刺參神經(jīng)肽S受體基因的克隆及表達(dá)

宋伊敏，楊靜文，閆允君，平洪領(lǐng),2，王天明

（1.浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，國(guó)家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程與技術(shù)研究中心，浙江舟山 316022；2.浙江海洋大學(xué)海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316021）

神經(jīng)肽S（neuropeptide S，NPS）是于2002年發(fā)現(xiàn)的一種活性肽，利用反向藥理學(xué)證明它是GPR154（G-protein coupled receptor 154，其功能與哮喘、過(guò)敏、焦慮及炎癥反應(yīng)相關(guān)）的內(nèi)源性配體[1]，后經(jīng)XU Yanling，et al[2]對(duì)其進(jìn)一步研究將其命名為神經(jīng)肽S。NPS作為一類(lèi)肽類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)，由20個(gè)氨基酸組成，通過(guò)激活其受體（NPSreceptor，NPSR）介導(dǎo)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[3]。NPSR是一種G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR），主要結(jié)合Gs和Gq蛋白；NPS與NPSR結(jié)合后，可引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+瞬時(shí)增加，也可使cAMP水平提高[2]，此外，還能激活MAPK信號(hào)通路從而激活細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein，ERK1/2）[4-5]，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)下游信號(hào)的傳遞。NPSR與其他多肽受體有中等程度的同源性，尤其是血管加壓素（vasopressin/oxytocintype，VP/OT-type）受體，但也僅僅有 21%～23%的氨基酸殘基相同[6]。XU Yanling，et al[2]發(fā)現(xiàn)，NPS 前體肽mRNA在大鼠的腦、甲狀腺、唾液腺、乳腺、脊髓、眼、舌、心、肺、小腸、睪丸、食管等多種組織中均有表達(dá)，在腦、甲狀腺、唾液腺和乳腺表達(dá)水平最高，在外周組織有少量分布，而其受體NPSR mRNA則高表達(dá)于神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，如運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)、前嗅核、梨狀皮質(zhì)、丘腦、下丘腦、杏仁核等，同時(shí)在外周組織中亦有廣泛表達(dá)[7-8]。

NPSR已在人、兔、家豬等高等動(dòng)物中得到克隆，且生理功能的研究主要集中于大鼠、小鼠等高等模式動(dòng)物[9-10]，在低等動(dòng)物中的相關(guān)研究較少。目前研究表明，NPS系統(tǒng)在抗焦慮恐懼[11]，調(diào)節(jié)動(dòng)物的覺(jué)醒與睡眠[2]，調(diào)節(jié)小鼠恐懼記憶[12-13]，影響攝食行為[14-16]，調(diào)節(jié)和參與成癮過(guò)程[17-18]等諸多生理功能方面都有作用。先前的研究認(rèn)為NPS及其受體僅存在于四足動(dòng)物中（包括哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)類(lèi)、爬行動(dòng)物和兩棲動(dòng)物），然而后續(xù)更廣泛的系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，NPSR同源蛋白也存在于無(wú)脊椎動(dòng)物中。例如，在果蠅Drosophila sp和其他昆蟲(chóng)中，NPS/NPSR同源基因編碼的蛋白主要參與控制其蛻皮過(guò)程，被稱(chēng)為甲殼類(lèi)心動(dòng)肽（crustacean cardioactive peptide，CCAP）及其受體（crustacean cardioactive peptide receptor，CCAPR）[19-20]。因后口無(wú)脊椎動(dòng)物中，NPS的同源肽在N端有著共同的Asn-Gly（NG）基序，也被統(tǒng)稱(chēng)為NG肽。由于NPS/NPSR基因在進(jìn)化中出現(xiàn)較晚，且NPS系統(tǒng)廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)及外周組織，執(zhí)行眾多生理功能，因此還需要大量的工作來(lái)探究其功能特征。

刺參Apostichopus japonicus隸屬于棘皮動(dòng)物門(mén)Echinodermata、海參綱Holothuroidea、楯手目Aspidochirota、刺參科Stichopodidae[21]，是中國(guó)北方重要的海水養(yǎng)殖種類(lèi)，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高且藥用價(jià)值廣泛。海參在水溫上升至20℃以上會(huì)向深水移動(dòng)，藏于巖石下，不動(dòng)不食，進(jìn)入“夏眠”[22]。在此期間，刺參停止攝食，基礎(chǔ)代謝下降，消化道退化，體重減輕[23]。刺參夏眠期間，機(jī)體消耗自身組織維持基本的能量需求，體質(zhì)量下降30%～50%，從而嚴(yán)重影響其養(yǎng)殖產(chǎn)量[24-25]。刺參的夏眠涉及到復(fù)雜的生理過(guò)程，目前對(duì)其發(fā)生機(jī)理及調(diào)控研究不斷深入，隨著刺參全基因組數(shù)據(jù)的發(fā)布，大量基礎(chǔ)序列信息為刺參生物學(xué)研究提供極大支持[26]；從神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控角度出發(fā)，探討相關(guān)神經(jīng)激素及遞質(zhì)系統(tǒng)在夏眠等生理過(guò)程中的作用機(jī)制，將有助于進(jìn)一步闡明刺參的夏眠機(jī)制。

本研究克隆了刺參NPSR-like基因（AjNPSR-like）的全長(zhǎng)cDNA序列，利用生物信息學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的方法對(duì)AjNPSR-like的受體結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行了預(yù)測(cè)鑒定，分析了GFP融合表達(dá)蛋白AjNPSR-like-EGFP的亞細(xì)胞定位特征，檢測(cè)了其在刺參各個(gè)組織和時(shí)期的表達(dá)情況。為進(jìn)一步研究NPS/NPSR系統(tǒng)在刺參夏眠期間攝食、代謝調(diào)控中的作用機(jī)制以及在無(wú)脊椎動(dòng)物中的生理調(diào)控作用及進(jìn)化演變提供支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究所用非夏眠刺參于2016年4月取自山東青島刺參膠南養(yǎng)殖場(chǎng)，采捕刺參時(shí)池內(nèi)水溫為12.35°C，體質(zhì)量為（79.7±4.7）g；低溫運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，暫養(yǎng)馴化 1 周，池內(nèi)水溫控制在（16±0.5）°C，鹽度為 31.0±0.5，24 h不間斷充氣，每日按時(shí)投喂人工配合飼料；活體解剖獲取刺參組織（呼吸樹(shù)、消化道、體壁、肌肉、神經(jīng)環(huán)），液氮冷凍保存。非夏眠刺參取樣后，剩余刺參一直飼養(yǎng)至2016年9月，不控溫自然升至25°C以上，解剖觀察消化道退化成直徑約1 mm的細(xì)線[27]，采集各組織樣品后液氮冷凍保存。

實(shí)驗(yàn)主要采用試劑為 Trizol（Invitrogen）、三氯甲烷（國(guó)藥），異丙醇（國(guó)藥）、DEPC水（碧云天），RQ1RNase-Free DNase（Promega）、M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（Promega）、瓊脂糖（SunShineBio）、RNase-Free RNase inhibitor（Promega）、DNA Maker DL 2000（TaKaRa）、5xLoading Buffer（TaKaRa）、GelRedTM10000X in water（BLOTIUM）、0.25%胰蛋白酶（吉諾生物）、50×TAE（上海生工）、GoTaq Green Master Mix（Promega）、SMARTScribe Reverse Transcriptase（Clonetech）、TIANgel Mini Gel Extraction Kit（Tiangen）、pMD 18-T Vector（TaKaRa）、TOP10 感受態(tài)細(xì)胞（Tiangen）、引物合成及基因測(cè)序（Invitrogen）、L-Glutamine、opti-MEM（Gibico）、T4DNA 連接酶（TaKaRa）、pEGFP-N1 表達(dá)載體（Clontech）、pMD18-T（Takara）、限制性核酸內(nèi)切酶（TaKaRa）、X-treme GENE HP DNA Transfection Regant（Roche）、HEK 293 cell line、膜熒光探針DiI（碧云天）、細(xì)胞核染料DAPI（碧云天）、蓋玻片（碧云天）、SYBR Green Master Mix（TaKaRa）。

1.2 RNA提取和cDNA合成

將上述5種組織樣品從液氮中取出，研磨后取30 mg樣品，加入1 mL Trizol，用力振蕩、裂解；加200 μL氯仿，振蕩15 s室溫放置5 min；置于冷凍離心機(jī)，12 000×g，4°C，離心15 min；離心后，用新離心管吸取400 μL上清水相，再加400 μL異丙醇，完全混勻于-20°C靜置15 min以上；4°C下12 000×g離心15 min，使RNA沉淀；吸掉上清液，后加1 mL 75%的乙醇（75%的乙醇現(xiàn)配并-20°C預(yù)冷）洗滌RNA沉淀，12 000×g，4°C，離心10 min；棄上清液，重復(fù)洗滌1次；去上清液后離心1 min，吸去剩余液體，干燥RNA沉淀10 min；加30 μL DEPC水使RNA沉淀溶解，獲得總RNA樣品，經(jīng)瓊脂糖電泳檢查RNA的完整性，NanoDrop 2000分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度，檢測(cè)后的RNA放在-80℃冰箱中保存。

1.3 刺參NPSR-like基因cDNA全長(zhǎng)克隆及序列分析

根據(jù)GenBank中已知的刺參NPSR-like基因序列，利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)NPSR基因的核心片段引物（表1）；按照FirstChoiceRLM-RACE Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)（賽默飛世爾）設(shè)計(jì)3'-RACE和5'-RACE引物。將已經(jīng)反轉(zhuǎn)好并保存的刺參cDNA作為模板，用NPSR-F和NPSR-R引物進(jìn)行AjNPSR-like基因核心片段的擴(kuò)增。同時(shí)設(shè)計(jì)3'-RACE和5'-RACE特異性引物（表1），進(jìn)行3'和5'末端擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)后按照膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)切膠回收，TA克隆，篩選陽(yáng)性克隆菌落送公司測(cè)序。

在 NCBI上利用在線 ORF Finder（http:www.ncbi.nlm.gov/orffinder/）查找開(kāi)放閱讀框（ORF）；用 Net-Phos2.0Server（http://www.cbsdtu.dk/services/NetPhos/）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)；用ScanProsite tool（http://prosite.expasy.org/scanprosite/）預(yù)測(cè)二硫鍵位置；Signal4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測(cè)信號(hào)肽序列；用PredictProtein（http://www.predictprotein.org/）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)；用SWISS-MODEL（http://swissmodel.expasy.org/）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)；用 InterPro（http://www.ebi.ac.uk/interpro/scan.html）預(yù)測(cè)蛋白功能結(jié)構(gòu)域；用TMpred（http://www.ch.embnet.Org/software/TMPREDform.html）預(yù)測(cè)蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域；氨基酸序列多重比對(duì)用ClustalX軟件；采用鄰位法（Neighbor-Joining）用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，1 000次bootstraps，其余參數(shù)使用默認(rèn)值。

1.4 AjNPSR-like在細(xì)胞中的定位

為探究AjNPSR-like的亞細(xì)胞定位，通過(guò)構(gòu)建表達(dá)載體pEGFP-N1，獲得AjNPSR-EGFP的融合蛋白表達(dá)載體并通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證載體準(zhǔn)確性，構(gòu)建好的載體命名為pAjNPSR-EGFP。所用HEK293細(xì)胞采用DMEM高糖完全培養(yǎng)基培養(yǎng)（DMEM高糖培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%雙抗）。細(xì)胞培養(yǎng)在37°C、5%CO2、濕度衡定的恒溫培養(yǎng)箱（Thermo,USA）中進(jìn)行。使用X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent（Roche）按其說(shuō)明將AjNPSR-EGFP轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞，12～16 h后，將瞬時(shí)轉(zhuǎn)染AjNPSR-EGFP的HEK293細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶處理后接種于載玻片上。24 h后，膜熒光探針DiI染膜，細(xì)胞核染料DAPI染核，多聚甲醛固定后封片，置于激光掃描共聚焦顯微鏡（Leica TCS SP5II）下檢測(cè)熒光信號(hào)分布情況。

表1 刺參NPSR-like基因克隆與表達(dá)分析的引物Tab.1 Primers designed for cloning and expression analysis of AjNPSR-like gene from A.japonicus

1.5 AjNPSR-like基因表達(dá)特征分析

用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，以刺參β-tubulin基因[28]作為實(shí)驗(yàn)的內(nèi)參基因，檢測(cè)分析不同組織和夏眠刺參AjNPSR-like基因的表達(dá)特征。其擴(kuò)增體系為：cDNA模板0.4 μL，2×SYBR Premix Ex TaqTMII 5 μL，上下游引物各 0.4 μL（表 1），ROX Reference DyeII 0.2 μL，ddH2O 補(bǔ)足至 10 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 40 s；95℃ 10 s，60℃30 s，40個(gè)循環(huán)；55～95℃逐漸升溫2 min。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)。

標(biāo)準(zhǔn)曲線和CT值等由ABI7500 Real Time PCR儀自帶的軟件完成。將熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果導(dǎo)出，采用2-△CT法，用SPSS 17.0軟件分析。用Duncan法多重比較檢驗(yàn)組間差異的顯著性，P＜0.05檢查差異顯著。相關(guān)柱形圖用軟件Origin 8.0來(lái)制作。

2 結(jié)果

2.1 AjNPSR-like基因全長(zhǎng)cDNA序列分析

AjNPSR-like基因的cDNA全長(zhǎng)2 498 bp（GeneBank登錄號(hào)：MG199219），開(kāi)放閱讀框1 272 bp，編碼423 個(gè)氨基酸，5＇非編碼區(qū)（5＇UTR）716 bp，3＇非編碼區(qū)（3＇UTR）510 bp。預(yù)測(cè) AjNPSR-like蛋白的理論分子量為47.675 ku，理論等電點(diǎn)為9.45。ScanProsite tool預(yù)測(cè)二硫鍵位置在C112和 C187，有7次跨膜區(qū)；通過(guò)SignalP 4.1 Server分析發(fā)現(xiàn)沒(méi)有信號(hào)肽酶切位點(diǎn)；同時(shí)含有1個(gè)糖基化位點(diǎn)，46個(gè)磷酸化位點(diǎn)（圖1）。在線預(yù)測(cè)其3D結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)具有7段跨膜結(jié)構(gòu)域（圖2-a），其二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)亦同樣表明有7段跨膜結(jié)構(gòu)域（圖 2-b）。

2.2 AjNPSR-like同源比對(duì)與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

通過(guò)NCBI BLAST軟件對(duì)AjNPSR-like預(yù)測(cè)蛋白序列在線比對(duì)，結(jié)果顯示該序列與紫海膽Strongylocentrotus purpuratus NPS/CCAP-type（CCAP：crustacean cardioactive peptide）受體（SpNPSR）的相似性最高，為47%。多序列比對(duì)顯示AjNPSR-like與其他物種NPSR/CCAPR有中等程度的同源性（圖3）。

系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示（圖4），NPSR及其同源基因CCAPR具有明顯的進(jìn)化分布特征，脊椎動(dòng)物中為NPSR聚為一支；無(wú)脊椎動(dòng)物中主要聚為兩支，一支為后口動(dòng)物的棘皮動(dòng)物，包括海百合Antedon mediterranea、海星Asterias rubens、刺參、紫海膽，一支為原口動(dòng)物的軟體動(dòng)物、節(jié)肢動(dòng)物等，包括長(zhǎng)牡蠣Crassostrea gigas、光滑雙臍螺Biomphalaria glabrata，溫室希蛛Parasteatoda tepidariorum、埃及伊蚊Aedes aegypti、黑腹果蠅Drosophila melanogaster、赤擬谷盜Tribolium castaneum、大紅斑蝶Danaus plexippus、二化螟Chilo sup-pressalis和棉鈴蟲(chóng)Helicoverpa armigera，主要命名為CCAPR。刺參AjNPSR-like與紫海膽NPS/CCAP-type受體、海星NPS/CCAP-type受體的進(jìn)化關(guān)系最近，之后與海百合NPS/CCAP-type受體聚為另一分支，與其他脊椎動(dòng)物NPSR聚為另一大支。該進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果展示了棘皮動(dòng)物中NPSR或其同源受體具有較高的相似性，并與其進(jìn)化地位保持一致。

圖1 刺參NPSR-like基因全長(zhǎng)cDNA序列和對(duì)應(yīng)的氨基酸序列Fig.1 Full-length cDNA sequence and corresponding amino sequence of NPSR-like gene of A.japonicus

圖2 預(yù)測(cè)AjNPSR-like其蛋白結(jié)構(gòu)和跨膜區(qū)域Fig.2 Predicted AjNPSR-like protein structure and domain organization

圖3 AjNPSR-like氨基酸序列與其他物種同源蛋白的多序列比對(duì)Fig.3 Multialignment of AjNPSR-like with homologies from other species

圖4 根據(jù)AjNPSR-like氨基酸序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 NJ phylogenetic tree analysis of AjNPSR-like amino acid sequence from A.japonicus and other species

圖5 融合蛋白AjNPSR-EGFP在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)Fig.5 Confocal microscopy of HEK293 cells expressing the AjNPSREGFP fusion protein

2.3 AjNPSR-like在HEK293細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位

為分析AjNPSR-like亞細(xì)胞定位，本研究將構(gòu)建的pAjNPSR-like-EGFP的融合表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞，24 h后，多聚甲醛固定，用DiI染膜，DAPI染核，后封片，置于激光共聚焦掃描顯微鏡觀察。觀察顯示，在成功轉(zhuǎn)染pAjNPSR-like-EGFP的HEK293細(xì)胞中，能觀察到明顯的熒光，且細(xì)胞形態(tài)良好，轉(zhuǎn)染成功的熒光主要分布在細(xì)胞膜上，與膜染料DiI熒光信號(hào)重疊（圖5）。結(jié)果證明pAjNPSR-like-EGFP受體融合蛋白定位于細(xì)胞膜，其C端EGFP標(biāo)記不影響AjNPSR-like蛋白表達(dá)和膜定位，證明本研究克隆得到的AjNPSR-like是跨膜蛋白，這與基于生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的A-jNPSR-like屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族結(jié)果一致。

2.4 AjNPSR-like基因在刺參成體不同組織中的表達(dá)差異分析

AjNPSR-like mRNA在非夏眠刺參呼吸樹(shù)、消化道、體壁、肌肉、神經(jīng)環(huán)等5個(gè)組織中均有表達(dá)，但表達(dá)水平有所差異，在肌肉中表達(dá)量最高，其次為體壁和神經(jīng)環(huán)；在夏眠期間，刺參各組織中的AjNPSR-like mRNA表達(dá)水平顯著上升，且在消化道、體壁、肌肉和神經(jīng)環(huán)中AjNPSR-like的表達(dá)極顯著高于非夏眠期間A-jNPSR-like的表達(dá)量（圖6）。

圖6 AjNPSR-like基因在5個(gè)組織中的表達(dá)差異分析（n=3）Fig.6 Expression level of AjNPSR-like mRNA in five tissues of A.japonicus

3 討論

本研究通過(guò)RACE技術(shù)克隆獲得刺參AjNPSR-like基因的cDNA序列的全長(zhǎng)為2 498 bp，編碼423個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)分析其具有GPCR家族典型的7次跨膜螺旋結(jié)構(gòu)（7 TM helix），這些TM區(qū)在受體活化、磷酸化、受體表達(dá)、信號(hào)傳遞等方面起重要作用，跨膜蛋白在細(xì)胞中常以離子通道形式存在，執(zhí)行信號(hào)傳導(dǎo)或物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)功能[29]。其氨基酸序列與紫海膽NPS/CCAP受體相似性最高，為47%，這與其進(jìn)化地位一致。BERNIER，et al[30]研究了NPS結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)NPS N端1/3的氨基酸殘基對(duì)受體的激活是必須的；前 6個(gè)氨基酸特別是第 2（Phe，苯丙氨酸）、3（Arg，精氨酸）、4（Asn，天冬氨酸）和 6個(gè)氨基酸殘基（Val，纈氨酸）是激活受體所必需的。NPS與NPSR結(jié)合后，可引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+瞬時(shí)增加，也可使細(xì)胞內(nèi)cAMP水平升高，表明NPS偶聯(lián)的主要是Gs和Gq蛋白[31]。刺參NPSR-like氨基酸序列與多個(gè)物種的NPSR及同源基因CCAPR氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析，顯示刺參NPSR-like與棘皮動(dòng)物的NPSR/CCAPR聚類(lèi)，并與脊椎動(dòng)物的NPSR家族和原口動(dòng)物的軟體動(dòng)物和節(jié)肢動(dòng)物的CCAPR家族各自聚成一支，這一方面說(shuō)明NPSR/CCAPR系統(tǒng)在進(jìn)化過(guò)程中經(jīng)歷了明顯的演變過(guò)程，亦說(shuō)明深入開(kāi)展棘皮動(dòng)物NPSR/CCAPR具有重要的基礎(chǔ)理論價(jià)值。

目前研究認(rèn)為，棘皮動(dòng)物NPSR/NPSR-like與無(wú)脊椎動(dòng)物心臟加速肽受體（CCAPR）同源；且NPSR/NPSR-like/CCAPR這組受體與脊椎動(dòng)物、非脊椎動(dòng)物血管加壓素樣受體（VP/OT-type receptor）系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最為密切[32]。已有研究表明，棘皮動(dòng)物中存在的NG肽，一方面與無(wú)脊椎動(dòng)物中的NPS有著共同的Asn-Gly基序，另一方面NG肽的前體肽具有激素運(yùn)載蛋白結(jié)構(gòu)域，而這種結(jié)構(gòu)域在過(guò)去的研究中認(rèn)為是VP/OT-type（Vasopressin/Oxytocin-type）肽的前體肽中所特有的，因此棘皮動(dòng)物中存在的NG肽及其受體可以被看做是進(jìn)化過(guò)程中連接NPS/NPSR系統(tǒng)和VP/OT-type肽及其受體的橋梁[33-34]。在進(jìn)化過(guò)程中，很可能是VP/OT系統(tǒng)在基因的加倍過(guò)程中，一個(gè)拷貝保持了VP/OT系統(tǒng)在演化中的穩(wěn)定，另一個(gè)拷貝則發(fā)生了改變從而演化出無(wú)脊椎后口動(dòng)物中的NG肽系統(tǒng)和原口動(dòng)物的CCAP系統(tǒng)[32]。目前紫海膽中脊椎動(dòng)物NPSR的同源受體被克隆和鑒定，被稱(chēng)為NPS/CCAP-type受體，它能夠被紫海膽的一種NG肽：NGFFFamide所激活，該神經(jīng)肽由包含運(yùn)載蛋白的前體蛋白衍生而來(lái)[35]。這一發(fā)現(xiàn)將脊椎動(dòng)物中的NPS型受體、無(wú)脊椎動(dòng)物中的NG肽以及CCAP型受體聯(lián)系起來(lái)。紫海膽NGFFFamide受體是第一個(gè)以棘皮動(dòng)物為特征的NPSR-type受體。本研究后續(xù)的工作將使用刺參中的一種候選NG肽：NGIWYamide來(lái)探究其對(duì)A-jNPSR-like的激活情況，從而進(jìn)一步揭示其在系統(tǒng)進(jìn)化方面具有的重要意義。

實(shí)時(shí)熒光定量數(shù)據(jù)顯示，AjNPSR-like mRNA在外周組織中均有分布，這與XU Yanling，et al[2]在大鼠中的研究結(jié)果相似，說(shuō)明AjNPSR-like在刺參中可能也參與多種生理活動(dòng)的調(diào)控。有研究人員發(fā)現(xiàn)，NPSR可以抑制大鼠、小鼠、雞的攝食[14-15,36]，也有研究報(bào)道NPSR能促進(jìn)大鼠的進(jìn)食[16]。NPSR在刺參夏眠階段消化道中的表達(dá)量明顯提高，提示可能抑制了夏眠期間刺參的攝食。另外，有研究指出，NPS通過(guò)激活其受體NPSR可抑制小鼠杏仁核和額葉皮質(zhì)5-羥色胺（5-HT）的釋放[37]，而5-HT作為重要的單胺類(lèi)神經(jīng)激素，在動(dòng)物的攝食調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，與刺參夏眠代謝調(diào)控存在相互作用[38]。在運(yùn)動(dòng)方面，NPS通過(guò)激活NPSR調(diào)節(jié)基底神經(jīng)節(jié)的活動(dòng)從而發(fā)揮增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)水平的作用[39]。但由于刺參屬于無(wú)脊椎動(dòng)物，缺乏高級(jí)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，因此需要進(jìn)一步的研究來(lái)闡明NPSR是如何通過(guò)其神經(jīng)系統(tǒng)來(lái)調(diào)節(jié)攝食和代謝的，特別是其在刺參節(jié)律行為的調(diào)控作用方面的作用研究亦值得關(guān)注[40]。目前對(duì)于NPSR的體內(nèi)體外研究主要集中于嚙齒類(lèi)動(dòng)物（大鼠、小鼠、兔）[41-42]及哺乳動(dòng)物（人、豬）[10,43]上，對(duì)于無(wú)脊椎動(dòng)物NPSR的組織表達(dá)、生理功能等研究報(bào)道較少，因此有必要開(kāi)展這方面研究，進(jìn)一步闡明NPSR系統(tǒng)在物種進(jìn)化中的演變，并為研究NPSR在棘皮動(dòng)物等低等動(dòng)物中的功能及生理調(diào)控機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究對(duì)刺參AjNPSR-like的基因全長(zhǎng)及其編碼蛋白進(jìn)行了特征分析，確定了AjNPSR-like受體蛋白的亞細(xì)胞定位特征，研究了其在刺參不同組織中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平及夏眠期間的高表達(dá)特征，探討了NPS/NPSR系統(tǒng)可能在刺參生理調(diào)控中的作用，為進(jìn)一步探究該系統(tǒng)的生理調(diào)控功能及進(jìn)化演變奠定基礎(chǔ)。