(Generally regarded as safe，GRAS)[1]。由于乳酸菌對人體健康有著重要的作用，近年來其相關食品行業(yè)迅速發(fā)展。

青海湖裸鯉(Gymnocypris przewalskii)俗稱“湟魚”，屬鯉形目(Cypriniformes)，鯉科(Cyprinidae)，裂腹魚亞科(Schizothoracinae)，裸鯉屬(Gymnocypris)，是青海湖中重要的經濟魚類，處于青海湖整個生態(tài)系統(tǒng)的核心地位[2]。雖然抗生素作為飼料添加劑具有巨大的經濟效益，但它在長期使用中會造成病原體的突變、引起抗藥性等問題，使用已受到了嚴格的限制。而另一方面乳酸菌作為保健、提高免疫類產品，作用效果也得到逐步的認可，但在實際生產中，其不能完全替代抗生素的作用，需要將二者配伍使用才能發(fā)揮最好的效果[3]。無論是內源益生乳酸菌還是外源乳酸菌都無法避免和抗生素的正面接觸，因此開展益生菌對抗生素的敏感性研究很有價值[4]。現(xiàn)階段對青海湖裸鯉腸道益生菌的研究比較空缺，本文就青海湖裸鯉腸道乳酸菌的生理生化特性以及抗生素敏感性進行了分析，為青海裸鯉腸道益生菌的開發(fā)與利用提供支持。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

DNA提取試劑盒。PCR擴增儀，凝膠成像儀，電泳儀等。

1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母膏10.0 g，葡萄糖20.0 g，乙酸鈉5.0 g，吐溫80 1.0 mL-1，磷酸氫二鉀 2.0 g，檸檬酸銨2.0 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g。NA培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化鈉5.0 g。CLO培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨15.0 g，大豆蛋白胨7.5 g，酵母膏7.5 g，牛肉膏7.5 g，檸檬酸鐵銨1.0 g，亞硫酸氫鈉1.0 g，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.75 g。以上培養(yǎng)基pH值均為6.5～7.0。固體培養(yǎng)基瓊脂粉加入量質量濃度為17 g/L。PDA培養(yǎng)基加入質量分數(shù)為10%的酒石酸[5]。

1.3 樣品的采集

2014年10月份從青海湖采集裸鯉樣品，樣品來源及其重量如表1所示。

表1 青海湖裸鯉樣品采集情況

1.4 樣品的處理

新鮮的魚腸用無菌剪刀切碎后取5 g放入45 mL無菌水中，用漩渦振蕩器振蕩30 s，按10-1，10-3，10-5的稀釋梯度各取20μL涂布在MRS，PDA，EMB，NA培養(yǎng)基中；將1 mL10-1和10-2樣品稀釋液75℃水浴15 min后涂布在NA及CLO培養(yǎng)基上，每個樣品做個平行。30℃倒置培養(yǎng)48 h，MRS及CLO培養(yǎng)基放置于厭氧培養(yǎng)箱。對MRS平板進行菌落計數(shù)，根據(jù)菌落大小、形態(tài)和顏色等特征，挑取單菌落在MRS培養(yǎng)基上劃線純化2次，-80℃下保存在10%二甲基亞砜NB培養(yǎng)基中備用[6]

。

2 生理生化性質的檢測

2.1 形態(tài)特征

用肉眼直接觀察培養(yǎng)基上疑似菌落的形態(tài)、大小、色澤和突起等。用革蘭氏染色（革蘭氏陽性或革蘭氏陰性）實驗的方法在顯微鏡下仔細觀察染色結果和細胞形態(tài)。

2.2 生理特征

代表株的生理生化性狀檢測包括耐鹽(NaCl)濃度、pH值生長范圍、溫度生長范圍實驗等[7]。

2.2.1 pH值范圍生長測定

用濃度為1 mol/L的鹽酸和1 mol/L的氫氧化鈉調節(jié)MRS液體培養(yǎng)基，使其p H值為3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0,8.5,9.0,9.5,10.0。分別用這些培養(yǎng)基進行代表株接種實驗，放置到30℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。其中p H=6.5的培養(yǎng)基作為對照組。

2.2.2 耐鹽質量分數(shù)測定

將菌株分別接種于NaCl質量分數(shù)為3.0%和6.5%的MRS液體培養(yǎng)基（pH值為6.5）中，并放置到30℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩天。無NaCl的MRS液體培養(yǎng)基作為對照組。

2.3 生化特性

代表株的生化特性測定包括：過氧化氫酶實驗、發(fā)酵葡萄糖產氣實驗(同型或異型發(fā)酵實驗)。

3 菌株的分子生物學檢測

3.1 菌落PCR

將菌株接種在MRS固體培養(yǎng)基上厭氧培養(yǎng)48 h，挑取單菌落進行PCR擴增，引物選用細菌的16S rRNA基因擴增的通用引物：27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCT TGTTACGACTT-3’)。PCR反應體系為50μL：Premix Taq25μL,27F和1492R(濃度均為20 mmol/L)1 mL，補充滅菌蒸餾水至50μL，用10μL無菌槍頭在單菌落挑取少許，加入反應體系，進行PCR擴增。待擴增完成后，在1%瓊脂糖凝膠中電泳，電泳結束后，用EB溶液染色，在紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察[8]。

3.2 16SrRNA基因序列分析

將PCR產物送到華大基因公司測序，將測序所得長度約1 500 bp左右的16S rRNA基因序列在GeneBank中使用程序Blast尋找與其最大同源性的的序列。如果測序菌株與標準菌株間的16SrRNA基因同源性值在97.5%以上，一般就可判定它們屬于同一個種[9]。

4 抗生素抗性的檢測

乳酸菌在MRS固體培養(yǎng)基中,30℃活化，接種到液體MRS培養(yǎng)基中。將培養(yǎng)好的乳酸菌菌液用生理鹽水稀釋50倍加入滅菌試管中。根據(jù)各種藥品在全價料中的常規(guī)添加量計算所需藥品量，精確稱取后，無菌操作溶解于溶液中即為濃度C0的藥液，同時使用0.5C0和2C0作為對照。以不添加抗生素的試管作為空白對照。在37℃條件下反應4 h后，用MRS瓊脂平板計菌數(shù)。實驗結果用添加抗生素的實驗組與不加抗生素的對照組的存活比率表示[4]。

5 結果與分析

5.1 裸鯉腸道樣品中微生物的多樣性

青海湖裸鯉腸道樣品中微生物的分布情況如表2所示。表2中，除樣品F5，F(xiàn)16，F(xiàn)17以及F20外；其余樣品中都檢測到乳酸菌的存在，其數(shù)量范圍為103～108g-1，在上述樣品中，都能檢測到存在大量的大腸桿菌和好氧性細菌，其中大腸桿菌數(shù)量為103～107g-1，好氧性細菌數(shù)量為103～105g-1。部分樣品中存在少量的芽孢桿菌。由表2可以看出，只有F4和F10中檢測到酵母菌和霉菌，且數(shù)量較少，所有樣品中均未檢出梭菌。

5.2 裸鯉腸道乳酸菌代表株生理生化特性分析

對分離自裸鯉腸道樣品的11株乳酸菌進行生理生化特征鑒定，結果顯示它們經過革蘭氏染色后呈現(xiàn)陽性，而在過氧化氫酶試驗中顯示陰性。由表中數(shù)據(jù)可知，只有F7-13和F9-12這兩株乳酸菌發(fā)酵葡萄糖產CO2，屬于異型發(fā)酵型乳酸菌；另外9株乳酸菌發(fā)酵葡萄糖不產CO2，屬于同型發(fā)酵型乳酸菌。上述11株乳酸菌均能在3.0%和6.5%的鹽濃度下良好生長。F2-2，M 1-5，F(xiàn)9-10和F3-29這幾株乳酸菌能在pH值為3.0的酸性環(huán)境中生長，具有較強的耐酸性，只有F2-2和F3-29這兩株乳酸菌能在p H 10.0的環(huán)境中生長良好，具有較強的耐堿性，而其他菌株的生長就比較微弱。由此可見，F(xiàn)2-2和F3-29這兩株乳酸菌具有極強的酸堿耐受性，說明這兩株菌株的pH生長范圍極其廣，具有良好的耐酸耐堿性。

表2 青海湖裸鯉中微生物的分布情況

5.3 裸鯉腸道乳桿菌代表株系統(tǒng)進化樹的構建

對裸鯉腸道樣品中所分離的11株乳桿菌代表菌株進行16S rRNA基因序列分析，用鄰接法(Neighbor-joining)構建系統(tǒng)進化樹如圖1所示。結合乳酸菌菌株16SrRNA基因序列在DDBJ網站上的Blast比對結果和系統(tǒng)進化樹，經鑒定 M 7-13，M 1-8，F(xiàn)2-3，F(xiàn)7-13，F(xiàn)4-15，M 1-6為Lactobacillussake（54.5%）；F16-85為Lactobacillusfuchuensis（9.1%）；F2-2，F(xiàn)9-12，F(xiàn)3-29為Lactobacilluscasei（36.4%）。經研究發(fā)現(xiàn)裸鯉腸道富含多種乳桿菌，Lactobacillussake是裸鯉腸道常見桿菌類，這與崔美巖等人[8]的研究結果一致。除此之外，本研究發(fā)現(xiàn)Lactobacilluscasei也是裸鯉腸道乳桿菌的主要種類。

5.4 抗生素耐藥性分析

根據(jù)表4中數(shù)據(jù)可知，所檢測的8株菌株對 VA，GM，PB，CIP，PG，TE均耐藥。除F16-85菌株對所用10種抗生素均耐藥外，觀察可知，其余7株菌株對氯霉素（CHL）、紅霉素（ERY）敏感或中度敏感。而對于利福平（RA）、氨芐林（AM）兩種抗生素，所測菌株表現(xiàn)出不同的藥敏性，如F4-15和F16-85對這兩種抗生素耐藥，而其他5株菌株對其敏感或中度敏感。

6 結論

結果表明，青海湖裸鯉腸道內含有微生物種類豐富，存在大量的大腸桿菌和好氧性細菌，均未檢出梭菌。除樣品F5，F(xiàn)16，F(xiàn)17以及F20外，其余樣品中都檢測到乳酸菌的存在。通過對其生理生化特性的研究，檢測出F2-2和F3-29這兩株乳酸菌的pH生長范圍極廣，表明其具有良好的耐酸耐堿性。在對其抗生素益生性的分析中，觀察到F16-85耐藥性極好，對所用的抗生素均耐藥，耐藥性最差的為F7-13，只對萬古霉素、慶大霉素、多粘菌素和環(huán)丙沙星這四種抗生素耐藥。

表3 11株代表株的生理生化特性的檢測結果

表4 乳酸菌抗生素耐藥性檢測

圖1 裸鯉腸道樣品中乳酸桿菌系統(tǒng)進化樹