貝類閉殼肌-貝殼連接界面的分子組成及連接機(jī)制

廖 智，孫 琦，姜雨婷

（浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，浙江舟山 316022）

貝殼是多數(shù)軟體動物用以保護(hù)其內(nèi)部軟組織的一層硬殼，其主要成分是碳酸鈣，占貝殼總質(zhì)量95%以上。作為一種高度結(jié)構(gòu)化的，具有優(yōu)異力學(xué)性能的天然納米復(fù)合材料，貝殼相關(guān)研究不僅是仿生學(xué)及生物材料學(xué)研究的重要領(lǐng)域，同時，在生物醫(yī)學(xué)工程以及生物材料工程方面也顯示出廣闊的應(yīng)用前景[1-4]。目前，針對貝殼的研究主要包括貝殼微觀結(jié)構(gòu)的類型、組裝、碳酸鈣晶體結(jié)構(gòu)及形成過程分析，貝殼中無機(jī)質(zhì)和有機(jī)質(zhì)成分組成以及組裝特征分析，貝殼中蛋白質(zhì)（即貝殼基質(zhì)蛋白）的分子組成、結(jié)構(gòu)以及對碳酸鈣晶體形成的影響分析等。此外，貝類的肌肉與貝殼之間的連接界面，如蝸牛的中柱肌-貝殼，雙殼貝類的后閉殼肌-貝殼連接界面等，也引起人們的關(guān)注。貝類中柱肌或閉殼肌均屬肌肉組織，而貝殼是由碳酸鈣晶體構(gòu)成的非細(xì)胞組織，兩者之間的連接不僅涉及生物大分子之間的相互作用，還涉及有機(jī)物-無機(jī)物之間的結(jié)合，其本質(zhì)屬于生物粘附研究范疇?？紤]到目前肌肉與生物硬組織之間的生物粘附是生物醫(yī)學(xué)工程和生物材料學(xué)的重要研究內(nèi)容，也是組織工程材料的研發(fā)，植入，修復(fù)和替代等研究的基礎(chǔ)。因此，貝類的閉殼肌與貝殼的連接界面研究一方面可以為組織工程材料在人體中的移植修復(fù)等過程中，構(gòu)建材料與受體組織間的粘附提供很好的仿生學(xué)啟示；另一方面，該界面研究所涉及的，參與連接的關(guān)鍵蛋白分子可作為先導(dǎo)分子，在新型人工肌腱材料的研發(fā)中具有重要意義。

1 貝殼與貝殼基質(zhì)蛋白

對貝殼的研究起始于對貝殼結(jié)構(gòu)的微觀觀察和力學(xué)分析。在早期研究中，人們已注意到貝殼具有極為復(fù)雜的微觀結(jié)構(gòu)。隨著技術(shù)進(jìn)步，近20年來，人們開始關(guān)注貝殼中各種有機(jī)質(zhì)成分，特別是蛋白質(zhì)分子在貝殼中的組成、分布以及對貝殼形成的影響，相關(guān)研究逐年增多。以mollusc shell作為關(guān)鍵詞搜索Pubmed數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=mollusc+shell），可見1970-2017年，貝殼相關(guān)研究的年發(fā)表文章數(shù)量呈明顯上升趨勢（圖1）。上述研究為了解貝殼肌肉-貝殼連接界面奠定了基礎(chǔ)。而針對軟體動物肌肉-貝殼連接界面的研究則在上世紀(jì)七十年代有少量結(jié)構(gòu)分析報道，之后長期處于停滯狀態(tài)。隨著對貝殼結(jié)構(gòu)以及貝殼基質(zhì)蛋白組成的深入了解，這一方面的研究在近幾年才逐漸受到重視，但總體而言，相關(guān)研究仍然極少。由于貝類肌肉-貝殼的連接界面的研究是建立在貝殼自身結(jié)構(gòu)及貝殼基質(zhì)蛋白的結(jié)構(gòu)與功能研究基礎(chǔ)之上，因而本文首先關(guān)注貝殼與貝殼基質(zhì)蛋白的研究進(jìn)展。

圖1 1970-2017年，Pubmed數(shù)據(jù)庫收錄的貝類貝殼相關(guān)研究文章的發(fā)表數(shù)量Fig.1 The number of published papers in the field of mollusc shell at 1970-2017 from Pubmed database

貝殼是由碳酸鈣晶體經(jīng)過層層組裝而成。貝殼中的碳酸鈣晶體其主要晶型為方解石（Calcite）和文石（Aragonite）兩種物相結(jié)構(gòu)[5-7]。根據(jù)碳酸鈣晶型和形貌的區(qū)別，可將貝殼結(jié)構(gòu)分為不同的微觀結(jié)構(gòu)層次，常見的有三種，即珍珠質(zhì)層（Nacre），棱柱層（Prismatic layer）和斜交叉層（Obliquely Crossed Crystals）[8-9]。上述分層僅是從貝殼的整體結(jié)構(gòu)而言所做的一個簡單分層，事實上，不同貝類的貝殼結(jié)構(gòu)，不論是整體外形還是微觀結(jié)構(gòu)組成方面，均表現(xiàn)出明顯的結(jié)構(gòu)多樣性特征[10-11]。根據(jù)CARTER[11]對不同貝類貝殼的掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果，報道了至少七組不同類型的微結(jié)構(gòu)，包括棱柱組（Prismatic）、球狀組（Spherulitic）、板狀組（Laminar）、交叉組（Crossed）、均質(zhì)組（Homogeneous）、孤立針狀組（Isolated spicules and spikes）以及孤立晶體組（Isolated crystal morphotypes）。不同貝類的貝殼中，其微觀結(jié)構(gòu)的組裝形式和種類不一樣，但通常包括上述2～7種結(jié)構(gòu)層次。不同的微觀結(jié)構(gòu)層次往往也具有不同的力學(xué)性能，目前發(fā)現(xiàn)貝殼中，參與和肌肉連接的結(jié)構(gòu)層次主要是肌棱柱層（myostracum），屬于棱柱組類型。

貝殼所具備的優(yōu)異力學(xué)性能不僅來自于碳酸鈣晶體在納米層次的結(jié)構(gòu)組裝，也來自于貝殼中各種有機(jī)質(zhì)成分的輔助[12]。有機(jī)質(zhì)是貝殼的重要組成成分，盡管其含量較低，不到貝殼總質(zhì)量的5%，但對貝殼的形成以及貝殼的力學(xué)性能起到了至關(guān)重要的作用。特別是其中的蛋白質(zhì)，貝殼基質(zhì)蛋白（Shell Matrix Protein，SMP），直接影響了貝殼碳酸鈣晶體的成核以及定向生長等過程[12-15]；而貝殼中的其他有機(jī)物，如幾丁質(zhì)等成分，在貝殼的貝殼無機(jī)相與有機(jī)相的分子連接以及構(gòu)建貝殼框架結(jié)構(gòu)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[16-17]。在貝殼有機(jī)物的指導(dǎo)和調(diào)控下，最終將碳酸鈣晶體沉積形成具有不同微觀結(jié)構(gòu)層次的貝殼，這一過程被稱之為生物礦化（Biomineralization），這也是一個無機(jī)相-有機(jī)相不同分子的相互識別和相互作用的過程[18]。同時，貝殼基質(zhì)蛋白中，也必然有一部分蛋白參與了貝殼與肌肉組織之間的連接，因而貝殼基質(zhì)蛋白的研究為從中篩選參與肌肉-貝殼連接的關(guān)鍵蛋白奠定了基礎(chǔ)。

目前已報道的貝殼基質(zhì)蛋白種類眾多，目前在美國國立醫(yī)學(xué)圖書館的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（National Center for Biotechnology Information Search database）中，以“molluscs shell matrix protein”作為關(guān)鍵詞可搜索到的蛋白質(zhì)種類達(dá)到785種，可歸屬于37個蛋白質(zhì)家族（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ipg?term=molluscs%20shell%20matrix%20protein）。其物種來源涉及142種軟體動物，絕大多數(shù)來自雙殼綱Bivalves，少數(shù)來自腹足綱Gastropods和頭足綱Cephalopods。其分子大小從95個氨基酸殘基（數(shù)據(jù)庫編號：AAQ08227.1）到1 912個氨基酸殘基（數(shù)據(jù)庫編號：JAP63242.1）不等。就單獨的貝類貝殼而言，一種貝類貝殼中所包含的貝殼基質(zhì)蛋白種類推測在200種以上[19]，但在實際研究時，由于貝殼基質(zhì)蛋白的含量極低，且通常水溶性極差，因而即使采用蛋白質(zhì)組學(xué)策略，往往也只能鑒定到其中數(shù)十種豐度較高的基質(zhì)蛋白。例如，UPADHYAY，et al[20]從牡蠣Crassostrea hongkongensis和C.angulata的貝殼中分別鑒定到42和37種貝殼基質(zhì)蛋白；ARIVALAGAN，et al[21]從蛤 Mya truncata的貝殼中鑒定到 67種貝殼基質(zhì)蛋白；LIU Chuang，et al[22]從珠母貝Pinctada fucata的貝殼中鑒定到72種貝殼基質(zhì)蛋白；筆者也分別從地中海貽貝Mytilus galloprovincialis和厚殼貽貝M.coruscus貝殼中分別鑒定到113和63種貝殼基質(zhì)蛋白等[23-24]。已報道的貝殼基質(zhì)蛋白往往具有特定的結(jié)構(gòu)域或特殊的氨基酸組成，且在貝殼不同微觀結(jié)構(gòu)層次中也具有不同的分布特征[25]。因此可以根據(jù)貝殼基質(zhì)蛋白在貝殼不同層次或者不同晶型碳酸鈣中的分布大致可將貝殼基質(zhì)蛋白分為珍珠質(zhì)層特有基質(zhì)蛋白，棱柱層特有基質(zhì)蛋白等，或方解石層特有基質(zhì)蛋白，文石層特有基質(zhì)蛋白等[26]。由于相關(guān)綜述較多，因此筆者在此不做贅述。但值得注意的是，由于參與貝類閉殼肌-貝殼連接的主要結(jié)構(gòu)層次是屬于棱柱層的肌棱柱層，因而該層所特有的貝殼基質(zhì)蛋白很有可能參與了該界面的連接。

上述研究不僅使人們了解貝殼自身的結(jié)構(gòu)特征及貝殼基質(zhì)蛋白的種類和分布特征，同時也發(fā)現(xiàn)參與肌肉連接的貝殼部位與非肌肉連接的貝殼部位在微觀結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)分子組成方面具有明顯差異，這為貝類肌肉-貝殼連接界面的相關(guān)研究起到了重要的推動作用。

2 貝類肌肉-貝殼連接界面的連接模型

貝殼中，特別是雙殼貝類的后閉殼肌-貝殼連接界面（adductor-muscle-shell attachment，AMS）不僅涉及生物大分子之間的相互作用，還涉及有機(jī)物-無機(jī)物之間的粘附。目前在人造骨骼移植以及人工肌腱材料的臨床應(yīng)用中，均面臨人造骨骼和肌肉間不易產(chǎn)生粘連，粘附力不足易斷裂以及生物相容性差等問題[27]。而貝類的閉殼肌與貝殼的連接界面涉及到兩種不同的組織體系（肌肉和貝殼）間的連接，因而該連接界面的研究對相關(guān)生物醫(yī)學(xué)和材料學(xué)研究具有很好的啟示意義。因此，對于貝類肌肉與貝殼之間的連接，人們首先關(guān)注的是其力學(xué)性能以及該界面的微觀結(jié)構(gòu)。雙殼貝類閉殼肌通過緊密結(jié)合貝殼，可將兩片貝殼緊緊的拉在一起（圖2）。對雙殼貝類而言，閉殼肌收縮時產(chǎn)生的作用力極強(qiáng)，GALTSOFF[28]曾報道，牡蠣C.virginica的貝殼閉合后，需20 kg的拉力方可將其拉開；而在強(qiáng)行拉開牡蠣閉合的雙殼過程中，斷裂部位通常發(fā)生在閉殼肌內(nèi)部，而閉殼肌與貝殼的連接界面仍然保持完整。上述研究一方面表明閉殼肌本身具有較強(qiáng)的收縮力，另一方面也表明貝類閉殼肌與貝殼之間的連接極為緊密，具有很高的連接強(qiáng)度?？紤]到閉殼肌主要成分為肌纖維，而貝殼主要成分為碳酸鈣晶體，這兩者之間的連接作為一種典型的無機(jī)相-有機(jī)相連接模式，人們首先關(guān)注的是其連接結(jié)構(gòu)。

目前，對于貝類肌肉-貝殼連接界面微觀結(jié)構(gòu)的研究早期主要集中在鸚鵡螺以及腹足類的中柱肌-螺殼的連接界面，例如 ISAJI，et al[29]對于鸚鵡螺以及 TOMPA，et al[30]對陸生蝸牛的中柱肌-殼連接界面的微觀結(jié)構(gòu)研究；在上述研究中，研究者提出了一個“上皮（肌腱）細(xì)胞-半透明膜-貝殼”（epithelium-semitransparent membrane-shell junction）的連接模型（圖3）。肌肉細(xì)胞通過肌腱細(xì)胞（tendon cell）實現(xiàn)與殼之間的連接。同時，上述研究還觀察到肌肉中有少量纖維組織深入到殼層內(nèi)部，從而有利于強(qiáng)化這種連接。

雖然該模型從細(xì)胞層面對肌肉-貝殼連接界面的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行了描述，但是該模型是建立在鸚鵡螺以及蝸牛的中柱肌與殼的連接方式基礎(chǔ)上，而中柱肌-殼的連接強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于雙殼貝類的閉殼肌-貝殼連接[30]；另一方面，該模型側(cè)重于細(xì)胞及組織水平構(gòu)建一個連接模型，而對于在這一連接界面中有哪些分子起到了關(guān)鍵作用以及相關(guān)連接的分子機(jī)理并未涉及。對雙殼貝類的閉殼肌-貝殼連接界面研究起始于對連接界面的微觀結(jié)構(gòu)觀察，例如早期NAKAHARA，et al[31]利用電鏡觀察了貝類Pinctuda rudiatu閉殼肌-貝殼連接界面，SONG Yingfei，et al[32]對地中海貽貝的后閉殼肌-貝殼的連接界面的電鏡觀察，以及近期ZHU Yaoyao，et al[33]對三種雙殼貝后閉殼肌痕的微觀結(jié)構(gòu)觀察。上述研究報道了該界面的微觀結(jié)構(gòu)，特別是貝殼部分的碳酸鈣晶體結(jié)構(gòu)，而并未涉及肌肉-貝殼的分子組成以及連接機(jī)理。上述研究雖然提供了一個貝類-肌肉連接的模型，但相關(guān)分子機(jī)制仍依賴于貝殼類各種基質(zhì)蛋白的研究，特別是需要通過蛋白質(zhì)組學(xué)手段首先判斷貝殼與肌肉連接的部位有哪些蛋白質(zhì)分子的存在，且這些蛋白不涉及貝殼自身晶體結(jié)構(gòu)的形成，而是涉及兩種界面的連接或者粘附，這方面的工作仍然任重而道遠(yuǎn)。

圖2 厚殼貽貝后閉殼?。╬osterior adductor）以及伸（縮）足肌群（retractor muscle與貝殼內(nèi)層連接部位（圖片摘自筆者未發(fā)表數(shù)據(jù)）Fig.2 The posterior adductor between shells and the retractor muscles between mussel foot and shell in M.coruscus （from unpublished data）

圖3 蝸牛（Gastropod）中柱肌與殼連接的模式圖（摘自TOMPA，et al[30]）Fig.3 Diagrammatic representation of the gastropod muscle attachment to the shell （from TOMPA,et al[30]）

3 雙殼貝類后閉殼肌痕的微觀結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)分子組成

在雙殼貝類中，閉殼肌與貝殼連接的部位被稱為后閉殼肌痕（Adductor Muscle Scar，AMS）[34-35]。在該部位，后閉殼肌肌纖維直接連接于貝殼內(nèi)側(cè)，其連接部位的主要貝殼結(jié)構(gòu)層次為肌棱柱層（Myostracum）。肌棱柱層為單層柱狀結(jié)構(gòu)，在外型上與珍珠質(zhì)層和纖維棱柱層差異較大，在貝殼中所占比例較低且往往包埋在貝殼內(nèi)部（圖4），但在肌肉-貝殼連接界面，即后閉殼肌痕部位，該層暴露于貝殼內(nèi)側(cè)表面并直接與后閉殼肌連接，這意味著肌棱柱層在貝殼與肌肉的連接中發(fā)揮著重要作用，也必然存在某種分子機(jī)制將肌棱柱層與后閉殼肌兩種完全不同的物相體系緊密結(jié)合在一起。肌棱柱層碳酸鈣晶型通常為文石型[36-37]或者文石型和方解石型混合[32]。GAO Peng，et al[23]的研究表明，地中海貽貝貝殼的肌棱柱層中，含有34種肌棱柱層特有的基質(zhì)蛋白，其中，包括Calponin類蛋白，Transgelin類蛋白，含THY結(jié)構(gòu)域（thymosin beta actinbinding motif）的蛋白等。上述蛋白序列中含有Calponin，Calponin-homology以及THY等具有肌動蛋白結(jié)合功能的結(jié)構(gòu)域。推測肌棱柱層中該類型蛋白可能參與了與閉殼肌中肌動蛋白的結(jié)合，從而使得肌棱柱層與閉殼肌組織緊密的連接在一起，最終介導(dǎo)了貝殼的閉合[38]。此外，在地中海貽貝以及厚殼貽貝肌棱柱層中還發(fā)現(xiàn)豐富的膠原類蛋白[23-24]；而此前已知膠原蛋白酶處理可以有效地降低牡蠣C.virginica后閉殼肌與貝殼之間的結(jié)合力[28]。上述研究表明，膠原類蛋白可能也在貝殼-肌肉的連接中發(fā)揮著重要作用。此外，ZHAO Che，et al[39]的研究表明，在蝦夷扇貝Patinopecten yessoensis閉殼肌-貝殼連接部位的表面結(jié)構(gòu)中，存在直徑約為7 μm的孔洞結(jié)構(gòu)（Pit structure），并推測該孔洞可能是膠原蛋白在閉殼肌-貝殼連接界面的貫穿部位。對貽貝的后閉殼肌痕表面結(jié)構(gòu)研究也有類似發(fā)現(xiàn)[40-41]。同時，在研究中，還發(fā)現(xiàn)地中海貽貝的后閉殼肌與肌棱柱層表面之間存在一層有機(jī)質(zhì)膜，且發(fā)現(xiàn)肌肉組織與該膜之間存在纖維狀物質(zhì)的連接[41]（圖5），同時，SONG，et al[32]發(fā)現(xiàn)在貽貝貝殼內(nèi)部也存在纖維狀連結(jié)物質(zhì)。上述研究表明，閉殼肌與貝殼肌棱柱層之間的連接可能不僅有成膜蛋白的參與，也有纖維類蛋白質(zhì)的參與，由此形成了肌肉-膜-貝殼的連接體系，且該體系有膠原類蛋白貫穿并加強(qiáng)了該連接界面的強(qiáng)度。

圖4 幾種代表性貝類的肌棱柱層電鏡圖像Fig.4 The SEM photo of myostracum from some representative bivalves

圖5 貝類后閉殼肌痕部位表面結(jié)構(gòu)Fig.5 The SEM photo of AMS surface from some representative bivalves

目前，關(guān)于閉殼肌-貝殼連接界面的研究由于涉及生物化學(xué)，分子生物學(xué)，生物力學(xué)，生物物理學(xué)等多個學(xué)科，綜合性較強(qiáng)，研究難度較大，相關(guān)研究也較少，目前對該界面連接的分子機(jī)制也多數(shù)處于推測狀態(tài)，但隨著研究的深入，人們必將深入了解該連接界面的分子機(jī)制并對仿生學(xué)和生物材料學(xué)研究產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。