添加劑對(duì)溫濕生境青貯玉米發(fā)酵品質(zhì)及有氧穩(wěn)定性的影響

袁仕改， 陳 超， 張明均， 楊 豐， 申露露， 張?zhí)咸希?郝 俊*

(1. 貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院， 貴州 貴陽(yáng) 550025； 2. 貴州省草地技術(shù)試驗(yàn)推廣站， 貴州 貴陽(yáng) 550025)

青貯飼料因其保存時(shí)間長(zhǎng)、原料來源廣、內(nèi)貯量大、適口性好等優(yōu)點(diǎn)一直備受關(guān)注，尤其是利用添加劑改善青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)更是研究的熱點(diǎn)。玉米(ZeamaysL.)種植面積大，且籽實(shí)和秸稈產(chǎn)量高，是目前進(jìn)行青貯的主要原料。生產(chǎn)中如果沒有嚴(yán)格控制青貯飼料在發(fā)酵貯藏過程中所需的厭氧環(huán)境以及在取用過程中未能妥善管理，容易發(fā)生二次發(fā)酵，導(dǎo)致青貯飼料營(yíng)養(yǎng)水平大幅降低，青貯飼料發(fā)霉變質(zhì)，從而降低動(dòng)物生產(chǎn)性能和經(jīng)濟(jì)效益。因此，如何有效地控制二次發(fā)酵對(duì)于保證青貯飼料的品質(zhì)十分重要。使用添加劑可以改善青貯品質(zhì)，提高飼料的適口性和有氧穩(wěn)定性[1]。如劉禎等[2]在全株玉米青貯過程中添加劑乳酸菌，使二次發(fā)酵時(shí)間推遲了2 d左右；辛鵬程等[3]等認(rèn)為，在青稞(HordeumvulgareL.var.nudumHook. f.)秸稈和多年生黑麥草(LoliumperenneL.)混合青貯中添加丙酸，添加0.4%以上的丙酸能夠改善混合青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)和有氧穩(wěn)定性。

然而，之前研究大多僅考慮添加劑對(duì)青貯品質(zhì)和有氧穩(wěn)定性的影響，卻忽略了環(huán)境條件的重要性。溫度和降雨是影響微生物總量和各類群微生物的關(guān)鍵氣候因子[4]，環(huán)境溫度和濕度的提高會(huì)促進(jìn)有害微生物的生長(zhǎng)和繁殖，如霉菌、梭狀芽胞桿菌和腸桿菌[5-7]。貴州屬于亞熱帶季風(fēng)濕潤(rùn)氣候，日照少，陰雨多，濕度大，夏季(6—8月)各月平均氣溫多在20～25℃，平均相對(duì)濕度在80%左右，最大的達(dá)85%[8]。青貯料暴露于這種溫暖潮濕的環(huán)境中更容易遭到破壞，進(jìn)而加劇青貯飼料的二次發(fā)酵進(jìn)程，而

在我國(guó)高寒地區(qū)高海拔、低溫和缺氧的極端環(huán)境中幾乎無二次發(fā)酵的現(xiàn)象[9]。本試驗(yàn)以貴州本地玉米品種為研究對(duì)象，探索不同添加劑對(duì)溫濕生境全株玉米青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)及有氧穩(wěn)定性的影響，同時(shí)采用模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)法對(duì)青貯飼料營(yíng)養(yǎng)水平進(jìn)行評(píng)價(jià)，綜合考慮發(fā)酵品質(zhì)和有氧穩(wěn)定性，篩選出該環(huán)境下適宜全株青貯玉米使用的添加劑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)在貴州省草地技術(shù)推廣站進(jìn)行，屬于亞熱帶季風(fēng)濕潤(rùn)氣候，常年降水充沛，年均相對(duì)濕度80%左右，夏秋平均溫度20.6℃。青貯原料為蠟熟期全株玉米(營(yíng)養(yǎng)成分見表1)，取自貴州省草地技術(shù)推廣站，品種名為德江本地，添加劑為食鹽(NaCl組)(云南省鹽業(yè)有限公司，NaCl≥98.5%)、丙酸(PA組)(成都科龍化工試劑廠，CH3CH2COOH，含量≥99.5%)、乳酸菌制劑(LAB組)[鄭州樂貝豐生物科技有限公司，布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)、植物乳桿菌(Laobacillusplantarum)為主，活菌數(shù)≥108CFU·g-1]。

表1 青貯玉米原料特性(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 The characteristics of Zea mays L. material(DM basis)/%

注：CP：粗蛋白質(zhì)；EE：粗脂肪；CF：粗纖維；Ash：粗灰分；WSC：水溶性碳水化合物；DM：干物質(zhì)；下同

Note：CP：crude protein；EE：ether extract；CF：crude fiber；Ash：crude ash；WSC：water-soluble carbohydrate；DM：dry matter；The same as below

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)4個(gè)試驗(yàn)組，CK組：不加任何添加劑；LAB組：乳酸菌制劑(0.02 g·kg-1)；NaCl組：0.8%食鹽；PA組：0.5%丙酸。每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)置4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)約1 kg，添加量以原料鮮重為基礎(chǔ)，根據(jù)鮮重計(jì)算出所需添加劑的質(zhì)量，將添加劑溶于50 ml蒸餾水中，均勻噴灑于1 kg青貯料，青貯時(shí)間為60 d。

1.3 青貯制作

2016年8月20日收獲蠟熟期全株玉米，用粉碎機(jī)將其粉碎至1～2 cm，不同處理組依照試驗(yàn)設(shè)計(jì)使用不同添加劑，其中對(duì)照組噴灑等量蒸餾水，攪拌均勻后裝入青貯袋(28 cm×40 cm)，每袋裝料為1 kg左右，用抽真空機(jī)抽真空、密封，室內(nèi)避光保存60 d后打開，進(jìn)行感官評(píng)定和化學(xué)成分分析，同時(shí)評(píng)測(cè)有氧穩(wěn)定性。青貯飼料保存期間平均溫度19.8℃，平均濕度為83%。

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

感官評(píng)價(jià)：采用德國(guó)農(nóng)業(yè)協(xié)會(huì)(DLG)評(píng)分法，對(duì)飼料的顏色、氣味和結(jié)構(gòu)進(jìn)行打分，根據(jù)總分把飼料分為優(yōu)良、尚好、中等和腐敗4個(gè)等級(jí)[10]；Ash：高溫灼燒法：稱取具有代表性試樣放入煅燒盤，先在電子爐上炭化，然后放入馬弗爐中，在550℃下灼燒4 h，殘?jiān)荚嚇影俜直燃礊榇只曳趾?；WSC：硫酸—蒽酮法：準(zhǔn)確移取樣品液1 ml于試管中，立即加入5 ml硫酸—蒽酮溶液，搖勻，于沸水浴中加熱10 min，冷卻至室溫，在620 nm波長(zhǎng)下比色測(cè)取吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，得糖含量；CP：凱氏定氮法：在催化劑下，加濃硫酸消煮，使蛋白質(zhì)和其它有機(jī)態(tài)氮都轉(zhuǎn)變成無機(jī)銨鹽，然后在堿性條件下將銨鹽轉(zhuǎn)化為氨，用過量的硼酸液吸收，再以標(biāo)準(zhǔn)鹽酸滴定，根據(jù)酸的消耗量求出氮的含量，乘以換算系數(shù)6.25可計(jì)算出樣品中的CP含量；有機(jī)酸和pH：稱取青貯料30 g于具塞三角瓶中，加入270 ml去離子水，浸泡60 min后用攪拌機(jī)充分?jǐn)嚢瑁?層紗布過濾得到浸提液，PHS-3C酸度計(jì)測(cè)定浸提液得到pH值，氣相色譜法測(cè)定有機(jī)酸含量[11]；EE：索氏提取法：樣品用脂溶性溶劑(本試驗(yàn)使用石油醚)反復(fù)抽提，使全部脂肪除去，根據(jù)樣品和殘?jiān)|(zhì)量之差計(jì)算粗脂肪含量；中性洗滌纖維(neutral detergent fiber，NDF)和酸性洗滌纖維(acid detergent fiber，ADF)用范氏纖維法測(cè)定，具體操作參照《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)》[12]，鈣(Ca)按GB/T6436-2002、磷(P)按GB/T6437-2002進(jìn)行分析測(cè)定。

1.5 營(yíng)養(yǎng)水平綜合評(píng)定

運(yùn)用模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)法對(duì)青貯飼料營(yíng)養(yǎng)水平進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，如果測(cè)定的指標(biāo)與青貯飼料的營(yíng)養(yǎng)水平成正相關(guān)，則用式(1)計(jì)算；如測(cè)定指標(biāo)在某一最適值時(shí)，其營(yíng)養(yǎng)水平最高，則該指標(biāo)以最適值為標(biāo)準(zhǔn)，先計(jì)算測(cè)定值與標(biāo)準(zhǔn)值之間的絕對(duì)值，再求其倒數(shù)后用式(1)計(jì)算，本研究中，ADF和NDF依據(jù)最適值20.0%和27.5%[13]計(jì)算；如果是負(fù)相關(guān)，則用式(2)進(jìn)行計(jì)算，計(jì)算公式為：

(1):R(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)；

(2):R(Xi)=1-(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)。

公式中，R(Xi)為某指標(biāo)隸屬函數(shù)值，Xi為該指標(biāo)的測(cè)定值；Xmax為該指標(biāo)最大值；Xmin為該指標(biāo)最小值。然后對(duì)所有指標(biāo)隸屬函數(shù)值進(jìn)行相加，求其均值，以均值大小進(jìn)行排名。

1.6 有氧穩(wěn)定性測(cè)定

青貯發(fā)酵進(jìn)行到60 d時(shí)，取150 g青貯料置于500 mL干凈的廣口瓶中，廣口瓶放置到絕緣隔熱的地方。在青貯物料的中心插入一個(gè)靈敏水銀溫度計(jì)測(cè)定溫度變化，同時(shí)監(jiān)測(cè)室溫，從樣品接觸空氣到樣品溫度高于室溫2℃的時(shí)間(h)即有氧穩(wěn)定持續(xù)的時(shí)間[14]。有氧暴露期間平均氣溫14.6℃，平均濕度81%。

1.7 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Excel 2010軟件對(duì)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析整理，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示(X±SD)，采用SPSS 22.0進(jìn)行單因素方差分析單因子方差分析(one-way ANOVA)，并用Duncan氏法對(duì)各組進(jìn)行多重比較，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵品質(zhì)

感官評(píng)價(jià)結(jié)果見表2。由表2可知，感官評(píng)價(jià)得分最高的為L(zhǎng)AB組(18分)，其余各組評(píng)價(jià)得分均為17分，不管是哪個(gè)處理組，其氣味、顏色和結(jié)構(gòu)都表現(xiàn)較好，感官評(píng)價(jià)均為一級(jí)優(yōu)良。

優(yōu)質(zhì)青貯飼料pH應(yīng)當(dāng)?shù)陀?.2，由表3可知，所有處理組均低于4.2，達(dá)到優(yōu)質(zhì)青貯飼料的標(biāo)準(zhǔn)，與感官評(píng)價(jià)結(jié)果相一致。

表2 玉米青貯飼料感官評(píng)價(jià)Table 2 Sensory evaluation of corn silage

注：表格內(nèi)數(shù)值表示所得分值

Note：values in the table mean the score of sensory evaluation

表3 玉米青貯飼料pHTable 3 The pH value of corn silage

注：同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)

Note：values in the same row with different lowercase letter mean significant difference at the 0.05 level

由表4可知，所有處理組均未檢測(cè)出丁酸，乳酸含量最高的是LAB組，為21.77 mmol·L-1，但各處理組之間差異不顯著。根據(jù)青貯飼料有機(jī)酸含量及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[15]進(jìn)行打分(表4)，所有處理組有機(jī)酸評(píng)分均為滿分，與感官評(píng)定及pH情況一致。

表4 玉米青貯飼料有機(jī)酸含量及評(píng)分Table 4 Organic acid content and scores of corn silage

注：括號(hào)內(nèi)為根據(jù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)而得出的分?jǐn)?shù)，同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同

Note：Scores in brackets are given according to organic acid content and scoring standard of silage，China. Values in the same column with different lowercase letter mean significant difference(P<0.05). The same as below

2.2 營(yíng)養(yǎng)水平

由表5可知，經(jīng)不同添加劑處理后，與對(duì)照處理組相比，全株玉米青貯飼料CP含量有所降低，其中PA組和LAB組顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。但PA組EE含量最高，顯著高于其它處理組(P<0.05)。NDF和ADF均以LAB組為最高，顯著高于其它處理組(P<0.05)，WSC最高的是NaCl組，顯著高于除PA組外其它組(P<0.05)，Ash含量最高的是NaCl組，顯著高于其他組(P<0.05)，添加丙酸提高了Ca含量，顯著高于其余各組(P<0.05)，各組的P含量差異不顯著。

表5 玉米青貯飼料營(yíng)養(yǎng)水平Table 5 Nutrition composition of corn silage/% DM

采用模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)法對(duì)不同處理組營(yíng)養(yǎng)水平進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)(表6)，由表6可知，營(yíng)養(yǎng)水平最好的是PA組，最差的是CK組，各組表現(xiàn)情況為：PA>LAB>NaCl>CK，其中LAB組和NaCl組營(yíng)養(yǎng)水平均值非常接近，兩者差異可以忽略不計(jì)。

表6 玉米青貯飼料營(yíng)養(yǎng)水平評(píng)價(jià)Table 6 Nutrition evaluation of corn silage

2.3 有氧穩(wěn)定性

各處理組有氧穩(wěn)定性如表7所示。由表7可知，CK組有氧穩(wěn)定性最差，為24.5 h，顯著低于其他處理組(P<0.05)，最好的是PA組，為110.5 h，顯著高于除NaCl組之外其他組(P<0.05)。各處理組有氧穩(wěn)定性優(yōu)劣排名情況為：PA> NaCl >LAB>CK。

表7 玉米青貯飼料有氧穩(wěn)定性Table 7 Aerobic stability of corn silage

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)中，LAB組感官評(píng)分最高，但不管是哪個(gè)試驗(yàn)組，感官評(píng)價(jià)均為一級(jí)優(yōu)良，這表明全株玉米青貯時(shí)，不使用添加劑也能得到感官較好的青貯料，與許慶方等[16]研究結(jié)果一致。pH是評(píng)價(jià)青貯飼料的重要指標(biāo)，優(yōu)質(zhì)青貯料pH范圍為3.8～4.2[17]。本次試驗(yàn)中，所有處理組pH均低于4.2，較為理想。添加乳酸菌對(duì)于pH的降低效果不顯著，與鐘書等[18]研究結(jié)果不完全一致，這是由于全株玉米本身WSC含量較高，可為青貯提供充足的發(fā)酵底物，不使用添加劑發(fā)酵品質(zhì)也較好。有機(jī)酸總量及其構(gòu)成可以反映青貯發(fā)酵過程的好壞，其中乳酸、乙酸和丁酸是評(píng)判的關(guān)鍵指標(biāo)[19]。根據(jù)有機(jī)酸評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)各處理組進(jìn)行打分，所有處理組均為滿分，表明各組發(fā)酵品質(zhì)均較好。

使用添加劑可以改善青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)或營(yíng)養(yǎng)水平。采用模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)法對(duì)各組進(jìn)行排名，各添加劑處理組營(yíng)養(yǎng)水平均優(yōu)于對(duì)照組，表明使用添加劑能提高全株玉米青貯料的營(yíng)養(yǎng)水平，以PA組為最優(yōu)。乳酸菌在本次試驗(yàn)中提升效果不如丙酸，這是因?yàn)槿暧衩浊噘A時(shí)不使用添加劑發(fā)酵品質(zhì)已經(jīng)較好，添加丙酸能抑制有害微生物的活動(dòng)，較好保存原料的營(yíng)養(yǎng)，且乳酸菌發(fā)酵需要消耗一定能量，所以相對(duì)于對(duì)照組提升效果不顯著。Henderson等[20]指出牧草的青貯特性、青貯飼料保存的環(huán)境條件和添加用乳酸菌的特性等是影響乳酸菌添加劑使用效果的主要因素，楊曉丹[21]在西藏地區(qū)制作葦狀羊茅(FestucaarundinaceaSchreb)青貯飼料時(shí)添加商品乳酸菌和本地分離得到的乳酸，發(fā)現(xiàn)本地分離得到的乳酸菌改善效果優(yōu)于商品乳酸菌，所以未來研究的重點(diǎn)應(yīng)放在如何從貴州本土材料中篩選合適的乳酸菌。

青貯飼料較高的有氧穩(wěn)定性有利于降低二次發(fā)酵的幾率，減少飼料損失和家畜因采食發(fā)霉飼料而患病的風(fēng)險(xiǎn)。本試驗(yàn)中，所有添加劑處理組均不同程度提高了青貯料的有氧穩(wěn)定性，以PA組最好，為110.5 h，比CK組高出86 h，與Kung等[22]和陳雷等[23]研究報(bào)道相一致，這是因?yàn)楸崾且环N有效的抗真菌劑，對(duì)引起青貯飼料有氧腐敗的酵母菌和霉菌生長(zhǎng)均有抑制作用。乳酸菌制劑是一種常見的微生物添加劑，其對(duì)青貯飼料有氧穩(wěn)定性的影響報(bào)道不一致，Kung等[24]在大麥(HordeumvulgareL.)青貯中添加乳酸菌后，有效改善了大麥青貯飼料的有氧穩(wěn)定性，但馬迪等[25]報(bào)道，在黑麥草青貯過程中添加鼠李糖乳桿菌會(huì)使青貯飼料傾向于好氧性變質(zhì)。出現(xiàn)這種差異的原因可能與接種的乳酸菌類型有關(guān)，乳酸菌可分為同型發(fā)酵乳酸菌和異型發(fā)酵乳酸菌，同型發(fā)酵乳酸菌可有效改善青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)，而一些異型發(fā)酵乳酸菌可明顯改善青貯飼料暴露于空氣后的有氧穩(wěn)定性[26]。本次試驗(yàn)中，LAB組的有氧穩(wěn)定性比CK組高12 h，表明添加乳酸菌會(huì)增強(qiáng)青貯飼料的有氧穩(wěn)定性，與呂文龍等[27]研究結(jié)果相類似，但效果不顯著，其可能原因是青貯原材料或環(huán)境溫度的改變，影響了乳酸菌的活性，故沒有完全發(fā)揮作用[28]，且本試驗(yàn)所使用的乳酸菌制劑是混合菌劑，對(duì)青貯飼料的有氧腐敗抑制作用無單獨(dú)使用布氏乳桿菌強(qiáng)。塔娜等[29]研究報(bào)道布氏乳桿菌單獨(dú)或與同型發(fā)酵乳酸菌蒙氏腸球菌和植物乳桿菌聯(lián)合接種可有效抑制無芒雀麥(BromusinermisLeyss)青貯料的有氧腐敗，但前者更有效。食鹽一般被歸類為發(fā)酵抑制型添加劑，Cai等[30]在高粱(SorghumbicolorL. Moench)青貯詞料中添加食鹽，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵過程中食鹽能有效抑制需氧菌生長(zhǎng)，但對(duì)酵母菌抑制不佳，李大鵬[31]報(bào)道加入一定的食鹽可改善靑貯詞料的品質(zhì)，起到一定的防腐作用。本試驗(yàn)中，NaCl組顯著提高了青貯飼料的有氧穩(wěn)定性，相對(duì)于CK組，添加食鹽使有氧腐敗延遲了84 h，與瑪里蘭·畢克塔依爾等[32]的研究結(jié)果相類似。

綜上可知，全株玉米青貯時(shí)不使用添加劑也能獲得發(fā)酵品質(zhì)較好的青貯料；綜合考慮發(fā)酵品質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)水平和有氧穩(wěn)定性，在貴州地區(qū)推薦使用丙酸用作全株玉米青貯添加劑。