應用Rusitec-S系統(tǒng)研究甘露寡糖對綿羊體外瘤胃發(fā)酵的影響

張 然，鄭 琛，韓海珠，雒瑞瑞，李彥珍，朱 偉

(甘肅農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，甘肅 蘭州 730070)

甘露寡糖(mannan oligosaccharides，MOS)作為功能性寡糖的一種，廣泛存在于魔芋粉、瓜兒豆膠、田菁膠及多種微生物細胞壁內(nèi)，有低熱、穩(wěn)定、用量少、無殘留、安全無毒等理化性質(zhì)，被稱為“化學益生素”，是最有希望的抗生素替代品之一。有研究表明，飼糧中添加甘露寡糖能在改善動物腸道微生態(tài)環(huán)境的同時提高免疫力[1-2]和生產(chǎn)性能[3-4]，因此，深入研究甘露寡糖在動物生產(chǎn)中的應用具有重要意義。國內(nèi)外對甘露寡糖的研究不論是基礎(chǔ)理論還是生產(chǎn)實踐應用方面，多限于仔豬、家禽等單胃動物，也多集中在消化道后腸段，對反芻動物瘤胃發(fā)酵特性和飼料瘤胃降解率的研究較少[5]。反芻動物的瘤胃可看作是一個厭氧性微生物接種和繁殖的活體發(fā)酵罐[6]，在大量體外模擬瘤胃發(fā)酵的裝置中，可實現(xiàn)連續(xù)培養(yǎng)的Rusitec-S型人工瘤胃模擬裝置更接近活體內(nèi)瘤胃發(fā)酵的真正情況[7]。本研究采用Rusitec-S型人工瘤胃模擬裝置來研究飼糧中添加不同水平的甘露寡糖對綿羊瘤胃發(fā)酵特性的影響，以期為甘露寡糖在綿羊養(yǎng)殖中的應用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

甘露寡糖購自北京奧特奇生物制品(中國)有限公司，從釀酒酵母細胞中提取，有效成分含量大于90%。

1.2 試驗動物與飼養(yǎng)管理

提供瘤胃液的動物為5只裝有永久瘤胃瘺管的健康雜種羯羊(白薩?？恕帷列∥埠颉?，體重為(30.00±2.15) kg，參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準肉羊飼養(yǎng)標準(NY/T816-2004)中育成公羊營養(yǎng)需要量(體重30 kg，日增重200 g)，配制甘露寡糖含量較低的飼糧，飼糧精粗比為40∶60，其組成及營養(yǎng)水平如表1所列。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet

預混料為每千克飼糧提供Fe 38 mg，Zn 44 mg，Cu 15 mg，I 0.5 mg，Mn 50 mg，Se 0.3 mg，Co 0.05 mg，VA 354 IU，VD 94.4 IU，VE 1.06 mg；消化能為計算值，其余為實測值，均以干物質(zhì)為基礎(chǔ)計算。

The premix provided the following per kg of the diet: Fe 38 mg, Zn 44 mg, Cu 15 mg, I 0.5 mg, Mn 50 mg, Se 0.3 mg, Co 0.05 mg, VA 354 IU, VD 94.4 IU, VE 1.06 mg; DE was a calculated value, while the others were measured values, and calculated based on dry matter.

1.3 試驗設(shè)計

采用單因素完全隨機試驗設(shè)計，甘露寡糖的添加水平分別為0、0.8%、1.6%和2.4%，Rusitec-S 系統(tǒng)的8個發(fā)酵罐分為4個處理組，每個添加量兩個發(fā)酵罐，連續(xù)進行兩期試驗，即每個處理組有4個重復。每期試驗的試驗期為9 d，前7 d為人工瘤胃系統(tǒng)穩(wěn)定期，最后2 d為采樣期。

1.4 人工瘤胃培養(yǎng)流程

1.4.1人工瘤胃緩沖液的配制 人工瘤胃緩沖液的配制參照McDougall[8]的配方。

1.4.2人工瘤胃裝置 人工瘤胃(Rusitec-S)購自Sanshin工業(yè)有限公司(東京，日本)，試驗條件：緩沖液流量為0.39 mL·min-1，流出液口篩網(wǎng)孔徑為1.2 mm，攪拌機攪拌頻率為4～5 次·min-1，發(fā)酵罐內(nèi)溫度為39 ℃，通入CO2至厭氧環(huán)境[9]。

1.4.3人工瘤胃操作方法 晨飼前從5只雜種羯羊瘤胃內(nèi)的不同部位采集足量瘤胃食糜和瘤胃液，經(jīng)4層紗布分離固體和液體部分。瘤胃液灌入已經(jīng)預熱并通有CO2的保溫瓶中，灌滿后立即蓋嚴瓶口，迅速轉(zhuǎn)移到實驗室并且分裝到已安裝好水槽(溫度設(shè)定在39 ℃)的8個發(fā)酵罐中，每個發(fā)酵罐中裝入400 mL瘤胃液和等體積的緩沖液。然后稱取70 g(濕重)固體食糜裝進尼龍袋(規(guī)格7 cm×13 cm、孔徑38 μm)。在每個發(fā)酵罐中放入兩個尼龍袋(一個裝有試驗飼糧，另一個裝有固體食糜)。24 h后，從發(fā)酵罐中移出裝固體食糜的尼龍袋，同時放入一個新的裝有飼糧的尼龍袋。此后每天移出一個已培養(yǎng)48 h的尼龍袋,同時放入一個新的裝有飼糧的尼龍袋，所有操作在30 min內(nèi)完成。

1.4.4樣品采集 采樣期第1天用集氣袋收集培養(yǎng)24 h的氣體；采樣期第2天，于換料后收集各個發(fā)酵罐中的尼龍袋，立即在自來水下沖洗，然后放入水中浸泡45 min，再在中等流速的自來水下漂洗后將尼龍袋65 ℃烘干，殘渣用于測定干物質(zhì)、有機物、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維和粗蛋白質(zhì)含量。同時于換料后0、3、6、9和12 h收集20 mL發(fā)酵液，按瘤胃液容積的1/100加入飽和HgCl2溶液，立即測定pH，然后置于-20 ℃冷凍保存，用于測定總氮、氨氮、尿素氮和揮發(fā)性脂肪酸含量。

1.5 測定指標及方法

pH用酸度計(PHS-3C，上海雷磁儀器廠)測定，產(chǎn)氣量用氣體流量計(DC-1，Shinagawa，日本)測定，甲烷和揮發(fā)性脂肪酸含量用氣相色譜儀(6890N，Agilent，美國)測定，瘤胃液總氮用凱氏定氮法測定[10]，瘤胃液氨氮用比色法[11]測定，瘤胃液尿素氮用二乙酰-肟法測定，試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

瘤胃液蛋白氮(mg·dL-1)計算公式：

瘤胃液蛋白氮=瘤胃液總氮-瘤胃液氨氮-瘤胃液尿素氮。

飼糧及食糜中干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量分別按照楊勝[10]和van Soest等[12]的方法測定。按下式計算各養(yǎng)分的瘤胃降解率(%)：

瘤胃降解率=[(原尼龍袋內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)含量-48 h降解后尼龍袋內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)含量)/原尼龍袋內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)含量]×100%。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel軟件進行初步統(tǒng)計處理，并采用SPSS 19.0軟件包對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，差異顯著時，采用Tukey法(方差齊) 或Tamhane法(方差不齊)進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外產(chǎn)氣量和甲烷產(chǎn)量

甘露寡糖對總產(chǎn)氣量和甲烷產(chǎn)量均未產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)，但隨著甘露寡糖添加水平的提高，甲烷產(chǎn)量略有降低。

表2 體外產(chǎn)氣量和甲烷產(chǎn)量Table 2 Gas and methane production in rumen fermentation in vitro

2.2 體外養(yǎng)分降解率

飼糧中添加甘露寡糖對各養(yǎng)分的體外降解率均未產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)，也未表現(xiàn)出規(guī)律性的變化。

2.3 體外發(fā)酵液氮濃度

甘露寡糖添加水平對總氮、氨氮、尿素氮和蛋白氮濃度均未產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)(表4)。

2.4 體外發(fā)酵液pH和揮發(fā)性脂肪酸濃度

甘露寡糖添加水平對pH、總揮發(fā)性脂肪酸濃度、乙酸/丙酸、乙酸、丙酸、丁酸和其他酸比例均未產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)(表5)。

表3 體外養(yǎng)分降解率Table 3 Nutrients degradation rate in rumen fermentation in vitro

表4 體外發(fā)酵液氮濃度Table 4 Nitrogen concentration in rumen fermentation in vitro

3 討論

3.1 飼糧中添加甘露寡糖對體外產(chǎn)氣量和甲烷產(chǎn)量的影響

產(chǎn)氣量是反映飼料可發(fā)酵程度及瘤胃微生物活性的重要指標。有研究表明，飼料中可發(fā)酵的有機物含量越多，瘤胃微生物的活性越強，產(chǎn)氣量就越大，反之，則產(chǎn)氣量減少[13]。氫氣還原二氧化碳是形成甲烷的主要途徑，其次乙酸、甲酸和丁酸等揮發(fā)性脂肪酸也能合成甲烷[14]。曾燕霞[15]在研究不同精粗比日糧中添加甘露寡糖對綿羊體外發(fā)酵影響時發(fā)現(xiàn)，甘露寡糖的添加水平對體外產(chǎn)氣量和甲烷產(chǎn)量均未產(chǎn)生顯著影響；本研究結(jié)果與其一致，添加甘露寡糖組的總產(chǎn)氣量高于未添加甘露寡糖組，添加甘露寡糖組的甲烷產(chǎn)量低于未添加甘露寡糖組，但均未產(chǎn)生顯著差異。這可能是由于甘露寡糖添加水平較低(最高2.4%)導致瘤胃微生物利用甘露寡糖發(fā)酵的作用不明顯，也可能是因為體外發(fā)酵裝置、寡糖種類及添加量、瘤胃液來源或飼糧組成等不同造成試驗結(jié)果差異，具體原因還需要進一步研究。

3.2 飼糧中添加甘露寡糖對體外養(yǎng)分降解率的影響

本研究中，各處理組間干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維降解率均差異不顯著，與張愛忠[16]和Mwenya等[17]的研究結(jié)果類似。這可能是由于營養(yǎng)物質(zhì)的消化率主要由營養(yǎng)物質(zhì)的理化性質(zhì)決定，益生元并不能改變?nèi)占Z營養(yǎng)物質(zhì)的消化率，只能改變細菌的數(shù)量從而影響纖維的降解率[18]，如靳露[19]研究表明，在基礎(chǔ)日糧中添加2%的甘露寡糖，對肉牛日糧干物質(zhì)、有機物、粗蛋白、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維的養(yǎng)分表觀消化率無顯著影響。有相關(guān)研究認為[20-22]，外源添加功能性寡糖可以提高纖維素分解菌的活性和數(shù)量，改善綿羊瘤胃微生物區(qū)系，加速飼料中碳水化合物，尤其是纖維類物質(zhì)的降解，提高干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維的降解率。例如林英庭等[20]、劉兵等[23]發(fā)現(xiàn)，添加寡糖可提高綿羊常用粗飼料干物質(zhì)、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維瘤胃降解率，這可能是由于不同功能性寡糖對綿羊體外養(yǎng)分降解率的影響效果不同。

表5 體外發(fā)酵液pH和揮發(fā)性脂肪酸濃度Table 5 The pH and volatile fatty acid concentrate in rumen fermentation in vitro

3.3 飼糧中添加甘露寡糖對體外發(fā)酵液氮濃度的影響

瘤胃液總氮主要包括飼糧粗蛋白質(zhì)降解和再循環(huán)進入的氨氮、尿素氮和蛋白氮等。飼糧蛋白質(zhì)經(jīng)瘤胃細菌和蛋白酶的協(xié)同降解被消化利用，任何細菌或酶活性的改變都會影響飼糧蛋白質(zhì)的降解。有研究表明，飼糧中添加甘露寡糖可促進雙歧桿菌和乳酸桿菌等有益菌群的增殖，抑制大腸桿菌和沙門氏菌等有害菌的生長，改善動物胃腸道微生態(tài)環(huán)境[2,24]。本研究中，甘露寡糖對體外發(fā)酵液總氮、氨氮、尿素氮和蛋白氮濃度均沒有顯著影響。推測原因可能是，甘露寡糖的添加量不足以促進瘤胃內(nèi)有益菌的增殖，進而影響瘤胃微生物對甘露寡糖的利用情況；也可能是因為甘露寡糖在反芻動物瘤胃內(nèi)被瘤胃微生物降解，而這種降解作用可能導致添加外源寡糖對反芻動物效果甚微。Owens等[25]指出，飼糧中蛋白質(zhì)來源的差異、碳水化合物底物的變化以及粗飼料的加工方式都會影響瘤胃微生物的合成與代謝。

3.4 飼糧中添加甘露寡糖對體外發(fā)酵液pH和揮發(fā)性脂肪酸濃度的影響

pH是評價瘤胃代謝的重要指標，主要受日糧性質(zhì)、唾液分泌量和有機酸積累的影響，它決定著瘤胃微生物對底物的發(fā)酵利用情況[26]。瘤胃內(nèi)pH的變動范圍在5.5～7.5[27]。本研究中，各處理組不同時間點培養(yǎng)液的pH在7.01～7.17，在有利于微生物發(fā)酵的范圍內(nèi)，是因為Rusitec-S型人工瘤胃發(fā)酵罐中瘤胃液和緩沖液的比例為1∶1，且緩沖液按一定流速不斷流入發(fā)酵罐及終產(chǎn)物不斷排出造成的。肖宇等[28]報道，功能性寡糖都有降低奶山羊瘤胃pH的作用，半乳甘露寡糖與甘露寡糖的效果尤為明顯。劉光斌等[29]在采用體外批次培養(yǎng)法研究大豆寡糖對生長綿羊瘤胃發(fā)酵特性的試驗中也表明，飼糧中添1.2%、1.6%和2.0%的大豆寡糖可以顯著降低瘤胃pH。本研究同一時間各處理組間pH差異均不顯著，這可能是甘露寡糖對瘤胃微生物的調(diào)控作用相對緩慢從而避免了pH出現(xiàn)較大波動[5]。

揮發(fā)性脂肪酸的濃度和比例能夠反映瘤胃營養(yǎng)攝入情況[30]。本研究中，甘露寡糖對總揮發(fā)性脂肪酸濃度、乙酸/丙酸、乙酸、丙酸、丁酸和其他酸的比例均沒有產(chǎn)生顯著的影響。這可能是因為甘露寡糖添加水平較低，不能顯著影響到每種脂肪酸的含量，或是添加甘露寡糖后產(chǎn)生的能量不足以為纖維分解菌提供能量，從而影響纖維分解菌的活性和數(shù)量。本研究與鄭琛等[5]的研究結(jié)果類似?；铙w研究表明，外源添加甘露寡糖除對食前試羊瘤胃液丁酸百分比產(chǎn)生極顯著的影響外，對試羊瘤胃液總揮發(fā)性脂肪酸濃度、乙酸、丙酸、丁酸和其他酸百分比及乙酸/丙酸均沒有產(chǎn)生顯著影響[5]。但凌寶明等[31]利用營養(yǎng)灌注技術(shù)研究了果寡糖對生長綿羊瘤胃發(fā)酵功能的影響，顯示出灌注果寡糖可提高培養(yǎng)液中的揮發(fā)性脂肪酸含量，認為可能是添加果寡糖后增加了產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸的來源，或是果寡糖作為益生元促進了瘤胃內(nèi)雙歧桿菌及其他某些細菌的增殖，增強了瘤胃細菌對可發(fā)酵碳源的降解能力。

4 結(jié)論

本研究中，在Rusitec-S人工瘤胃培養(yǎng)條件下，添加甘露寡糖對體外培養(yǎng)液pH、總揮發(fā)性脂肪酸、總氮、氨態(tài)氮、尿素氮和蛋白氮濃度以及乙酸/丙酸與乙酸、丙酸、丁酸、其他酸比例、養(yǎng)分降解率及甲烷產(chǎn)量和總產(chǎn)氣量均沒有顯著影響，表明甘露寡糖對體外瘤胃發(fā)酵影響不大。