植物組織培養(yǎng)中褐變的發(fā)生機(jī)制與防治方法

劉悅

摘 要 褐變是植物組織培養(yǎng)中的普遍存在的現(xiàn)象，已經(jīng)成為影響組織培養(yǎng)成功的重要因素，并且已成為組織培養(yǎng)中的一大難題。本文揭示了褐變的發(fā)生機(jī)制及控制機(jī)理、影響褐變的因素，并于此提出了防治褐變的措施，以期為解決褐變問(wèn)題提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 植物組織 褐變 機(jī)制 防治

中圖分類(lèi)號(hào)：Q943.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

褐變?cè)谥参锝M織培養(yǎng)過(guò)程中普遍存在，國(guó)內(nèi)學(xué)者普遍認(rèn)為褐變能否得到有效控制是植物組織培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵所在，并且證明了褐變度與總酚含量以及PPO活性之間的關(guān)系因品種而異。而國(guó)外學(xué)者M(jìn)ayer和Harel則注意到正常果實(shí)組織中雖然存在有酚類(lèi)物質(zhì)和PPO，卻并不發(fā)生褐變，指出果實(shí)中酚類(lèi)物質(zhì)和PPO在細(xì)胞中可能是區(qū)域化狀態(tài)分布。

1褐變的發(fā)生機(jī)制

關(guān)于褐變的發(fā)生機(jī)制，目前認(rèn)為褐變分為兩種：即酶促褐變和非酶促褐變。但諸多研究認(rèn)為引起褐變發(fā)生的主要是酶促褐變。醌類(lèi)化合物在酪氨酸酶的作用下與培養(yǎng)材料組織中的蛋白質(zhì)發(fā)生聚合，引起其他酶系統(tǒng)失活，導(dǎo)致代謝紊亂，生長(zhǎng)受阻。當(dāng)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化和破壞時(shí)，則為底物創(chuàng)造了與PPO接觸的條件，在氧存在的情況下使酚類(lèi)物質(zhì)氧化成醌，再進(jìn)行一系列的脫水、聚合反應(yīng)，最后形成黑褐色物質(zhì)，從而才引起褐變。

2影響褐變的因素

不同的材料、環(huán)境條件、因素或操作手段都會(huì)嚴(yán)重影響褐變發(fā)生的程度，不同的褐變程度也跟實(shí)驗(yàn)結(jié)果、研究目的息息相關(guān)。在外植物體材料的基因型與生理狀態(tài)確定的情況下，外植物體的種類(lèi)和大小、培養(yǎng)條件是影響褐變的主要因素。

2.1外植體的種類(lèi)和大小

一般認(rèn)為，木本植物比草本植物的外植體在培養(yǎng)中更易發(fā)生褐變。外植體小的材料，因?yàn)榍锌谒急壤^大而較易發(fā)生褐變。切口越大，酚類(lèi)被氧化的面積就越大，褐變現(xiàn)象越嚴(yán)重。

2.2培養(yǎng)條件

培養(yǎng)室的溫度控制在15℃～20℃，可有效地防止褐變的發(fā)生。高溫一方面不利于傷口的愈合，另一方面會(huì)增強(qiáng)多酚氧化酶的生物活性，從而加速氧化過(guò)程，使植物材料的褐變更為嚴(yán)重。其次，光照強(qiáng)度也能影響褐變的發(fā)生及褐化程度。在黑暗條件下外植體褐變嚴(yán)重，在光照條件下外植體褐變發(fā)生晚、程度輕，光照強(qiáng)度增加外植體褐變嚴(yán)重。

3防治褐變的方法

3.1選擇適宜的外植體和培養(yǎng)條件

取材時(shí)，需要注意除時(shí)間以及采光等外，還應(yīng)注意外植體的基因型及部位，選擇褐變程度較小的品種和部位作外植體。同時(shí)，適當(dāng)改變培養(yǎng)基的狀態(tài)、硬度、pH值、縮短轉(zhuǎn)接周期等方法也可減輕褐變的毒害。在一定范圍內(nèi)，瓊脂用量大，培養(yǎng)基硬度大。褐變率低。在水稻體細(xì)胞培養(yǎng)中，pH值為4.5～5.0時(shí)MS培養(yǎng)基可保持愈傷組織處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，其表面呈黃白色，而pH值為5.5 ～ 6.0時(shí)愈傷組織嚴(yán)重褐變。在外植體接種后1-2 d即轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基中或同一培養(yǎng)基的不同部位，可以防止酚類(lèi)物質(zhì)在傷口周?chē)e累過(guò)多，連續(xù)轉(zhuǎn)移幾次即可防止褐變。

3.2使用抗褐變劑和吸附劑

在組培時(shí)，在培養(yǎng)基中加入抗氧化劑、增效劑或使用抗氧化劑和增效劑對(duì)材料預(yù)處理，可抑制外植體的酶促褐變。在植物組培中用于抑制褐化常用的抗氧化劑有：抗壞血酸（Vitamin C）、硫代硫酸鈉（Na2S2O3）。此外還有檸檬酸、L-半胱氨酸（L-Cys）、谷胱甘肽、蕓香苷、二硫蘇糖醇等。VC和檸檬酸主要在早期起作用，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)作用逐漸消退，亞硫酸鈉在中后期作用較好，但對(duì)植物具有一定毒害作用，不宜單獨(dú)添加?？寡趸瘎?duì)外植體的培養(yǎng)會(huì)起到一定的副作用，培養(yǎng)基添加濃度不宜過(guò)高，一般在200mg/L以下，且多用于初期培養(yǎng)而不宜長(zhǎng)期培養(yǎng)，還原性抗氧化劑在使用時(shí)應(yīng)注意保持其還原性，一般最好過(guò)濾除菌使用，不要與培養(yǎng)基一起高溫滅菌。

綜上所述，褐變發(fā)生的機(jī)理在于醌類(lèi)化合物與蛋白質(zhì)發(fā)生聚合，引起其他酶系統(tǒng)失活，進(jìn)而導(dǎo)致植物生長(zhǎng)緩慢，甚至死亡。而外植體材料基因型與其外在形態(tài)，和材料、環(huán)境、操作等諸多因素影響其褐變的發(fā)生。因此，擇適宜的外植體和培養(yǎng)條件，或者使用抗褐變劑和吸附劑，可以遏制褐變的發(fā)生。如今，組培技術(shù)已大量應(yīng)用于花卉生產(chǎn)、農(nóng)作物栽培以及特種經(jīng)濟(jì)植物的幼苗、脫毒苗，使作物種植逐步走向集中控制化、規(guī)模化、自動(dòng)化。但在試驗(yàn)和生產(chǎn)過(guò)程中也經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)外植體褐變、污染和玻璃化現(xiàn)象這三大難。因而，如何防治褐變的產(chǎn)生和加強(qiáng)外植體褐變方面的研究顯得尤重要。

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