標準化測試種子發(fā)芽和根伸長毒性試驗的基質(zhì)應(yīng)用研究

鄧桂榮，梅承芳，陳燕玲，梁燕珍，許玉潔，梁秋，曾國驅(qū)

1. 廣東省微生物分析檢測中心, 生態(tài)毒理與環(huán)境安全實驗室, 廣州 510070 2. 廣東省微生物研究所, 廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點實驗室, 廣州 510070 3. 省部共建華南應(yīng)用微生物國家重點實驗室, 廣州 510070

隨著經(jīng)濟的高速發(fā)展，中國的化學(xué)品污染問題日益突出，已經(jīng)嚴重影響了人們的生活質(zhì)量，甚至直接危及了人們的身心健康。這已引起環(huán)境保護部門的密切關(guān)注和高度重視，并已采取各種手段，如陸續(xù)出臺嚴厲的政策加強污染防治。尤其在新化學(xué)物質(zhì)管理方面，注重源頭控制，要求在新化學(xué)物質(zhì)投入使用前，先對其開展環(huán)境危害性測試和風(fēng)險評估[1-2]。

由于陸生植物種子萌芽和根部伸長是植物生長周期中最為關(guān)鍵的階段，也是對周圍環(huán)境變化最為敏感的時期[3-4]，因此標準化測試種子發(fā)芽和根伸長毒性試驗成為環(huán)境危害性評估的要素之一[5]。通過研究化學(xué)物質(zhì)對高等植物的生態(tài)毒理效應(yīng)來監(jiān)測環(huán)境污染程度，從生態(tài)學(xué)的角度衡量環(huán)境健康，進而評價該化學(xué)物質(zhì)的排放可能對環(huán)境造成的不良影響[6]。針對該類試驗的基質(zhì)應(yīng)用已有較多研究[7-9]，但在標準化測試中能否使用其他物質(zhì)替代填充性惰性材料作為基質(zhì)，以及標準化測試指定的石英砂處理方法與其他處理方法相比，試驗結(jié)果是否存在差異，這些在國內(nèi)尚未見報道。

根據(jù)《國際種子檢驗規(guī)程》，用于種子發(fā)芽試驗的基質(zhì)可以是紙或砂，或者某種狀況的土壤[10]，而標準化測試要求使用填充性惰性材料，并用強酸清洗，然后使用全玻璃蒸餾水或去離子水漂洗至接近中性?？赡艹鲇诓Ａе楦街π?，不利于植物根部發(fā)育，使用玻璃珠進行研究較為少見，通常使用石英砂作為基質(zhì)，但石英砂顆粒小，用量大，用水漂洗難以去除強酸，可能需要專業(yè)裝備，成本較高。因此，在滿足該試驗質(zhì)量控制要求的前提下，研究能否使用替代性基質(zhì)，或者使用石英砂基質(zhì)時，能否采用其他更便捷的處理方法，以降低試驗成本、提高工作效率、減少污染，具有重要的實用價值。

本研究以標準化測試推薦的石英砂處理方法(酸洗法)[5]為基礎(chǔ)，新增干熱滅菌的石英砂處理方法，并引入在種子發(fā)芽試驗中已有較多研究的濾紙和吸水紙，以及廣泛應(yīng)用于種子質(zhì)量檢測的發(fā)芽紙作為基質(zhì)，選用8種植物種子進行試驗，考察5種基質(zhì)對種子發(fā)芽和根部伸長的影響，獲得基質(zhì)中可能存在的有毒物質(zhì)對各種子生長初期影響的數(shù)據(jù)。采用SPSS軟件比較酸洗石英砂與滅菌石英砂、濾紙、吸水紙、發(fā)芽紙之間種子發(fā)芽率和根長的差異情況，并以酸洗石英砂為基準，對使用滅菌石英砂替代酸洗石英砂以及將濾紙、吸水紙、發(fā)芽紙應(yīng)用于標準化測試的可行性進行評估，為測試機構(gòu)在工作實踐中優(yōu)化試驗條件提供理論依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試驗材料

1.1.1 試劑

硝酸(65.0%～68.0%)。該試劑為分析純，購自廣州化學(xué)試劑廠。

1.1.2 試驗種子

試驗種子番茄(新星101)、青瓜(粵秀3號)、生菜(精選意大利)、甘藍(甘秀333)、玉米(廣甜3號)為標準化測試推薦的受試植物，綠豆、西瓜(美寶王)、水稻(錢優(yōu)1號)為本地區(qū)重要的經(jīng)濟植物種類。其中，番茄、青瓜、生菜、玉米購自廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，綠豆、甘藍和西瓜、水稻分別來源于廣州祥勝種子有限公司、廣州大田園種子有限公司和浙江農(nóng)科種業(yè)有限公司。所有植物種子在使用前均用去離子水漂洗和浸泡1 h。試驗前未對種子消毒，試驗時挑選大小和飽滿度接近的種子。

1.1.3 基質(zhì)及其處理

石英砂購自廣東半島石英砂廠，粒徑為40～100 μm。濾紙、吸水紙和發(fā)芽紙分別來源于杭州沃華濾紙有限公司、維達紙業(yè)(中國)有限公司和德州市德城區(qū)昊誠儀器供應(yīng)站。各基質(zhì)處理方法詳見表1。

1.2 儀器設(shè)備

三按鍵電子數(shù)顯卡尺(SF2000，中國，桂林廣陸數(shù)字測控股份有限公司)，手提式pH測試儀(pH3210，德國，WTW)，電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(Agilent 1260-7700e型，美國，安捷倫科技有限公司)，離子色譜儀(ICS-1600型，美國，戴安公司)，總有機碳分析儀(VarioTOC，德國，Elementar Analysensysteme GmbH)，光照培養(yǎng)箱(PGX，中國，寧波萊?？萍加邢薰?。

1.3 試驗條件

將種子置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，試驗溫度為(25±1) ℃，完全黑暗。

1.4 方法

按照標準測試方法[5]要求操作。

1.4.1 試驗設(shè)計

石英砂試驗：按石英砂飽和含水量的60%(番茄、青瓜、生菜、甘藍、西瓜、水稻、玉米)或80%(綠豆)添加去離子水[11]，混合均勻后，將石英砂分裝至培養(yǎng)皿中，再將試驗種子置于石英砂表面，保持種子胚根末端和生長方向成一直線。輕壓入石英砂內(nèi)后，覆蓋少量石英砂，蓋好培養(yǎng)皿。

濾紙試驗：用干凈的鑷子將5層濾紙放入去離子水中，待吸足水分后取出，瀝掉多余水分，放入培養(yǎng)皿。將種子均勻地排在紙床上，粒與粒之間保持一定的距離。

吸水紙和發(fā)芽紙試驗方法參照濾紙試驗。每個培養(yǎng)皿或發(fā)芽盒放置4層吸水紙或5層發(fā)芽紙。

使用保鮮膜將所有培養(yǎng)皿和發(fā)芽盒密封，然后置于培養(yǎng)箱中，呈極小的角度便于根的直線生長。

以酸洗石英砂試驗為對照組，8種種子同時開展5種基質(zhì)試驗，每種種子在每種基質(zhì)中的試驗均設(shè)置3個平行，每個平行放置10粒種子，共30粒種子。

1.4.2 分析測定

試驗開始時測定酸洗石英砂和滅菌石英砂的pH值[12]，另將石英砂和去離子水等比例混合，超聲處理后離心、過濾，取濾液測試總有機碳(total organic carbon, TOC)、硝酸根離子(NO3-)以及鈉、鎂、鋁、鉀、鈣等元素含量。當對照組的種子發(fā)芽率達到65%以上且根的長度至少20 mm時結(jié)束試驗。從位于胚軸和根的轉(zhuǎn)換點到根尖末端測定各種子根長。以種子初生根長度達5 mm時作為發(fā)芽的標志。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用Microsoft Office Excel 2007統(tǒng)計各種子發(fā)芽率、根長，應(yīng)用SPSS Statistics 17.0軟件對各種子的發(fā)育情況進行方差分析。

2 結(jié)果與分析(Results and analysis)

2.1 不同基質(zhì)對種子發(fā)芽率的影響

由表2可知，對同一批次石英砂進行不同處理，各種子發(fā)芽率均未呈現(xiàn)出顯著性差異。而使用不同基質(zhì)時，各種子發(fā)芽率的響應(yīng)情況并不一致。有些種子受到基質(zhì)的影響不大，例如番茄、生菜、甘藍和水稻，在5種不同基質(zhì)中的發(fā)芽率與對照組相比均無統(tǒng)計學(xué)差異。但青瓜、綠豆和玉米在石英砂、濾紙上的發(fā)芽率和在吸水紙、發(fā)芽紙上的差別較大，對照組和吸水紙、發(fā)芽紙的發(fā)芽率有顯著差異(P>0.05)，并且前者的發(fā)芽效果較后者理想。尤其是西瓜，在砂基質(zhì)的發(fā)芽情況遠優(yōu)于紙基質(zhì)，當酸洗石英砂和滅菌石英砂上發(fā)芽率分別達83.3%和93.3%時，濾紙、吸水紙和發(fā)芽紙上的發(fā)芽率依次僅為53.3%、50.0%和53.3%，說明該西瓜品種對這3種基質(zhì)極不適應(yīng)。

表1 基質(zhì)處理方法Table 1 Preparation of substrate

周亞東等[13]指出，基質(zhì)不同，其養(yǎng)分含量及物理結(jié)構(gòu)均存在差異。就吸水性和保水性而言，石英砂比濾紙、吸水紙和發(fā)芽紙都要強，而且使用石英砂作為基質(zhì)時，將種子置入后，在上面覆蓋一層石英砂，使得種子在整個萌發(fā)過程中始終得到全方位的水分供給，而濾紙、吸水紙或發(fā)芽紙上的種子只能通過底部接觸面吸取水分。對于小顆粒種子，如番茄而言，盡管在紙基質(zhì)中僅通過部分表面吸取水分，但已足以使其正常發(fā)育，而對較大顆粒種子如西瓜就顯得明顯不足，可以認為不同種子的顆粒大小與正常發(fā)芽所需水分呈正相關(guān)關(guān)系。這也解釋了為何較大顆粒種子在石英砂中發(fā)芽率較高。另外，彭云霞[14]在研究發(fā)芽床對秦艽種子萌發(fā)特性的影響時，發(fā)現(xiàn)秦艽在紙發(fā)芽床下種子活力低于砂床，并認為可能是種子自身帶有病菌在濾紙上的感染率高于砂床，而砂床對種子有隔離作用，減少了種子發(fā)生次生感染的機會。該結(jié)論與本研究所得結(jié)果較為吻合。

表2 不同基質(zhì)對種子發(fā)芽率的影響Table 2 Effects of different substrate on seed germination

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差，數(shù)據(jù)后帶有“*”表示該結(jié)果與對照組(酸洗石英砂)存在顯著性差異(P=0.05)；下同。

Note: Data in the table are mean ± standard deviation. It means there is difference at a significance level of 0.05 between the seed germination rate in the substrate and that in control group (Acid-washed quartz sand) when the result is followed by “*”. Similarly hereinafter.

表3 不同基質(zhì)對種子根長的影響Table 3 Effects of different substrate on root elongation

有研究表明，發(fā)芽率受外界物質(zhì)影響較小，這是因為種子發(fā)芽過程主要受胚內(nèi)養(yǎng)分供應(yīng)，可以直接從胚乳中吸取營養(yǎng)。一般種子先通過吸水、膨脹，然后體內(nèi)酶原活化，并合成新酶，進而開始進入發(fā)芽狀態(tài)[15-16]。這個觀點在番茄、生菜、甘藍和水稻種子于5種不同基質(zhì)中的發(fā)芽結(jié)果以及青瓜、綠豆、西瓜和玉米種子于2種不同方法處理的石英砂上的試驗數(shù)據(jù)均得到印證。

2.2 不同基質(zhì)對種子根長的影響

不同基質(zhì)對種子根長的影響如表3所示。相對于種子發(fā)芽而言，根部發(fā)育過程比較復(fù)雜，干擾因素更多。

表3顯示，除玉米外，對照組種子的平均根長均低于滅菌石英砂，特別是番茄種子，當對照組平均根長為14.9 mm時，滅菌石英砂的平均根長已高達44.8 mm，后者是前者的3倍。結(jié)合2種石英砂的指標測試結(jié)果(表4)分析，2種不同處理石英砂的pH值接近中性且?guī)缀跸嗟龋粦?yīng)是制約種子根部生長的主要因素，推測是因為對照組的石英砂經(jīng)過硝酸清洗和去離子水漂洗后，TOC、NO3-和各元素含量明顯低于僅經(jīng)過干熱滅菌的石英砂造成的。值得一提的是，直至試驗結(jié)束，番茄種子在對照組中平均根長仍未達到20 mm的質(zhì)量控制要求，但試驗已經(jīng)進行至第9天，且該組部分種子出現(xiàn)了莖部萎焉甚至發(fā)黑腐爛等異常情況，不得不提前結(jié)束。究其原因，應(yīng)是酸洗石英砂中的營養(yǎng)成分含量不足以維持番茄根部正常發(fā)育所致，說明該番茄品種對基質(zhì)要求較高。

表4 石英砂指標分析結(jié)果Table 4 Index analysis results of quartz sand

類似于發(fā)芽率，種子顆粒體積也是根部發(fā)育的重要影響因素。若種子顆粒較大，對石英砂基質(zhì)的適應(yīng)性更強，在紙基質(zhì)上則出現(xiàn)根長縮短，例如綠豆、西瓜和玉米，尤其是西瓜的平均根長明顯偏低，主要因為紙基質(zhì)上的種子生長所需的水分嚴重不足。陳秋麗等[17]認為，在空氣充足的條件下，水分過少將影響種子的吸脹。相反，小顆粒種子在紙基質(zhì)上的活力更為旺盛，例如番茄和甘藍，在3種紙基質(zhì)上的根長遠超出對照組。此時水分不再是種子根系生長的主要制約因素，可能是因為種子萌發(fā)過程中，呼吸產(chǎn)生的有害物質(zhì)在紙基質(zhì)中容易清除，但在石英砂中難以及時排出，使種胚中毒，進而影響根部生長[18]。至于青瓜、生菜和水稻的根長與自身顆粒大小的相關(guān)度不大，可能具有偶然性，具體原因有待進一步探查。

種子在不同基質(zhì)上的根部生長和發(fā)芽結(jié)果的相關(guān)性未呈現(xiàn)規(guī)律性，推測是由于作用機制的差別。番茄、生菜、甘藍和水稻在5種基質(zhì)中的發(fā)芽情況類似，各基質(zhì)之間均無顯著性差異，但在根長方面，只有生菜和水稻得到一致的相關(guān)性，而對照組上番茄和甘藍的根長與其余4種基質(zhì)均存在較大差異。

綜上所述：

(1) 同一種子對不同基質(zhì)的適應(yīng)性存在一定差別。種子在不同基質(zhì)中萌芽受外界環(huán)境條件影響較小，但根部發(fā)育則容易受到多種因素制約。

(2) 開展標準化測試種子發(fā)芽和根伸長毒性試驗時，生菜和水稻試驗基質(zhì)可使用酸洗石英砂、滅菌石英砂、濾紙、吸水紙和發(fā)芽紙中任何一種；綠豆、甘藍和西瓜的理想試驗基質(zhì)為標準推薦的酸洗石英砂；青瓜除了和玉米一樣可使用干熱滅菌法替代酸洗法處理石英砂外，還可使用濾紙作為基質(zhì)，但應(yīng)慎用吸水紙和發(fā)芽紙。

(3) 影響種子發(fā)芽和根伸長毒性試驗結(jié)果的因素較多，如基質(zhì)(這里指石英砂)來源、有機質(zhì)含量、所使用的種子及其品種。若使用的石英砂處理方法不同，甚至使用標準推薦以外的基質(zhì)，并采用未經(jīng)驗證的植物種子及其品種進行試驗時，同一化學(xué)品的毒性結(jié)果可能存在較大差異，甚至得到截然相反的結(jié)果，影響結(jié)論的可靠性。由于我國開展化學(xué)品種子發(fā)芽和根伸長毒性試驗的時間較短，基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)相對缺乏，應(yīng)在獲得更多種子及若干品種在不同基質(zhì)上的發(fā)芽率和根長數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上開展進一步比較和研究，為推動國內(nèi)測試條件的規(guī)范化和標準化提供更多的科學(xué)依據(jù)，以確保測試結(jié)果的科學(xué)性，進而保證環(huán)境保護部門最終實現(xiàn)目標化學(xué)品在生態(tài)系統(tǒng)中潛在風(fēng)險的有效控制。

致謝：感謝廣東省微生物研究所李恩澤老師在文章英文摘要修改中給予的幫助。