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    3種不同功效醫(yī)藥品活性成分對發(fā)光菌的毒性作用

    2018-09-17 09:53:48方政董玉瑛趙晶晶鄒學(xué)軍
    生態(tài)毒理學(xué)報 2018年4期
    關(guān)鍵詞:三氯布洛芬阿奇

    方政,董玉瑛,趙晶晶,鄒學(xué)軍

    大連民族大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院,大連 116605

    近些年,隨著不同水源中陸續(xù)檢測出醫(yī)藥品活性成分相關(guān)的微量有機(jī)污染物,其引發(fā)的對人類生存及生態(tài)環(huán)境風(fēng)險問題已受到國內(nèi)外環(huán)境學(xué)者及社會大眾的廣泛關(guān)注[1-2]。布洛芬作為苯丙酸類新一代非甾體類消炎鎮(zhèn)痛藥物的典型代表,由于毒性低、療效好及副作用小而得到世界衛(wèi)生組織、美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)唯一共同推薦的兒童退燒藥得到廣泛應(yīng)用[3-5];阿奇霉素屬半合成的十五元環(huán)內(nèi)酯類抗生素,因其引起不良反應(yīng)的發(fā)生率小,受性良好,所以在治療人類和動物感染方面具有較一般抗生素類更好的療效[6-8];而三氯生(TCS)是一種常用的高效抗菌劑,醫(yī)藥品中常見為三氯生乳膏,因其對多種細(xì)菌、真菌具有殺滅和抑制作用,能夠作為醫(yī)藥品與個人護(hù)理品的殺菌、防腐劑,進(jìn)而在環(huán)境中存在較為普遍[9]。這些常見醫(yī)藥中存在的活性成分釋放到環(huán)境中能夠?qū)θ梭w健康及生態(tài)環(huán)境造成不同程度的威脅,同時這類污染物往往在全球范圍內(nèi)普遍存在,在環(huán)境中具有較高的穩(wěn)定性,難以降解且易在生態(tài)系統(tǒng)中富集[10-11],對環(huán)境中包括人類在內(nèi)的各類生物產(chǎn)生的危害不容忽視。

    當(dāng)環(huán)境通過自凈能力卻不能完全去除殘留在環(huán)境中的新型污染物,如抗生素等藥品活性成分時,還可能出現(xiàn)環(huán)境中的耐藥菌株大量增加的生態(tài)現(xiàn)象,增大了耐藥菌對人與其他生物感染的風(fēng)險?,F(xiàn)實生活中,以抗生素為代表的常見醫(yī)藥品往往都以混合物的形式存在[12],本研究中選擇的3種常見醫(yī)藥品在生活中作為解熱鎮(zhèn)痛類藥品、抗感染類藥品及殺菌類藥品使用,在生活中,如人類及動物遇到發(fā)熱及敏感細(xì)菌急性皮炎等情況時會相互搭配使用。方淑霞等[13]的研究表明,環(huán)境中抗生素等醫(yī)藥品混合物間總表現(xiàn)出與單一化合物不同的毒性作用?,F(xiàn)階段已有關(guān)于這3種醫(yī)藥品混合物對環(huán)境影響方面的研究,武小燕[14]在關(guān)于布洛芬、三氯生對黃顙魚酶及抗氧化酶系的毒性效應(yīng)研究中得到結(jié)論,混合暴露的結(jié)果與布洛芬和三氯生單獨對黃顙魚進(jìn)行暴露的結(jié)果不同。李義剛[15]在三氯生、布洛芬和氯化鎘對羊角月牙藻的毒性效應(yīng)研究中,對布洛芬和三氯生對羊角月牙藻的毒性進(jìn)行了分析,結(jié)果表明,三氯生對羊角月牙藻屬于高毒物質(zhì),布洛芬對羊角月牙藻體內(nèi)抗氧化酶系中CAT和MDA也有較大影響,氯化鎘和三氯生對羊角月牙藻聯(lián)合毒性表現(xiàn)為拮抗作用,氯化鎘和布洛芬對羊角月牙藻聯(lián)合毒性表現(xiàn)為協(xié)同作用。李義剛[15]的研究中并未對三氯生和布洛芬的聯(lián)合作用進(jìn)行分析。關(guān)于布洛芬、阿奇霉素和三氯生這3種藥品在環(huán)境中的聯(lián)合毒性作用研究目前還比較少見,因此,全面和及時了解這3種常見醫(yī)藥品混合物在環(huán)境中生態(tài)毒性效應(yīng)已迫在眉睫。本實驗結(jié)合發(fā)光菌具有快速、靈敏、操作簡單、應(yīng)用范圍廣泛等優(yōu)點,將其作為受試生物,研究布洛芬、阿奇霉素和三氯生3種醫(yī)藥品在環(huán)境中的單一及聯(lián)合作用,為評價該類新型污染物對環(huán)境及生物的影響提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

    1 材料與方法 (Materials and methods)

    1.1 實驗儀器

    恒溫振蕩器;恒溫培養(yǎng)箱;恒溫磁力攪拌器;高壓蒸氣滅菌鍋;潔凈工作臺;BS214D型電子天平;DXY22型生物毒性測試儀;量程不同的精密移液器等。

    1.2 試劑材料

    1.2.1 主要試劑

    布洛芬緩釋膠囊和阿奇霉素分散片購于長春海外制藥集團(tuán)有限公司和東北制藥集團(tuán)沈陽第一制藥有限公司,采用校正后的有效成分含量進(jìn)行配制。三氯生和氯化鈉等試劑均為分析純。

    1.2.2 菌種的培養(yǎng)

    發(fā)光菌凍干粉制劑的復(fù)蘇:無菌條件下,取已滅菌的3% NaCl溶液1 mL加入于明亮發(fā)光桿菌(Photobacterium phosphoreum)的凍干粉制劑中,均勻混合,常溫下放置2 min后,明亮發(fā)光菌即為復(fù)蘇。

    斜面菌種的培養(yǎng):明亮發(fā)光菌復(fù)蘇完成后,立刻將已復(fù)蘇的明亮發(fā)光菌用已滅菌的接種棒轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基中,20 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h后轉(zhuǎn)接第二代,并將第二代置于20 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h后,繼續(xù)轉(zhuǎn)接第三代,并于20 ℃下培養(yǎng)24 h后放置于冰箱中備用保存,以上操作均需在無菌條件下進(jìn)行。

    搖瓶菌液的培養(yǎng):將上述制得的明亮發(fā)光菌第三代斜面菌菌種轉(zhuǎn)接到含有100 mL培養(yǎng)液的250 mL錐形瓶中,于20 ℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期備用。

    工作菌液的制備:吸取一定量的搖瓶菌液于3% NaCl溶液中,充分?jǐn)嚢瑁l(fā)光強(qiáng)度控制在300~900為宜。

    1.3 急性毒性EC50的測定

    發(fā)光細(xì)菌急性毒性測試經(jīng)預(yù)試驗、單一毒性分析和聯(lián)合毒性分析等步驟實施。

    1.3.1 預(yù)實驗

    對選定的試劑設(shè)置濃度梯度進(jìn)行試驗,觀察15 min時待測化合物對明亮發(fā)光菌的發(fā)光抑制率,并確定適宜的毒性實驗暴露濃度范圍。

    1.3.2 單一毒性EC50的測定

    基于預(yù)實驗的基礎(chǔ),進(jìn)行單一實驗,將待測化合物用3% NaCl溶液稀釋配制為13個對數(shù)等間距分布的濃度,吸取不同梯度的樣品溶液2 mL于具塞磨口比色管中,以2 mL 3%NaCl 溶液作空白對照,再將0.5 mL 的工作菌液加入測試管中,加塞上下振蕩均勻,去塞,精確計時暴露15 min時測定發(fā)光強(qiáng)度。每組濃度梯度做3個平行樣,確保毒性分析結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)偏差低于10%。

    1.3.3 聯(lián)合毒性EC50的測定

    根據(jù)單一毒性測試的實驗結(jié)果,繪制毒性作用的效應(yīng)-劑量曲線,以獲得3種醫(yī)藥品對發(fā)光菌的單一毒性EC50;并將待測物布洛芬、阿奇霉素、三氯生根據(jù)單一毒性測得的EC40、EC45、EC50、EC55、EC60,按等毒性比例配制二元及多元混合體系,以3%NaCl為空白對照,每組濃度設(shè)置3個平行,確保3組平行實驗的標(biāo)準(zhǔn)偏差低于10%,測定二元及三元混合體系醫(yī)藥品對發(fā)光菌的聯(lián)合毒性作用的EC50。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    由于3種醫(yī)藥品濃度與對應(yīng)的發(fā)光抑制率在EC50附近呈良好的線性分布關(guān)系,進(jìn)而采用Excel繪圖,測得樣品溶液的發(fā)光強(qiáng)度與空白對照的發(fā)光強(qiáng)度之比即為抑制率,其表達(dá)式為:

    以抑制率對濃度作圖,求得抑制率為50%時的化合物溶液濃度,即為EC50?;衔餄舛群退劳雎手g的相關(guān)系數(shù)r,經(jīng)顯著水平檢驗,置信區(qū)間范圍大于90%。

    1.5 聯(lián)合毒性評價方法

    多元混合體系下的污染物對生物體的聯(lián)合毒性作用類型包括獨立作用、協(xié)同作用、相加作用和拮抗作用4種,本實驗應(yīng)用相加指數(shù)法(AI)、毒性單位法(TU)、混合毒性指數(shù)法(MTI)3種評價方法對3種醫(yī)藥品二元及三元混合體系的作用類型進(jìn)行定量判別和分析[16],聯(lián)合毒性作用類型評價標(biāo)準(zhǔn)見表1。

    2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

    2.1 單一毒性作用測試分析

    3種醫(yī)藥品對發(fā)光菌均呈現(xiàn)出不同程度的抑制作用,其對發(fā)光菌的半數(shù)效應(yīng)濃度(EC50)分別為:36.5×10-5、30.26×10-5和0.0155×10-5mol·L-1;其毒性強(qiáng)弱作用為:三氯生>阿奇霉素>布洛芬,即三氯生的毒性作用最強(qiáng)。圖1為3種醫(yī)藥品的分子結(jié)構(gòu)式,順序依次為布洛芬、阿奇霉素、三氯生。從結(jié)構(gòu)圖中可以看出,3種醫(yī)藥品的取代基為-OH、-Cl。翟麗華[17]選取17個部分取代苯化合物,研究其對發(fā)光菌的急性毒性,得取代基對發(fā)光菌的毒性貢獻(xiàn)大小順序為:-NO2>-Cl>-CH3>-NH2>-OH。翟麗華[17]的實驗結(jié)論對本研究結(jié)果具有借鑒意義。因此推斷3種不同醫(yī)藥品對發(fā)光菌的抑制效應(yīng)的差異,是由于不同取代基影響作用效應(yīng)程度不同導(dǎo)致的。對于這種結(jié)論仍需進(jìn)一步對分子相互作用機(jī)制進(jìn)行深入研究。

    圖1 3種醫(yī)藥品結(jié)構(gòu)式Fig. 1 The structure of three kinds of pharmaceuticals

    表1 不同評價指數(shù)的聯(lián)合作用類型判斷標(biāo)準(zhǔn)Table 1 The joint toxicity types and standards of different evaluating methods

    2.2 二元混合體系的聯(lián)合毒性評價

    綜合分析二元混合體系對發(fā)光菌的聯(lián)合毒性作用(見表3),我們可以看出,等毒性比例混合時,3種醫(yī)藥品二元聯(lián)合毒性的EC50值明顯大于單一毒性的EC50,表明二元混合體系的毒性低于單一毒性作用。同時,由于阿奇霉素+布洛芬,三氯生+布洛芬,三氯生+阿奇霉素這3組二元混合體系的M均大于M0,AI和MTI均小于0,因此這3組混合體系的作用類型表現(xiàn)為拮抗作用。由于AI越接近于0,其作用類型越趨于相加作用,而MTI越接近于0,其作用類型越趨于獨立作用,因此根據(jù)3組二元混合體系的AI及MTI的不同,可判斷其拮抗作用強(qiáng)弱的差異,進(jìn)而判定3種醫(yī)藥品二元混合體系對發(fā)光菌的作用強(qiáng)度為:三氯生+阿奇霉素>三氯生+布洛芬>阿奇霉素+布洛芬。

    2.3 三元混合體系的聯(lián)合毒性評價

    由于二元混合體系聯(lián)合毒性表現(xiàn)為拮抗作用,因此猜測3種醫(yī)藥品分子間的相互作用可導(dǎo)致體系聯(lián)合毒性降低,多個二元拮抗體系累加,各分子間相互作用增強(qiáng)可導(dǎo)致多元混合體系繼續(xù)呈現(xiàn)拮抗作用。實驗結(jié)果得出三元混合體系聯(lián)合毒性評價參數(shù)和作用類型見表4,等毒性比例混合的三元混合體系的聯(lián)合毒性EC50明顯大于二元和單一毒性作用的EC50值,表明三元混合體系的毒性更弱。由于等毒性比三元混合體系的M均大于M0,AI小于0,MTI小于0,因此三元混合體系的聯(lián)合作用類型為拮抗作用。本實驗獲得聯(lián)合毒性類型為拮抗作用,與前人研究結(jié)果相一致。叢永平等[18]研究發(fā)現(xiàn)四環(huán)素類抗生素和氯霉素類抗生素對發(fā)光菌的聯(lián)合急性毒性也表現(xiàn)出拮抗作用。

    表2 3種醫(yī)藥品單獨作用時的EC50Table 2 EC50 values when three kinds of drugs act alone

    表3 二元混合體系的EC50值和聯(lián)合毒性評價參數(shù)及作用類型Table 3 EC50 values, and joint toxicity evaluation parameters and action types of binary mixtures

    表4 三元混合體系的EC50值和聯(lián)合毒性評價參數(shù)和作用類型Table 4 EC50 values, and joint toxicity evaluation parameters and action types of ternary mixtures

    2.4 毒性作用機(jī)制初步探討及其類型評價

    綜合分析二元、三元混合體系聯(lián)合毒性,均為拮抗效應(yīng),因此猜測3種醫(yī)藥品的活性成分能夠相互作用并導(dǎo)致聯(lián)合毒性降低,各活性成分間相互作用增強(qiáng)導(dǎo)致多元混合體系呈現(xiàn)拮抗。而我們的實驗結(jié)果也與假設(shè)相符,任皓等[19]對鹽酸吉他霉素與金霉素、鹽霉素、黃霉素對發(fā)光細(xì)菌聯(lián)合毒性作用實驗的研究結(jié)果表明:在多個混合體中,拮抗作用表現(xiàn)較強(qiáng)的分子混合體系起主導(dǎo)作用。方章順等[20]研究典型抗生素與群體感應(yīng)抑制劑對費氏弧菌的三元慢性聯(lián)合毒性,證明了兩元混合體系的拮抗作用是三元體系拮抗作用的根本原因。由此可見,污染物在環(huán)境中經(jīng)過各途徑混合后,其相互作用可能導(dǎo)致毒性減弱。對于呈現(xiàn)的這種聯(lián)合作用效應(yīng),也可用發(fā)光菌發(fā)光原理進(jìn)行初步的聯(lián)合毒性分析,發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光機(jī)制基本都存在細(xì)菌熒光素酶(LE)、還原態(tài)黃素單核苷酸(FMNH2)、氧氣(O2)、長鏈脂肪醛(RCHO)的參與[19, 21-22]。其發(fā)光反應(yīng)方程式如下:

    在這一反應(yīng)過程中,黃素單核苷酸作為重要的輔酶,其氧化形式(FMN)與還原形式(FMNH2)之間的轉(zhuǎn)化在整個反應(yīng)過程中起到了傳遞氫的作用。實驗中3種常見醫(yī)藥品分子中均含有羥基(-OH)易與黃素單核苷酸結(jié)合形成氫鍵,阻礙發(fā)光反應(yīng)中FMNH2在氧化和還原作用之間氫的傳遞,干擾正常的發(fā)光反應(yīng)進(jìn)程,抑制發(fā)光菌發(fā)光。與此同時,由于阿奇霉素和布洛芬的分子中均含有N元素,N元素作為一種營養(yǎng)因子,在一定程度上能夠?qū)Πl(fā)光反應(yīng)過程起到促進(jìn)作用[21, 23-24],降低了其他化合物對發(fā)光強(qiáng)度的抑制效果,進(jìn)而呈現(xiàn)出了拮抗這種作用類型。如想更具體地對引起拮抗作用的原因進(jìn)行分析,還需進(jìn)一步對測試污染物聯(lián)合作用的機(jī)制以及發(fā)光菌的生理生化反應(yīng)等進(jìn)行深入探索。就目前的實驗結(jié)果而言,我們可以推斷出這3種醫(yī)藥品能夠?qū)λw環(huán)境及水生生物,例如微生物、浮游生物、藻類、魚類等有同樣的毒性作用,而藥物毒性在水生生物體內(nèi)富集,一旦進(jìn)入水源并通過食物鏈逐級遞增進(jìn)入人體,毒性在人體內(nèi)部將被放大,所以無論是現(xiàn)在或是未來,醫(yī)藥品這類新興污染物都將會對環(huán)境及生物造成很大的威脅,對于此類污染物的聯(lián)合作用研究迫在眉睫。

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