南極磷蝦油中磷脂檢測方法的比較

蘇婷，周德慶，朱蘭蘭，*，王珊珊

（1．中國海洋大學(xué)，山東青島266100；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東青島266071）

南極磷蝦廣泛分布于南極洲水域，隸屬于無脊椎動物，節(jié)肢動物門、甲殼綱、軟甲亞綱、磷蝦目，磷蝦科，磷蝦屬[1]，是目前世界上已知的資源儲存量最大的生物之一，生物量可達(dá)6.5×108t～10×108t[2-3]。南極磷蝦富含蛋白質(zhì)、功能脂質(zhì)及多種營養(yǎng)活性物質(zhì)。南極磷蝦肉中蛋白質(zhì)含量高于16%，而干磷蝦高達(dá)65%；磷脂是南極磷蝦重要的營養(yǎng)物質(zhì)，主要包含磷脂、膽固醇、甘油酯等[4-5]，不飽和脂肪酸約占總脂肪酸的60%，二十碳五烯酸（eicosapntemacnioc acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosahexenoic acid，DHA）約占 28.9%[6]。南極磷蝦中也含有豐富的維生素以及礦物質(zhì)，如維生素D、維生素A、磷、鈣、鐵、硒、碘、鎂等，均為人體所需的維生素及礦物質(zhì)營養(yǎng)成分[7-8]。

南極磷蝦資源開發(fā)作為戰(zhàn)略新興產(chǎn)業(yè)，廣受各國關(guān)注。我國南極磷蝦產(chǎn)業(yè)起步較晚，研發(fā)的高附加值產(chǎn)品主要為南極磷蝦油。與傳統(tǒng)魚油相比，南極磷蝦油的磷脂、脂肪酸及蝦青素等功能脂質(zhì)，更易為人體吸收，具有更強(qiáng)的生理活性，在降血脂預(yù)防心血管疾病[9-11]、提高記憶力[12-13]、降血糖預(yù)防糖尿病[12]、消除炎癥[14-15]、抗氧化[15-16]、防止肝脂肪變性[17]等方面表現(xiàn)出眾，因而備受消費(fèi)者青睞。區(qū)別于甘油三酯型魚油，南極磷蝦油磷脂與不飽和脂肪酸和蝦青素結(jié)合在一起，致使常規(guī)的磷脂檢測方法不適用于南極磷蝦油磷脂檢測。基于此，比較磷脂的3種檢測方法，在綜合樣品前處理繁簡程度、定量分析準(zhǔn)確性等因素的基礎(chǔ)上，確定南極磷蝦油中磷脂的適宜檢測分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南極磷蝦油樣品：中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所食品質(zhì)量安全實(shí)驗(yàn)室制備；磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）、溶血磷脂酰膽堿（lysophosphatidyl choline，LPC）、磷脂酰乙醇胺 （phosphatidylethanolamine，PE）標(biāo)準(zhǔn)品：Sigma 公司；磷酸三甲酯、氘代氯仿、鹽酸、氧化鋅、氫氧化鉀、濃硫酸、鉬酸鈉、硫酸聯(lián)氨、磷酸二氫鉀、氯仿、甲醇、碘（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)儀器

Bruker AV 500核磁共振波譜儀：德國布魯克公司；GL224分析天平：德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；10*10薄層層析硅膠板：煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司；UV1102Ⅱ紫外/可見分光光度計：上海天美科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 核磁共振法定性定量檢測磷脂

稱取磷酸三甲酯30.5 mg加入4 mL氘代氯仿配成內(nèi)標(biāo)儲備溶液待用。取0.025 g左右蝦油加入900 μL氘代氯仿復(fù)溶，加入內(nèi)標(biāo)儲備溶液100 μL，振蕩/超聲，針管吸出過0.22 μm的濾膜，轉(zhuǎn)移至5 mm的核磁管。通過對比樣品與標(biāo)準(zhǔn)品相對于內(nèi)標(biāo)物的化學(xué)位移，對樣品磷脂進(jìn)行定性分析。

檢測條件：測定溫度25℃，譜寬40 000 Hz，檢測頻率 202.416 MHz，脈沖寬度 12.5 μs，采集時間 0.4 s，延遲時間3.5 s。

磷脂含量的計算：核磁共振譜分析中，磷原子數(shù)與其對應(yīng)峰面積成正比，而每個樣品磷脂分子中僅含有一個磷原子，內(nèi)標(biāo)物中也僅有一個磷原子，因此通過對內(nèi)標(biāo)物和樣品中各個峰進(jìn)行積分，比較內(nèi)標(biāo)峰與樣品峰的峰面積，計算含量。代入公式（1）、（2）計算即可得到：

式中：ma為組分a的質(zhì)量，mg；Sa為組分a的峰面積；S內(nèi)標(biāo)為內(nèi)標(biāo)物的峰面積；n內(nèi)標(biāo)為內(nèi)標(biāo)物的摩爾量，mol；M內(nèi)標(biāo)為組分 A 的摩爾質(zhì)量，mg/mol。

組分a的含量：

式中：Xa為組分a的含量，mg/g；ma為組分a的質(zhì)量，mg；m蝦油為蝦油的質(zhì)量，g。

1.3.2 鉬藍(lán)比色法檢測磷脂總量

樣品前處理：稱取2.0 g～3.0 g南極磷蝦油于坩堝中，加入0.5 g ZnO，碳化后馬弗爐560℃加熱至樣品完全灰化變成白色，冷卻至室溫，加入10 mL體積比1∶1的鹽酸反應(yīng)，依次加入50%的氫氧化鉀溶液、體積比1∶1的鹽酸至溶液澄清。用水稀釋定容至刻度，搖勻。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取6支比色管，分別加入0.01mg/mL的磷酸二氫鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入0.015%的硫酸聯(lián)氨溶液，2.5%鉬酸鈉稀硫酸溶液，沸水浴中加熱10 min，冷卻至室溫，用水定容。在650 nm下測吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，含磷量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品測定：取待測溶液10 mL于50 mL比色管中，依照標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制中的樣品處理方式處理，用空白調(diào)零，在650 nm下測吸光度。

1.3.3 薄層層析法定性半定量磷脂

定性分析：分別取5.0 mg左右磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、溶血磷脂酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)品（LPC）溶于氯仿制成標(biāo)準(zhǔn)溶液，混合制成混標(biāo)。硅膠板毛細(xì)管點(diǎn)樣后，放入層析缸中展開，展開劑為氯仿：甲醇：水體積比60∶30∶10，之后碘缸中顯色半小時，比較樣品與標(biāo)準(zhǔn)品斑點(diǎn)的位置。

定量分析：將顯色后的硅膠板放在光線均勻分布的拍照箱里，對其進(jìn)行拍照，利用Gelpro32軟件對照片中樣品條帶的灰度值進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 核磁共振定性定量分析南極磷蝦油磷脂組成

核磁共振定性定量分析南極磷蝦油磷脂組成見圖 1、圖 2。

采用內(nèi)標(biāo)法，將樣品31P NMR譜圖峰面積與已知含量的參比峰峰面積積分，計算磷脂含量，結(jié)果如表1所示。

樣品1～4的磷脂組成及總磷脂含量差異顯著。樣品 3磷脂總含量最低，僅有（90.52±0.28）mg/g；樣品 2磷脂總含量最高，達(dá)（382.73±0.68）mg/g。4個樣品的磷脂組成組成規(guī)律一致，含量排序均為PC＞LPC＞PE，但樣品中各磷脂成分的含量差異顯著，PC含量范圍在（76.26±0.23）mg/g～（302.28±0.47）mg/g，PE 含量范圍在（6.03±0.09）mg/g～（40.78±0.18）mg/g，LPC 含量范圍在（8.22±0.10）mg/g～（87.36±0.26）mg/g。

圖1 各磷脂標(biāo)準(zhǔn)品31P NMR譜圖Fig.1 31P NMR spectra of standards

圖2 樣品的磷脂組成31P NMR分析Fig.2 Analysis of phospholipids in sample with31P NMR spectra

表1 核磁共振測南極磷蝦油樣品磷脂含量Table 1 The phospholipids composition of four samples by31P NMR

2.2 鉬藍(lán)比色法測定南極磷蝦油磷脂總量

用鉬藍(lán)比色法對4個樣品進(jìn)行磷脂總量的檢測，結(jié)果見表2。

表2 鉬藍(lán)比色法測南極磷蝦油樣品總磷脂含量表Table 2 The total phospholipid content of sample by molybdenum blue colorimetry

不同樣品間的總磷脂含量差異顯著。樣品2含量最高，為（470.53±1.3）mg/g；樣品3含量最低，為（189.47±0.8）mg/g。該方法僅能測出南極磷蝦油的總磷脂含量，并不能對磷脂的組成進(jìn)行分析。

2.3 薄層層析定性半定量分析南極磷蝦油磷脂組成

2.3.1 薄層層析定性分析南極磷蝦油磷脂組成

將3個磷脂標(biāo)準(zhǔn)品及混合標(biāo)準(zhǔn)品點(diǎn)樣展開后經(jīng)碘缸顯色得到圖3，將4個樣品及混合標(biāo)準(zhǔn)品點(diǎn)樣展開后經(jīng)碘缸顯色得到圖4。

圖3 PC、PE、LPC、混標(biāo)的薄層色譜圖Fig.3 TLC chromatogram of phospholipid standards

圖4 樣品及標(biāo)準(zhǔn)品的薄層色譜圖Fig.4 TLC chromatogram of samples and phospholipid standards

兩圖對比結(jié)果顯示：4個樣品中均含有PC（磷脂酰膽堿）、PE（磷脂酰乙醇胺）、LPC（溶血磷脂酰膽堿）。圖4中PE的斑塊中間相較于兩邊有些偏下，分析可能是層析缸中的展開劑未完全飽和，蒸汽分布不均勻，導(dǎo)致產(chǎn)生了邊緣效應(yīng)。

2.3.2 薄層層析結(jié)合Gelpro32半定量分析磷脂組成含量

對4個樣品中磷蝦油的組成進(jìn)行多次薄層層析分析，借助Gelpro32軟件分析薄層層析圖中各樣品條帶的斑點(diǎn)，得到PC（磷脂酰膽堿）、PE（磷脂酰乙醇胺）、LPC（溶血磷脂酰膽堿）的相對含量，結(jié)果見表3。

表3 薄層色譜-Gelpro32分析南極磷蝦油樣品中各磷脂組分含量百分比Table 3 Percentage of 3 kinds of phospholipid content of 4 samples by TLC-Gelpro32

由表3可知，各樣品中磷脂各組分含量排序均為PC＞LPC＞PE，但各組分含量差異顯著。這與核磁共振檢測的結(jié)果一致。

2.4 3種方法分析南極磷蝦磷脂的結(jié)果比較

對核磁共振法和鉬藍(lán)比色法測定磷脂含量的結(jié)果進(jìn)行了比較分析，結(jié)果如表4所示。

表4 31P NMR和鉬藍(lán)比色法分析南極磷蝦油樣品結(jié)果Table 4 The phospholipid composition of Antarctic krill oil analyzed by31P NMR and molybdenum blue colorimetric methods

2種檢測方法測得的總磷脂含量差異顯著。鉬藍(lán)比色法檢測的4個樣品總磷脂含量均高于31P NMR的檢測結(jié)果，分析是該方法基于磷元素與磷脂的當(dāng)量關(guān)系，根據(jù)磷元素含量確定磷脂含量，致使測定結(jié)果偏高。根據(jù)各磷脂占磷脂含量總和的百分比，對31P NMR法和TLC法測定的磷脂各組分含量進(jìn)行對比，結(jié)果見表5。

表5 31P NMR和TLC法分析南極磷蝦油樣品結(jié)果Table 5 The phospholipid composition of Antarctic krill oil analyzed by31P NMR and TLC

31P NMR法和TLC法均分析出4個樣品由3種磷脂組成，且各磷脂組分含量的趨勢一致，均為磷脂酰膽堿含量＞溶血磷脂酰膽堿＞磷脂酰乙醇胺，但2種方法檢測磷脂各組分含量的差異顯著。TLC檢測結(jié)果整體比31P NMR法低，分析是檢測受碘顯色的影響，且定量過程受軟件對斑點(diǎn)的識別影響，進(jìn)而影響了定量準(zhǔn)確性。

3 結(jié)論

采用3種檢測方法對南極磷蝦油磷脂的組成及含量進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：鉬藍(lán)比色法僅能測定樣品中總磷脂含量，無法進(jìn)行磷脂組成分析；薄層色譜法可以分析磷脂組成，但僅能實(shí)現(xiàn)磷脂含量半定量；核磁共振法可以實(shí)現(xiàn)磷脂的準(zhǔn)確定量及磷脂的組成分析。核磁共振與薄層色譜法分析南極磷蝦油磷脂組成結(jié)果一致，磷蝦油中磷脂主要由PC（磷脂酰膽堿）、PE（磷脂酰乙醇胺）和LPC（溶血磷脂酰膽堿）組成。綜合樣品前處理繁簡程度、定量分析準(zhǔn)確性等因素，確定核磁共振法作為南極磷蝦油中磷脂的含量及組成的檢測分析方法。