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    響應(yīng)面法優(yōu)化彈簧糊精的酶解制備工藝

    2018-09-18 02:56:48閔丹丹徐學(xué)明焦愛權(quán)潘小衛(wèi)金征宇
    關(guān)鍵詞:普魯蘭蠟質(zhì)糊精

    閔丹丹, 徐學(xué)明, 焦愛權(quán), 潘小衛(wèi), 金征宇

    (食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江南大學(xué),江蘇 無錫 214122)

    彈簧糊精是由葡萄糖單元由α-(1→4)糖苷鍵連接而成的線性,多分散性的多糖,因其柔性螺旋結(jié)構(gòu)像彈簧一樣具有可逆的拉伸和松弛特性而得名[1]。彈簧糊精的特殊結(jié)構(gòu),使其在淀粉抗老化,包埋活性物質(zhì)以及手性分離方面展現(xiàn)了廣闊的應(yīng)用前景[1~5]。

    彈簧糊精的制備方法主要有酶法合成和酶法分解。酶法合成反應(yīng)成本高,反應(yīng)工藝復(fù)雜,難以進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。2012年,徐等[6]采用α-淀粉酶酶解直鏈淀粉制備彈簧糊精,在制備過程中,需要對(duì)支鏈淀粉和直鏈淀粉進(jìn)行分離,這使得加工過程變得繁瑣。并且由于α-淀粉酶作用位點(diǎn)隨機(jī),產(chǎn)物聚合度分布廣,且產(chǎn)率較低。

    Tokuya等[7]使用凝膠排阻層析法分析普魯蘭酶對(duì)支鏈淀粉的剪切方式,發(fā)現(xiàn)普魯蘭酶首先是從外側(cè)水解支鏈淀粉,而普魯蘭酶水解物中只有聚合態(tài)支鏈淀粉和線性葡聚糖,即彈簧糊精。并且,普魯蘭酶專一水解α-(1→6)糖苷鍵。采用普魯蘭酶制備彈簧糊精的反應(yīng)過程容易控制,產(chǎn)物聚合度較為集中。由于蠟質(zhì)玉米淀粉幾乎全部為支鏈淀粉,直鏈淀粉很少,選其為原料,可以省去繁瑣的分離步驟。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    蠟質(zhì)玉米淀粉:杭州普羅星淀粉有限公司產(chǎn)品;普魯蘭酶(1 000 U/mL):諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;配有多角度激光光散射儀檢測器和示差檢測器的凝膠色譜系統(tǒng)(HPSEC-MALLS-RI檢測系統(tǒng)):美國Wyatt公司產(chǎn)品;DHG-9123A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱:上海柏欣儀器設(shè)備廠產(chǎn)品;Dionex ICS-5000高效陰離子交換色譜系統(tǒng) (HPAECPAD):美國戴安公司產(chǎn)品。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 彈簧糊精的制備 準(zhǔn)確稱取5 g蠟質(zhì)玉米淀粉,加入90 mL去離子水,在沸水浴中攪拌15 min,使其預(yù)糊化,再于121℃條件下高壓處理15 min,使其徹底糊化,冷卻至室溫后,加入5 mL一定pH值的醋酸鈉緩沖溶液,再加入一定體積的普魯蘭酶,然后放入一定溫度的水浴鍋中震蕩一段時(shí)間;將完成上述酶解反應(yīng)的溶液煮沸,冷卻后在離心機(jī)中以5 000 r/min的速度離心10 min,除去變性酶,取上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后60℃度烘干,即得彈簧糊精粗品。

    1.2.2 彈簧糊精相對(duì)分子質(zhì)量信息的測定 使用HPSEC-MALLS-RI檢測系統(tǒng)對(duì)彈簧糊精樣品的平均相對(duì)分子質(zhì)量和相對(duì)分子質(zhì)量分布進(jìn)行測定[8]。流動(dòng)相為0.3 mol/L NaNO3溶液 (含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02%的NaN3),經(jīng)0.45 μm的濾膜過濾后,超聲 30 min;流動(dòng)相流量0.5 mL/min,流動(dòng)相折光指數(shù)為1.331,進(jìn)樣量 200 μL,柱溫 50 ℃,折光指數(shù)增量(dn/dc)為0.147。采用Astra軟件對(duì)激光散射信號(hào)和示差折光檢測器信號(hào)進(jìn)行采集、分析和計(jì)算。

    取25~30 mg彈簧糊精粗品,溶解于3 mL流動(dòng)相溶液中,經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后進(jìn)樣。

    1.2.3 彈簧糊精聚合度分布的測定 使用配有ED-40型脈沖電流檢測器的高效陰離子交換色譜(HPAEC-PAD)對(duì)彈簧糊精的鏈長分布進(jìn)行檢測[9-10]。色譜柱型號(hào)為戴安CarboPAC PA200。流動(dòng)相:100 mmol/L NaOH(A),100 mmol/L NaOH+600 mmol/L NaAC(B)。采用線性梯度洗脫:0 min時(shí)為體積分?jǐn)?shù)20%的洗脫液B,在60 min時(shí)為體積分?jǐn)?shù)100%的洗脫液B。流量為1 mL/min,進(jìn)樣量25 μL。將彈簧糊精溶于去離子水后加熱溶解,配成3 mg/mL的溶液,過0.25 μm的濾膜后進(jìn)樣。

    1.2.4 彈簧糊精純度的計(jì)算 圖1為使用HPSECMALLS-RI檢測系統(tǒng)所測出的普魯蘭酶酶解蠟質(zhì)玉米淀粉不同時(shí)間所得到的酶解產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量分布。peak1和peak2是普魯蘭酶酶解蠟質(zhì)玉米淀粉所得線性葡聚糖(即彈簧糊精)的相對(duì)分子質(zhì)量分布(1 200~18 000),此結(jié)果與 Cai等[11]使用異淀粉酶酶解蠟質(zhì)玉米淀粉所得線性葡聚糖的相對(duì)分子質(zhì)量分布相近,peak3代表未被徹底酶解的聚合態(tài)支鏈淀粉。

    式中:S1為peak1的面積;S2為peak2的面積;S3為peak3的面積。

    圖1 普魯蘭酶酶解蠟質(zhì)玉米淀粉不同時(shí)間所得產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量分布Fig.1 Mw distribution of products from waxy corn starch debranched by pullulanase at different times

    1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn),采用Box-Behnken設(shè)計(jì),以彈簧糊精純度(Y)為響應(yīng)值,對(duì)溫度、pH、時(shí)間、酶用量進(jìn)行優(yōu)化,因素水平表見表1。

    1.2.6 數(shù)據(jù)處理 采用Design-Expert v8.0.6.1軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理、分析,采用Origin 8.5軟件進(jìn)行繪圖。

    表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平表Table 1 Coded values of the variables for the Box-Behnken design

    2 結(jié)果與討論

    2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

    2.1.1 溫度對(duì)彈簧糊精純度的影響 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn),設(shè)定pH為5.1,酶添加量400 U/g,酶解時(shí)間5 h,研究溫度分別為 45、50、55、60、65 ℃時(shí), 溫度對(duì)彈簧糊精純度的影響,結(jié)果如圖2所示。

    由圖2可知,當(dāng)溫度在45~55℃之間時(shí),彈簧糊精的純度隨著溫度的升高而增加。這主要是在溫度低于55℃時(shí),普魯蘭酶的活性隨著溫度的升高而逐漸增強(qiáng),反應(yīng)速度逐漸加快。當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí),普魯蘭酶部分失活,彈簧糊精的純度會(huì)有所下降。溫度在50~60℃之間時(shí),彈簧糊精的純度均較高;溫度為55℃時(shí),彈簧糊精的純度最高。所以50~60℃為普魯蘭酶作用的適宜溫度范圍,選則55℃作為最適反應(yīng)溫度。

    圖2 溫度對(duì)彈簧糊精純度的影響Fig.2 Effect of temperature on purity of spring dextrin

    2.1.2 pH對(duì)彈簧糊精純度的影響 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn),設(shè)定溫度為55℃,酶添加量400 U/g,酶解時(shí)間5 h,研究 pH 分別為 4.3、4.7、5.1、5.5、5.9 時(shí),pH 對(duì)彈簧糊精純度的影響,結(jié)果如圖3所示。

    由圖3可知,當(dāng)pH小于4.7時(shí),彈簧糊精的純度會(huì)隨著pH的提高而顯著增加;當(dāng)pH高于5.1時(shí),彈簧糊精的純度呈下降趨勢。這說明普魯蘭酶的活性會(huì)受到pH的顯著影響;普魯蘭酶在pH4.7~5.1時(shí),能快速水解α-(1→6)糖苷鍵,產(chǎn)生較多的彈簧糊精。在pH 5.1時(shí),彈簧糊精的純度最高,故選擇pH 5.1為最適反應(yīng)pH。

    圖3 pH對(duì)彈簧糊精純度的影響Fig.3 Effect of pH on the purity of spring dextrin

    2.1.3 酶用量對(duì)彈簧糊精純度的影響 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn),設(shè)定溫度為55℃,pH 5.1,酶解時(shí)間5 h,研究酶用量分別為 50、200、300、400、500、600 U/g 時(shí),酶用量對(duì)彈簧糊精純度的影響,結(jié)果如圖4所示。

    由圖4可知,當(dāng)酶用量小于300 U/g時(shí),隨著酶添加量的增加,彈簧糊精的純度逐漸增加,兩者呈線性關(guān)系。這說明底物未被酶所飽和,反應(yīng)速度主要取決于酶添加量。當(dāng)酶用量大于400 U/g時(shí),彈簧糊精的純度隨酶用量的增加而增長緩慢,從經(jīng)濟(jì)角度和彈簧糊精純度綜合考慮,作者選擇的最佳酶用量為400 U/g。

    圖4 酶用量對(duì)彈簧糊精純度的影響Fig.4 Effect of enzyme concentration on the purity of spring dextrin

    2.1.4 時(shí)間對(duì)彈簧糊精純度的影響 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn),設(shè)定溫度為55℃,pH 5.1,酶用量 400 U/g,研究酶解時(shí)間分別為 1、2、3、4、5、6 h 時(shí),酶解時(shí)間對(duì)彈簧糊精純度的影響,結(jié)果如圖5所示。

    由圖5可知,時(shí)間在5 h前,彈簧糊精的純度隨著時(shí)間的延長呈增加趨勢;當(dāng)時(shí)間繼續(xù)延長,彈簧糊精的純度增長緩慢,基本趨于穩(wěn)定。這是因?yàn)橹ф湹矸劬哂胁煌L度的支鏈,普魯蘭酶能較快地水解以α-(1→6)糖苷鍵連接的短鏈葡聚糖;隨著反應(yīng)時(shí)間的延長,普魯蘭酶只能以極慢的速度水解還未被水解的長鏈葡聚糖[12]。因此,作者選擇5 h為最佳酶解時(shí)間。

    圖5 時(shí)間對(duì)彈簧糊精純度的影響Fig.5 Effect of time on the purity of spring dextrin

    2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

    2.2.1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。

    表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

    續(xù)表2

    2.2.2 響應(yīng)面模型的選擇 由表3知,一階線性模型和二因素交互關(guān)系模型的失擬項(xiàng)P值均小于0.01,為極顯著,表示這兩個(gè)模型出現(xiàn)失誤的概率比較大,不適宜進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合;二階模型和三階模型的失擬項(xiàng)P值都大于0.05,但是三階模型的序變模型P值大于0.05,為不顯著,說明采用三階模型容易出現(xiàn)混雜的模型[13]。二階模型的R2=0.908 8,表示該模型能夠解釋90.88%的總變異,僅有9.12%的變異無法用該模型解釋[14]。綜上所述,采用二次模型進(jìn)行彈簧糊精制備預(yù)測是切實(shí)可行的。

    表3 模型擬合概要Table 3 Model fit summary

    2.2.3 二次模型建立與顯著性檢驗(yàn) 對(duì)表2結(jié)果進(jìn)行回歸分析,擬合的溫度(X1)、時(shí)間(X2)、酶用量(X3)、pH(X4)對(duì)彈簧糊精純度(Y)影響的二次回歸方程為:

    響應(yīng)值二次模型的方差分析及顯著性如表4所示。由表4可以看出,模型P<0.000 1,模型達(dá)到極顯著。失擬項(xiàng)P=0.050 5>0.05不顯著,因此該二次模型擬合度良好。

    其中一次項(xiàng)X1、X3、X4均顯著,X2不顯著; 二次項(xiàng)X1、X3、X4顯著,其他不顯著,交互項(xiàng)X1X4和X2X3顯著,所以得出影響彈簧糊精純度的因素依次:pH值>酶用量>溫度>時(shí)間。

    通過分析計(jì)算得到酶法制備彈簧糊精的最優(yōu)條件為:酶解pH 4.96,酶解溫度53.32℃,酶解時(shí)間6 h,酶用量420 U/g淀粉,彈簧糊精純度預(yù)測值為99.4%,經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn),在該實(shí)驗(yàn)條件下得到的彈簧糊精純度為99.2%。與預(yù)測值基本一致,說明該方程與實(shí)際情況相符合,擬合程度較好。

    表4 響應(yīng)值二次模型的方差分析Table 4 Analysis of variances for the developed quadratic regression model

    2.3 彈簧糊精鏈長分布情況

    圖6是采用HPSEC-MALLS-RI檢測系統(tǒng)所測出的彈簧糊精分子量信息,可知彈簧糊精的相對(duì)分子質(zhì)量分布為1 200~18 000,其中相對(duì)分子質(zhì)量小于 9 720(DP<60)的彈簧糊精占 95.5%。 HPAEC 可用來測定聚合度在6~60之間的葡聚糖[15],所以可采用HPAEC測定絕大部分彈簧糊精的聚合度分布,結(jié)果如圖7所示。根據(jù)聚合度差異,將彈簧糊精分為 4 組[16],即DP 6~12,13~24,25~36,37~60,它們所占的比例分別為24.40%,45.08%,19.60%,10.92%。

    圖6 彈簧糊精的相對(duì)分子質(zhì)量分布Fig.6 Molecular weight distribution of spring dextrin

    圖7 彈簧糊精的聚合度分布Fig.7 Degree of polymerization distribution of spring dextrin

    3 結(jié)語

    作者通過響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)對(duì)酶解工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,以期對(duì)蠟質(zhì)玉米淀粉脫支完全,實(shí)現(xiàn)彈簧糊精的較高得率。

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