rhGM—CSF與胰島素聯(lián)合應用對糖尿病大鼠燙傷創(chuàng)面TGF—β1和FGF—2表達的影響

張春月 廖毅

[摘要]目的：擬通過檢測分析局部聯(lián)合應用重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（Recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor， rhGM-CSF）和胰島素對糖尿病大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面中轉化生長因子β1（Transforming growth factor-β1， TGF-β1）、堿性成纖維細胞生長因子（Basic fibroblast growth factor-2， FGF-2）以及CD34表達的影響，初步探討局部聯(lián)合應用rhGM-CSF和胰島素促進糖尿病難愈性創(chuàng)面愈合的可能作用機制。方法：雄性SD大鼠制備糖尿病深Ⅱ度燙傷模型，隨機分為糖尿病對照組、胰島素用藥組、rhGM-CSF用藥組以及聯(lián)合用藥組，同時建立正常對照組。分別于傷后1、3、7、11、15、21d計算創(chuàng)面愈合率，觀察創(chuàng)面組織形態(tài)學情況，并檢測創(chuàng)面中TGF-β1、FGF-2以及CD34的表達情況。結果：傷后7、11、15、21d，正常對照組、聯(lián)合用藥組創(chuàng)面愈合率均高于其余各組，糖尿病對照組創(chuàng)面愈合率均低于其余各組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。傷后3～21d，正常對照組、聯(lián)合用藥組TGF-β1、FGF-2表達均顯著高于其余各組，糖尿病對照組最低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。傷后7～21d，正常對照組、聯(lián)合用藥組CD34表達均高于其余各組，各時間點糖尿病對照組最低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論：局部聯(lián)合應用rhGM-CSF和胰島素可通過促進糖尿病大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面血管化、纖維化和上皮化，明顯促進創(chuàng)面愈合，提高創(chuàng)面愈合質量，其機制可能與二者聯(lián)合上調創(chuàng)面中TGF-β1、FGF-2以及CD34的表達有關。

[關鍵詞]糖尿??；燙傷；GM-CSF；胰島素；TGF-β1；FGF-2

[中圖分類號]R587.1 [文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455（2018）06-0045-06

Abstract： Objective To analyze the influence of local application of rhGM-CSF combine with insulin on the expression of TGF-β1， FGF-2 and CD34 in wound healing with Ⅱ degree scald in diabetic rats and explore the possible mechanisms. Methods After Male Sprague-dawley rats were induced diabetic depth Ⅱ scald models， they were randomly divided into the diabetic control group， the insulin group， the rhGM-CSF group and the rhGM-CSF mixed insulin group， while the normal control group were established. The wound area was measured in 1， 3， 7， 14 and 21 days after scald to calculate the rate of wound healing. Morphology of skin tissues of wounds were observed， while the expression of TGF-β1，F(xiàn)GF-2 and CD34 in wound tissues were detected at each time piont. Results Compared to other groups， the normal control group and the rhGM-CSF mixed insulin group had higher rates of wound healing， while the diabetic control group had lower rates of wound healing with significant difference in 7，11，15 and 21 days after scald（P<0.05）. 3-21d after the injury， the expression of TGF-β1 and FGF-2 were significant higher in the normal control group and the rhGM-CSF mixed insulin group than those in other groups， while they were lowest in the diabetic control group （P<0.05）. 7-21d after the injury， the expression of CD34 were higher in the normal control group and the rhGM-CSF mixed insulin group than those in other groups， while they were lowest in the diabetic control group at each time point（P<0.05）. Conclusion Topical application of rhGM-CSF combine with insulin can promote angiogenesis， collagen deposition， epithelialization， and significantly accelerate wound healing with Ⅱ degree deep scald and improve the quality of the wound healing. The mechanism may be associated with upregulation of TGF-β1， FGF-2 and CD34 expression.

Key words： diabetes； scald； GM-CSF； insulin； TGF-β1； FGF-2

我國糖尿病的發(fā)病率逐年升高，糖尿病難愈性創(chuàng)面等慢性并發(fā)癥的致殘率、致死率也不斷上升，嚴重威脅人民的健康。同時，我國每年用于糖尿病及其并發(fā)癥的醫(yī)療費用超過200億[1]，給社會、國家以及患者個人帶來了巨大的經濟負擔。但目前國內外尚缺乏糖尿病創(chuàng)面難愈的明確的發(fā)病機理及有效的治療手段，因此，尋找行之有效的糖尿病創(chuàng)面促愈方法刻不容緩。近年來，胰島素聯(lián)合生長因子治療糖尿病難愈性創(chuàng)面的科學及臨床實驗備受關注，但目前對于局部聯(lián)合應用rhGM-CSF與胰島素對糖尿病大鼠燙傷創(chuàng)面愈合影響的報道尚不多見。馬恬實驗證實[2]，較單獨外用胰島素或rhGM-CSF，二者聯(lián)合使用能更有效地促進壞死組織脫落、調控炎癥反應從而改善創(chuàng)面愈合情況，加速糖尿病足難愈性創(chuàng)面愈合，但尚未就其中具體的作用機制展開研究。本實驗以糖尿病大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面為研究對象，檢測聯(lián)合應用rhGM-CSF和胰島素后創(chuàng)面中TGF-β1、FGF-2以及CD34表達水平的變化，初步探討局部聯(lián)合應用rhGM-CSF和胰島素對糖尿病難愈性創(chuàng)面產生促愈合作用的可能機制，為二者聯(lián)合治療糖尿病難愈創(chuàng)面提供新的理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及主要試劑、儀器：SPF級雄性SD大鼠100只，體重250～350g，由西南醫(yī)科大學實驗動物中心提供。鏈脲佐菌素（streptozotocin STZ，Sigma公司，美國）；胰島素諾和靈30R（40U/ml，諾和諾德公司，丹麥）；外用重組人粒細胞刺激因子凝膠（rhGM-CSF，100μg/10g，長春金賽公司，中國）；快速血糖檢測儀（北京怡成生物電子技術有限公司）；TGF-β1、FGF-2抗體（abcam公司，英國，ab64715、ab8880）；CD34抗體（博士德公司，中國，BA0532）；SP試劑盒；Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件（Media Cybernetics公司，美國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 糖尿病模型制備：造模前檢測大鼠尾靜脈血糖值均<8.9mmol/L，適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為正常對照組（n=15）及糖尿病模型組（n=85），后者禁食不禁水12h，單劑量腹腔快速注射1% STZ（55mg/kg）[3]。72h后檢測尾靜脈血糖，若隨機血糖值>16.7mmol/L，且隨機抽樣的胰腺經病理證實胰島細胞被破壞（見圖1），即可視為I型糖尿病模型誘導成功。不達標者3d后以10～15mg/kg補充腹腔注射STZ。正常對照組腹腔注射相同劑量的檸檬酸緩沖液。

1.2.2 深Ⅱ度燙傷模型制備及分組：糖尿病模型組大鼠血糖穩(wěn)定4周后，各組大鼠以戊巴比妥鈉麻醉，背部脫毛。次日麻醉后用自制燙傷裝置（保持致傷溫度100℃）制備2個直徑約2.5cm的圓形深Ⅱ度燙傷[4]。根據預實驗，正常大鼠燙傷時間為10s，糖尿病大鼠燙傷時間為8s。傷后予以10ml乳酸鈉林格液腹腔注射抗休克，單籠飼養(yǎng)，不限制飲食。85只糖尿病大鼠深Ⅱ度燙傷模型中有69只造模成功，隨機選取其中的60只并分為糖尿病對照組、胰島素用藥組、rhGM-CSF用藥組以及聯(lián)合用藥組。

1.2.3 藥物治療：于傷后第1天開始，每日予以創(chuàng)面換藥1次，直至實驗結束（傷后第21天）。正常對照組、糖尿病對照組以浸有5ml生理鹽水的3層紗布濕敷；胰島素用藥組以浸有5U諾和靈30R+5ml生理鹽水的3層紗布濕敷；rhGM-CSF用藥組浸有25μg rhGM-CSF+5ml生理鹽水的3層紗布濕敷；聯(lián)合用藥組聯(lián)合胰島素用藥組和rhGM-CSF用藥組處理；各組均再用1層油紗外敷。同時，皮下注射諾和靈30R將胰島素用藥組、rhGM-CSF用藥組以及聯(lián)合用藥組的血糖控制至正常對照組水平。

1.3 觀察指標

1.3.1 創(chuàng)面愈合率：分別于燙傷后1、7、11、15、21d，創(chuàng)面未采取任何干預措施前采取圖像，使用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件計算創(chuàng)面愈合率。創(chuàng)面愈合率=初始創(chuàng)面面積-觀察日創(chuàng)面面積/初始創(chuàng)面面積×100%。初始創(chuàng)面面積=лR2 =л（2.5/2）cm2。

1.3.2 組織學觀察：分別于傷后3、7、11、15、21d，各組隨機選取3只大鼠，剪取創(chuàng)面及創(chuàng)周2mm全層皮膚，以4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片。取部分切片行HE染色及Masson染色，光鏡下觀察創(chuàng)面組織的炎癥細胞浸潤，血管、膠原及上皮形成等情況。

1.3.3 TGF-β1、FGF-2以及新生血管指標CD34的表達：每個樣本取6張切片，按試劑盒說明書進行免疫組化SP法染色，光鏡觀察，以胞漿或/和胞核著棕黃色者為陽性染色。高倍鏡下（200×）每張切片任選3個視野，分別計數視野中的TGF-β1、FGF-2以及CD34的陽性細胞數，取3×2個視野計數之和分別作為TGF-β1、FGF-2以及CD34陽性表達的相對含量。

1.4 統(tǒng)計學分析：采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用SNK檢驗法，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般情況：本次成功制備糖尿病大鼠模型，胰島細胞被破壞（見圖1）。造模成功后，5組共75只大鼠均存活至實驗結束，全部進入結果分析。

2.2 創(chuàng)面愈合率：傷后7、11、15、21d，正常對照組、聯(lián)合用藥組創(chuàng)面愈合率均高于其余各組，糖尿病對照組創(chuàng)面愈合率均低于其余各組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

2.3 組織學觀察

2.3.1 HE染色結果：傷后第3天，各組大鼠皮膚表皮及真皮乳頭層破壞，部分真皮網狀層可見殘存的皮膚附件，皮下組織結構紊亂，膠原纖維變性壞死，細胞崩解，伴炎性細胞浸潤；其中聯(lián)合用藥組炎性細胞浸潤最為顯著，糖尿病對照組最少。

第7天，各組炎性細胞浸潤均較前明顯增加，同時可見新生肉芽組織形成；糖尿病對照組可見少量成纖維細胞及內皮細胞；胰島素用藥組、rhGM-CSF用藥組可見較多成纖維細胞，內皮細胞逐漸增多，形成毛細血管；正常對照組、聯(lián)合用藥組新生肉芽組織中可見更多的成纖維細胞以及毛細血管，同時可見部分基底細胞增殖。

第11～15天，除糖尿病對照組炎性細胞浸潤繼續(xù)較前顯著增加外，其余各組炎性細胞浸潤較前均有不同程度的減少。糖尿病對照組成纖維細胞逐漸增加，出現(xiàn)少量新生毛細血管；其余各組成纖維細胞增生更為明顯且逐漸成熟為纖維細胞，伴紅色膠原形成，毛細血管繼續(xù)增加，且部分毛細血管管壁增厚，基底細胞增生形成的皮島逐漸增多融合，形成薄層上皮，以正常對照組、聯(lián)合用藥組為甚，胰島素用藥組、rhGM-CSF用藥組次之（見圖2）。

第21天，糖尿病對照組仍有較多肉芽組織及炎性細胞，被覆不連續(xù)的薄層上皮，其余各組炎性細胞浸潤減少。rhGM-CSF用藥組、胰島素用藥組大部分創(chuàng)面被覆新生復層上皮，但其結構尚不完整；正常對照組、聯(lián)合用藥組創(chuàng)面已基本上皮化，表皮結構較完整。

2.3.2 Masson染色結果：傷后第3天，各組大鼠創(chuàng)面組織中膠原斷裂，纖維纖細、稀疏，排列及其紊亂，尤以糖尿病對照組為甚。第7天，糖尿病對照組膠原纖維仍較纖細、稀疏、紊亂；胰島素用藥組、rhGM-CSF用藥組膠原纖維較前致密，但仍紊亂；正常對照組、聯(lián)合用藥組膠原纖維相對粗大、致密、規(guī)整，但正常對照組不及聯(lián)合用藥組。第11～15天，各組膠原纖維逐漸增多并融合形成粗大的纖維束，排列也逐漸趨于均勻、規(guī)整，尤以聯(lián)合用藥組為甚，正常對照組次之，糖尿病對照組最差（見圖3）。第21天，各組創(chuàng)面真皮及真皮下膠原束較前粗大、致密，同時正常對照組、聯(lián)合用藥組膠原束排列最為規(guī)整，大部分平行于表皮，胰島素用藥組、rhGM-CSF用藥組次之，糖尿病對照組最差。

2.4 免疫組織化學檢測結果：傷后3～21d，正常對照組、聯(lián)合用藥組TGF-β1、FGF-2表達均顯著高于其余各組，糖尿病對照組最低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），各組均于第15天達到峰值。見表2～3，圖4～5。

傷后第3天，正常對照組、胰島素用藥組、rhGM-CSF用藥組、聯(lián)合用藥組CD34表達，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），其余時間點正常對照組、聯(lián)合用藥組CD34表達均高于其余各組，各時間點糖尿病對照組最低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），各組均于第21天達到最高觀察值。見表4，圖6。

3 討論

糖尿病創(chuàng)面難愈并非單因素作用的結果，除了血管病變、神經病變、感染因素外，糖代謝重構的產物所介導的創(chuàng)面修復細胞、細胞外基質、細胞因子的生物學異?？赡苁翘悄虿?chuàng)面難愈的重要因素[5]。在創(chuàng)面愈合這個復雜的調控網絡中，生長因子作為其中的“樞紐”，發(fā)揮著至關重要的作用。

GM-CSF是參與創(chuàng)面愈合過程的一種多功能生長因子，大量研究表明，局部應用GM-CSF可安全、有效地治療多種原因導致的急、慢性創(chuàng)面。研究表明[6-7]GM-CSF基因敲除小鼠創(chuàng)面愈合明顯延遲，而外用GM-CSF能刺激內皮細胞增殖、分化，增加肉芽組織中微血管的密度，并促進其成熟、穩(wěn)定。劉繼松等[8]研究證實，GM-CSF能促進創(chuàng)面早期炎癥細胞浸潤并介導其釋放NE、MMP-1、MMP-9，加速創(chuàng)面溶痂。另有研究提示[9-10]，GM-CSF可通過介導Akt/mTOR通路刺激糖尿病創(chuàng)面中成纖維細胞增殖，膠原纖維沉積以及再上皮化。在創(chuàng)面修復后期，rhGM-CSF可促進毛囊再生，并通過調節(jié)創(chuàng)面TGF-β的表達，促進肉芽組織及新生組織中膠原纖維的可控性沉積，從而提高創(chuàng)面愈合質量[11-13]。

近年研究發(fā)現(xiàn)，除了調節(jié)能量代謝及蛋白質合成之外，胰島素還參與調控創(chuàng)面修復細胞、細胞生長因子及細胞外基質，提示其對創(chuàng)面修復起到積極作用。研究報道[14]，胰島素可加速血管新生，可能與其促進胰島素受體及PI3K/Akt通路介導的內皮細胞遷移及血管管腔形成有關。Apikoglu-Rabus等[15]通過動物實驗發(fā)現(xiàn)，胰島素可通過調節(jié)創(chuàng)面組織中成纖維細胞的生物學活動，促進膠原纖維的合成。另有研究表明[16]，胰島素可通過促進創(chuàng)面細胞因子表達、膠原纖維合成等間接作用，以及對創(chuàng)面修復細胞如炎癥細胞、角質形成細胞的直接作用促進糖尿病創(chuàng)面愈合。此外，局部應用胰島素可逆轉糖尿病創(chuàng)面中胰島素信號傳導的衰減，增加eNOS，VEGF以及SDF-1α等蛋白的表達，從而促進糖尿病創(chuàng)面愈合[17]。

本實驗研究結果表明，糖尿病大鼠創(chuàng)面炎癥細胞浸潤延遲且持續(xù)時間長，血管、膠原形成受阻，新生表皮薄弱且向創(chuàng)面中央爬行緩慢；與正常大鼠比較，其創(chuàng)面愈合時間延長，創(chuàng)面愈合率降低。而創(chuàng)面局部單獨應用rhGM-CSF或者胰島素后，創(chuàng)面組織中成纖維細胞及新生血管增多，新生膠原密度增加、分布均勻且排列規(guī)整，上皮爬行速度加快且新生表皮增厚，且二者聯(lián)合使用后效果更為顯著。相關研究表明[9]，在糖尿病大鼠創(chuàng)面局部使用rhGM-CSF能加速創(chuàng)面閉合，促進新血管生成，誘導膠原合成，提高生長因子FGF-2，TGF-β以及VEGF的水平從而促進糖尿病創(chuàng)面愈合。通過本實驗可以觀察到，自傷后第3天開始，各組TGF-β1、FGF-2及CD34表達均有升高，與糖尿病對照組相比，傷后各時間點胰島素用藥組及rhGM-CSF用藥組TGF-β1、FGF-2及CD34表達均增加，而兩者聯(lián)合使用后創(chuàng)面中TGF-β1、FGF-2及CD34表達增加更為顯著，創(chuàng)面愈合率亦明顯升高。表明rhGM-CSF和胰島素糖尿病合并燙傷創(chuàng)面愈合中，起到了協(xié)同促進的作用。

TGF-β1也是目前創(chuàng)面愈合必不可少的生長因子之一，其作用貫穿創(chuàng)面愈合的始終。首先，TGF-β1對巨噬細胞有趨化、活化作用，并促進其合成分泌與創(chuàng)面愈合相關的炎性介質[18]；其次，TGF-β1作用于成纖維細胞，一方面刺激其遷移、增殖，促進膠原的合成；另一方面誘導其向肌成纖維細胞轉化，促進膠原沉積及創(chuàng)面收縮[19]。再次，TGF-β1可誘導新生血管以及肉芽組織形成[20]。此外，TGF-β1可刺激上皮細胞增殖并促進其向創(chuàng)面床遷移，加速再上皮化進程[21]。

FGF-2已被證實參與創(chuàng)面愈合過程，局部FGF-2的下調及活性降低與糖尿病創(chuàng)面難愈有關[22]。FGF-2促進創(chuàng)面愈合可能通過了多種環(huán)節(jié)，包括活化創(chuàng)面修復細胞并促進其分裂、增殖、趨化[22]；改善細胞外基質的合成；促進血管新生，加速再上皮化[19]。有文獻報道，F(xiàn)GF-2還可作用于MMP-1，通過上調其表達調節(jié)創(chuàng)面中膠原蛋白含量，有效抑制瘢痕組織形成[23]。

本次實驗研究結果顯示，糖尿病燙傷創(chuàng)面愈合中，聯(lián)合應用rhGM-CSF和胰島素可發(fā)揮各自的優(yōu)勢，協(xié)同強化生物效應，共同促進創(chuàng)面愈合。胰島素降低糖尿病創(chuàng)面中組織細胞的血糖水平，改善創(chuàng)面局部的微環(huán)境，抑制糖尿病皮膚的生物學異常，同時rhGM-CSF和胰島素均可上調創(chuàng)面中TGF-β1、FGF-2及CD34的表達，調控創(chuàng)面炎癥反應，促進新生血管形成、膠原合成及沉積、再上皮化進程從而加速創(chuàng)面愈合并提高創(chuàng)面愈合質量。本實驗為rhGM-CSF和胰島素在糖尿病難愈性創(chuàng)面的應用提供了新的實驗依據。糖基化終末產物（Advancede glycation endproducts，AGEs）是長期高糖環(huán)境下發(fā)生非酶促糖基化反應的直接產物，可直接或間接作用于組織細胞，引發(fā)組織細胞的代謝異常，是糖尿病皮膚發(fā)生“隱形損害”的“始作俑者”之一。有文獻報道[5，24]，糖尿病大鼠皮膚在高糖的長期作用下，AGEs也可作用于FGF-2、表皮生長因子受體（EGFR），阻斷其介導的信號轉導，抑制創(chuàng)面愈合。但參與創(chuàng)面愈合的其他細胞生長因子，如GM-CSF、TGF-β及其受體是否也發(fā)生糖基化改變以及胰島素、rhGM-CSF可否抑制FGF-2、TGF-β及其受體的糖基化反應而促進糖尿病創(chuàng)面愈合，有待進一步研究。

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[收稿日期]2018-05-09 [修回日期]2018-06-02

編輯/朱婉蓉