稻米中赤霉酸的HPLC測(cè)定方法研究

胡銀川，李明元，劉秋鳳，王 濤，向 昕，徐瓏珀，鐘 洋，譚 欣

(1.四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院,四川 成都 610097; 2.西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,四川 成都 610039)

赤霉素是一類促進(jìn)植物和果實(shí)生長(zhǎng)的內(nèi)源激素，其中以赤霉酸(GA3)的應(yīng)用最為廣泛[1-2]。赤霉酸能促進(jìn)種子發(fā)芽、植物和果實(shí)生長(zhǎng)，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物的栽培[3-4]。水稻噴施赤霉酸可促進(jìn)水稻生長(zhǎng)，提高抽穗率和成穗率，使稻谷顆粒飽滿，提高水稻產(chǎn)量[5]。然而，長(zhǎng)時(shí)間攝入赤霉酸會(huì)影響人體生長(zhǎng)發(fā)育，危害人體健康[6]。歐美規(guī)定赤霉酸在農(nóng)產(chǎn)品中的最高殘留限量值為0.2 mg/kg，而我國(guó)尚未出臺(tái)相應(yīng)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)；因此，建立起高效、準(zhǔn)確的赤霉酸檢測(cè)方法對(duì)我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品出口以及人民健康具有極其重要的意義[7]。由于稻米基體復(fù)雜，且赤霉酸在稻米中的含量極低；因此，需要選擇一種精確、可靠的分析方法[8-9]來(lái)測(cè)定稻米中赤霉酸含量。赤霉酸的檢測(cè)方法主要有分光光度法、薄層色譜法、毛細(xì)管電泳法和氣相色譜法等[10-11]。由于分光光度法、薄層色譜法、毛細(xì)管電泳法達(dá)不到對(duì)赤霉酸的痕量測(cè)定的要求，且氣相色譜法前處理過(guò)程中的衍生較繁瑣；因此，本文采用高效液相色譜儀對(duì)稻米中赤霉酸進(jìn)行檢測(cè)[12]。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LC-20A高效液相色譜儀，日本島津公司；TB-214電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；TDL-40B離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；Milli-Q超純水儀，Millipore；KQ-100DE數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；SFG-02.400電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司；ZHWY-200D恒溫振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；ZN-200A粉碎機(jī)，長(zhǎng)沙市岳麓區(qū)中南制藥機(jī)械廠；RE-52B轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；pHS-3C酸度計(jì)，成都世紀(jì)方舟科技有限公司；GC-17真空泵，浙江黃巖求精真空泵廠；XW-80A型漩渦混合器，常州諾基儀器有限公司；Discovery C18色譜柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)，美國(guó)Supelco公司。

赤霉酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度大于99.9%)，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；乙酸乙酯、甲醇、石油醚、異丙醇均為色譜純，F(xiàn)isher Scientific公司；鹽酸為優(yōu)級(jí)純，成都科龍化工試劑廠；試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 樣品前處理

將稻米粉碎，稱取10 g稻米置于錐形瓶中，加入80%甲醇溶液50 mL，振蕩提取18 h，過(guò)濾樣品。向?yàn)V渣中加入80%甲醇溶液30 mL，超聲提取30 min，過(guò)濾樣品，合并2次濾液。移取20 mL濾液，分別用10 mL石油醚脫色2次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至5 mL，加入5 mL乙酸乙酯進(jìn)行萃取，漩渦混勻30 s，取上層液過(guò)無(wú)水硫酸鈉小柱，再用乙酸乙酯重復(fù)萃取3次，氮吹至近干，用2 mL甲醇定容，用0.45 μm有機(jī)濾頭過(guò)濾，上機(jī)分析。

1.3 色譜條件

流動(dòng)相：V甲醇∶V水(30 ∶70)；流動(dòng)相pH值為4.0；流速為1.0 mL/min;柱溫為40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm；進(jìn)樣量為10 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

對(duì)赤霉酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全波段掃描，掃描光譜圖見(jiàn)圖1。由圖1可知，赤霉酸在200、210、225和655 nm均有吸收峰。 225和655 nm吸收強(qiáng)度較低，200 nm時(shí)流動(dòng)相甲醇吸收強(qiáng)度會(huì)明顯增強(qiáng)，對(duì)檢測(cè)造成干擾，故選用210 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 赤霉酸掃描光譜圖

2.2 流動(dòng)相的選擇

在柱溫為35 ℃，流速為1.0 mL/min，流動(dòng)相pH值為4.0，進(jìn)樣量10 μL條件下，考察流動(dòng)相(V甲醇∶V水為30 ∶70、V甲醇∶V水為35 ∶65、V甲醇∶V水為40 ∶60)對(duì)分析的影響。當(dāng)V甲醇∶V水為30 ∶70時(shí)，峰形尖銳且峰寬小，故流動(dòng)相選擇V甲醇∶V水為30 ∶70。

2.3 流動(dòng)相流速的選擇

在柱溫35 ℃，流動(dòng)相V甲醇∶V水為30 ∶70，流動(dòng)相pH值為4.0，進(jìn)樣量10 μL條件下，考察流動(dòng)相流速(0.6、0.8、1.0 mL/min)對(duì)分析的影響。流動(dòng)相在1.0 mL/min時(shí)，峰形尖銳，保留時(shí)間短，故流動(dòng)相流速選擇1.0 mL/min。

2.4 柱溫的選擇

在流動(dòng)相V甲醇∶V水為30 ∶70，流速為1.0 mL/min，流動(dòng)相pH值為4.0，進(jìn)樣量10 μL條件下，考察柱溫(30、35、40 ℃)對(duì)分析的影響。當(dāng)柱溫為40 ℃時(shí)，赤霉酸的色譜峰分離度較好，出峰時(shí)間最短，縮短了分析時(shí)間，故柱溫選擇40 ℃。

2.5 流動(dòng)相pH值的選擇

在流動(dòng)相V甲醇∶V水為30 ∶70，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL條件下，考察流動(dòng)相pH值(3.0、4.0、5.0)對(duì)分析的影響。當(dāng)pH值為4.0時(shí)，峰形尖銳，分離度較好，故流動(dòng)相pH值選擇4.0。

2.6 線性關(guān)系與檢出限

取赤霉酸系列標(biāo)準(zhǔn)溶液(5、10、20、40、80、160、320 μg/mL)，按照上述色譜條件進(jìn)行分析，外標(biāo)法定量。在5 ～320 μg/mL的線性范圍內(nèi)，具有良好的線性關(guān)系(R2=0.999 96)。最低檢出限為2.0 μg/g (S/N=3)。圖2為200 μg/mL的赤霉酸標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖。圖3為稻米中陽(yáng)性樣品色譜圖。

2.7 精密度

稱取12份稻米樣品，進(jìn)行樣品前處理，每次進(jìn)樣10 μL，測(cè)定稻米中赤霉酸含量，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，12次測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.2%，表明本方法具有良好的精密度。

圖2 赤霉酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖 圖3 稻米中陽(yáng)性樣品色譜圖

表1 方法精密度(n=12)

2.8 回收率

本文采用加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)本方法的可靠性，對(duì)稻米樣品進(jìn)行了低、中、高3個(gè)不同水平添加回收實(shí)驗(yàn)，每一水平分別做6次平行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算平均回收率。稱取本底含量為6.46 μg/g的稻米樣品，進(jìn)行添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.0、15.0和30.0 μg/g的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)水平做6次平行實(shí)驗(yàn)，算出其平均回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，赤霉酸的回收率在91.7%～98.7%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.5%～2.9%之間，說(shuō)明本方法準(zhǔn)確可靠。

表2 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)

3 結(jié)論

本文建立的稻米中赤霉酸的HPLC測(cè)定方法為：稱取10.0 g粉碎的稻米置于錐形瓶中，加入80%甲醇溶液50 mL，振搖18 h，過(guò)濾樣品，向?yàn)V渣中加入80%甲醇溶液30 mL，超聲提取30 min，過(guò)濾樣品，合并2次濾液，移取20 mL濾液，分別用10 mL石油醚脫色2次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至5 mL，加入5 mL乙酸乙酯進(jìn)行萃取，漩渦混勻30 s，取上層液過(guò)無(wú)水硫酸鈉小柱，再用乙酸乙酯重復(fù)萃取3次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用2 mL甲醇復(fù)溶，用0.45 μm有機(jī)濾頭過(guò)濾，HPLC分析。結(jié)果表明：在5～320 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系R2=0.999 96，最低檢出限為2.0 μg/g；精密度好，在12次平行實(shí)驗(yàn)測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.2%；在5.0、15.0和30.0 μg/g添加水平下，赤霉酸的回收率在91.7%～98.7%之間。