牛蒡根中有效成分的含量測(cè)定

竇培元 ，欒曉寧 ，朱連連 ，竇德強(qiáng) ，翟春濤

（1.山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西晉中030619； 2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧大連116600）

牛蒡根為菊科植物牛蒡（Arctium lappaL.）的根，在溫帶地區(qū)分布廣泛，常被作為降血糖、補(bǔ)腎壯陽(yáng)、抗衰老的保健蔬菜［1］。牛蒡根為我國(guó)傳統(tǒng)的藥食兩用中藥，《名醫(yī)別錄》稱(chēng)其“久服輕身耐老”；明朝李時(shí)珍《本草綱目》稱(chēng)其“剪苗淘為蔬，取根煮，曝為脯，云其益人”，又言其“通十二經(jīng)脈，除五臟惡氣”。牛蒡根風(fēng)靡日韓兩國(guó)，可以與人參相媲美，素有“東洋參”之美譽(yù)［2］。在我國(guó)牛蒡的種植，主要作為蔬菜出口日本和韓國(guó)，具有降脂和調(diào)節(jié)胃腸功能等作用［3］。近年來(lái)，牛蒡根在我國(guó)的食用消費(fèi)和工業(yè)生產(chǎn)開(kāi)發(fā)利用迅猛增加。本研究對(duì)牛蒡根中有效成分綠原酸、牛蒡苷及苷元、菊糖、蔗果四糖、果糖及葡萄糖等成分進(jìn)行含量測(cè)定，為牛蒡根資源的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試藥與儀器

1.1.1 試藥 牛蒡根（源升和金生物科技有限公司，批號(hào)：20161101，20161108，20171205）；綠原酸對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究所，批號(hào)：110753-201415）；牛蒡苷及牛蒡苷元對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究所，批號(hào)：110819-201611）；葡萄糖（西王藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20160822）；濃硫酸（沈陽(yáng)新興試劑廠，批號(hào)：20161023）；苯酚（上海滬宇生物科技有限公司，批號(hào)：20160213）；DNS試劑（北京雷根生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20160910）；蔗果四糖、果糖及葡萄糖（色譜純，日本W(wǎng)ako公司）；薄層層析硅膠（青島海洋化工有限公司，批號(hào)：20160923）；色譜甲醇（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20161002）；乙腈（色譜純，Oceanpak Alexative Chemical，批號(hào)：20161103）等。

1.1.2 儀器 UV2100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（尤尼柯上海儀器有限公司）；SHZ-DⅢ型循環(huán)水真空泵（鞏儀市予華儀器責(zé)任有限公司）；1H-P202C富士寶電磁爐（佛山市富士寶電器科技有限公司）；FD-EA-50冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；AE系列電子分析天平：FA-1004電子天平（上海精科天平廠）；DZF-6050真空干燥箱（上海一恒科技有限公司）；Agilent 1260型高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司），配置四元梯度泵、DAD檢測(cè)器；QE-100克粉碎機(jī)（武義縣屹立工具有限公司）；YB-IA真空恒溫干燥箱（天津市鑫洲科技有限公司）；KQ-250 DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 綠原酸含量測(cè)定 綠原酸的含量測(cè)定參照文獻(xiàn)［4］，具體方法如下。

1.2.1 .1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取綠原酸對(duì)照品5 mg，置于100 mL量瓶中，加60%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得含綠原酸0.05 mg/mL的對(duì)照品溶液，待用。

1.2.1 .2 供試品溶液的制備 精密稱(chēng)取過(guò)40目篩的干燥牛蒡根粉末0.5 g，置50 mL圓底燒瓶中，精密加入60%甲醇25 mL，加熱（74.2℃）回流提取60 min，取出，放至室溫后再稱(chēng)重，補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液用微孔濾膜過(guò)濾，即為供試品溶液。

1.2.1 .3 色譜條件 色譜柱：phenomenex C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.4%磷酸溶液（8∶92）；檢測(cè)波長(zhǎng) 327 nm；流速 1.0 mL/min；柱溫35℃。進(jìn)樣量10 μL。

1.2.1 .4 方法學(xué)考察 線性關(guān)系考察，線性關(guān)系良好；精密度良好；重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中RSD為1.1%，表明方法重復(fù)性良好；穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中RSD為1.4%，表明樣品在12 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性；綠原酸的平均回收率為99.9%，RSD為1.20%，說(shuō)明該方法可行。

1.2.1 .5 測(cè)定方法 精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定，即得。HPLC圖見(jiàn)圖1。

1.2.2 牛蒡苷及苷元含量測(cè)定 牛蒡苷及苷元含量測(cè)定參照中國(guó)藥典［5］，具體操作方法如下。

1.2.2 .1 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取干燥至恒重的牛蒡苷對(duì)照品5 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成每1 mL含牛蒡苷0.5 mg的溶液。精密稱(chēng)取干燥至恒重的牛蒡苷元對(duì)照品8.7 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含牛蒡苷元0.348 mg的溶液。

1.2.2 .2 供試液的制備 精密稱(chēng)取干燥的牛蒡根粉末（過(guò)40目篩）1 g，加30 mL甲醇超聲20 min，過(guò)濾濃縮后定容于25 mL容量瓶中，取適量用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾即可。

1.2.2 .3 薄層檢測(cè) 供試品（約20 μg）點(diǎn)于G60硅膠板（3 cm×6 cm），吹干后置于展層劑中使其上行展開(kāi)，展開(kāi)劑為 CHCl2-MeOH（15∶1）。展開(kāi)完畢后晾干放進(jìn)碘缸里用碘熏。

1.2.2 .4 色譜條件 色譜柱：phenomenex C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以甲醇-水（1∶1.1）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm；柱溫：30 ℃；流速：1 mL/min。

1.2.3 總糖含量測(cè)定 總糖的含量測(cè)定參照文獻(xiàn)［6］，具體方法如下。

1.2.3 .1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的配制 精密稱(chēng)取干燥至恒重的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖20 g于100 mL容量瓶中，加水至刻度，配成200 μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.3 .2 供試品溶液的配制 稱(chēng)取干燥的牛蒡根粉碎過(guò)40目篩1.00 g，料液比1∶40，提取溫度80℃和提取時(shí)間3 h，抽濾得到牛蒡提取液，濃縮并定容至25 mL容量瓶中。精密量取1 mL定容于50 mL容量瓶中，待測(cè)。

1.2.3 .3 方法學(xué)考察 線性關(guān)系考察，線性關(guān)系良好；精密度實(shí)驗(yàn)中RSD 1.30%，為精密度良好；重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中RSD為1.40%，表明方法重復(fù)性良好；穩(wěn)定性試驗(yàn)中RSD為2.60%，表明樣品在2 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性；平均回收率為100.0%，說(shuō)明該方法可行。

1.2.3 .4 測(cè)定方法 總糖的測(cè)定采用苯酚-硫酸法，根據(jù)對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線算出各樣品中還原糖的含量。

1.2.4 還原糖含量測(cè)定 還原糖的含量測(cè)定參照文獻(xiàn)［7］，具體方法如下。

1.2.4 .1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的配制 準(zhǔn)確稱(chēng)取105℃烘干的葡萄糖標(biāo)樣1 g于100 mL的容量瓶中，用去離子水定容至刻度，搖勻，得到10 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.4 .2 供試品溶液的配制 精密稱(chēng)取干燥的牛蒡根粉碎過(guò)40目篩1 g，料液比1∶40，提取溫度80℃和提取時(shí)間3 h，抽濾得到牛蒡提取液，濃縮并定容至25 mL容量瓶中。精密量取1 mL，定容于10 mL容量瓶中，待測(cè)。

1.2.4 .3 方法學(xué)考察 線性關(guān)系考察，線性關(guān)系良好；精密度試驗(yàn)中RSD 1.19%，為精密度良好；重復(fù)性試驗(yàn)中RSD為1.38%，表明方法重復(fù)性良好；穩(wěn)定性試驗(yàn)中RSD為1.12%，表明樣品在24 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性；平均回收率為99.9%，說(shuō)明此方法準(zhǔn)確可靠。

1.2.4 .4 測(cè)定方法 還原糖的測(cè)定采用3，5—二硝基水楊酸法，根據(jù)對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線算出各樣品中還原糖的含量。

1.2.5 菊糖含量測(cè)定 按“2.3”和“2.4”項(xiàng)下操作，菊糖含量=總糖含量-還原糖含量［8］。

1.2.6 蔗果四糖、果糖及葡萄糖含量測(cè)定 蔗果四糖、果糖及葡萄糖的含量測(cè)定參照文獻(xiàn)［9］，具體方法如下。

1.2.6 .1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 分別精密稱(chēng)定蔗果四糖對(duì)照品2 mg，置于2 mL容量瓶中，果糖對(duì)照品2 mg，置于2 mL容量瓶中，葡萄糖2 mg加蒸餾水至刻度線，搖勻，備用。

1.2.6 .2 樣品溶液的制備 精密取藥材粉末1.5 g，加乙酸乙酯50 mL，超聲提取30 min，過(guò)濾，殘?jiān)?0%甲醇50 mL，超聲提取30 min，離心取上清液備用。

1.2.6 .3 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX NH2柱（5 μm，4.6 mm×150 mm）；流動(dòng)相為乙腈-水（70∶30）；流速為1 mL/min；進(jìn)樣量5 μL；柱溫30℃。檢測(cè)器為蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD），漂移管溫度80℃，氮?dú)怏w積流量3.5 L/min。壓力3.5 bar，gain值為5。

1.2.6 .4 方法學(xué)考察 線性關(guān)系考察，蔗果四糖、果糖及葡萄糖線性關(guān)系良好；在蔗果四糖、果糖及葡萄糖精密度試驗(yàn)中RSD 1.0%、1.45%、0.93%，精密度良好；重復(fù)性試驗(yàn)中RSD為2.6%、1.15%、1.24%，表明方法重復(fù)性良好；穩(wěn)定性試驗(yàn)中RSD分別為1.1%、1.6%、1.66%，表明樣品在48 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性；蔗果四糖、果糖及葡萄糖的平均回收率分別為100.0%、95.35%、98.43%，說(shuō)明此方法準(zhǔn)確可靠。

1.2.6 .5 測(cè)定方法 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出樣品中蔗果四糖、果糖及葡萄糖的含量。

2 結(jié) 果

2.1 綠原酸含量

綠原酸測(cè)定的色譜圖如下，樣品中綠原酸峰與其他非被測(cè)成分峰能夠達(dá)到基線分離。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 供試品溶液色譜圖（A為綠原酸色譜峰）

外標(biāo)一點(diǎn)法測(cè)定牛蒡根三批藥材中綠原酸的含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 牛蒡根中綠原酸含量

2.2 牛蒡苷及苷元含量

2.2.1 薄層檢測(cè)結(jié)果 用標(biāo)準(zhǔn)品牛蒡苷和苷元作對(duì)比，見(jiàn)下圖2。從薄層板可以看出牛蒡根中不含有牛蒡苷和苷元。

圖2 樣品、牛蒡苷及苷元薄層色譜圖

2.2.2 色譜結(jié)果 HPLC測(cè)定結(jié)果表明牛蒡根中不含有牛蒡苷及苷元。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 HPLC法檢測(cè)結(jié)果

2.3 總糖、還原糖及菊糖含量

按照實(shí)驗(yàn)部分得出總糖和還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)總糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.006 4x+0.021，R2=1和還原糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.508 4x+0.017 1，R2=1計(jì)算牛蒡根藥材中總糖及還原糖含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 牛蒡根中總糖、還原糖及菊糖含量

2.4 蔗果四糖、果糖及葡萄糖含量

牛蒡根中蔗果四糖、果糖及葡萄糖測(cè)定的色譜圖見(jiàn)圖4。

圖4牛蒡根樣品測(cè)定色譜圖

按實(shí)驗(yàn)方法，得到蔗果四糖、果糖及葡萄糖回歸方程分別為 Y（logY）=1.601 8X（logX）+2.076 8，R2=1；Y（logY）=1.210 4X（logX）+2.258 6，R2=1；Y（logY）=0.675X（logX）+2.422 1，R2=1。根據(jù)蔗果四糖、果糖及葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中蔗果四糖、果糖及葡萄糖的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 牛蒡根中蔗果四糖含量

3 討論

牛蒡根在我國(guó)作為傳統(tǒng)中藥材已經(jīng)有很長(zhǎng)的使用時(shí)間，傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為牛蒡根具有利咽、解熱、利尿、抗衰老等作用。近些年，越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)研究表明牛蒡根中有效成分的含量較為豐富。本實(shí)驗(yàn)所測(cè)得的牛蒡根中不含有牛蒡苷和牛蒡苷元，前述文獻(xiàn)對(duì)牛蒡不同部位所含牛蒡苷和牛蒡苷元的含量進(jìn)行了考察，其中野生牛蒡根含有少量牛蒡苷，含量為0.39 mg/g，不含牛蒡苷元；栽培根中不含有牛蒡苷和牛蒡苷元［10］。近年來(lái)牛蒡根在我國(guó)的食用消費(fèi)迅猛增加，隨著栽培牛蒡根的出現(xiàn)，消費(fèi)者誤認(rèn)為牛蒡根中都含有牛蒡苷和牛蒡苷元。同時(shí)我們?cè)俅螌?duì)栽培牛蒡根中是否含有牛蒡苷和牛蒡苷元進(jìn)行驗(yàn)證，再次證明栽培根中不含有牛蒡苷和牛蒡苷元。牛蒡根中含有較高含量綠原酸、糖類(lèi)、氨基酸和蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

據(jù)報(bào)道每100 g鮮牛蒡根中含胡蘿卜素 390 mg、維生素 C 25 mg、鈣 242 mg、磷 61 mg、鐵 7.6 mg，并含有鋅、鎂、銅等微量元素。牛蒡根的胡蘿卜素含量比胡蘿卜高150倍，蛋白質(zhì)和鈣的含量為根莖類(lèi)之首［11］。牛蒡根中氨基酸以天門(mén)冬氨酸和精氨酸的含量較高，富含人體必需的各種氨基酸，具有抗衰老、抗炎、抗病毒、抗癌、擴(kuò)張血管、促進(jìn)血液循環(huán)等作用［12］。牛蒡根中還富含其他多種活性物質(zhì)［13-15］：主要有牛蒡醛、牛蒡酸、多炔物質(zhì)、愈創(chuàng)木內(nèi)酯類(lèi)化合物等。新鮮牛蒡根含有的多酚化合物主要包括綠原酸、異綠原酸、咖啡酸、一咖啡酰衍生物、二咖啡酰衍生物等，另外還含過(guò)氧化物酶；牛蒡根中多炔物質(zhì)具有抑制細(xì)菌和抗真菌作用。牛蒡根中還富含纖維素［16］。因此進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用牛蒡根具有廣泛的應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)得到牛蒡根中有效成分含量測(cè)定結(jié)果為牛蒡根的開(kāi)發(fā)利用提供了依據(jù)和參考，為牛蒡根的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定奠定基礎(chǔ)。

Determination of active ingredients in the roots of Arctiumlappa

Dou Peiyuan1，Luan Xiaoning2，Zhu Lianlian2，Dou Deqiang2，Zhai Chuntao1
（1.Shanxi University of Chinese Medicine，Jinzhong Shanxi 030619；2.Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Dalian Liaoning 116600）

AbstractObjective：The contents of chlorogenic acid，arctiin and arctigenin，total sugar，reducing sugar，inulin，nystose，fructoseand glucose were determined in the roots of Arctiumlappa.Methods：HPLC method was used to determine the chlorogenic acid with the chromatographic conditions：phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），eluting with mixture of acetonitrile-0.4%phosphoric acid solution（8∶92）with flow rate of 1 mL/min，detection wavelength was set at 327 nm，and column temperature was at 35 ℃.TLC and HPLC methods were used to detect arctiin and arctigenin，the charomatographic conditions：phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）column，methanol-water（1∶1.1）as mobile phase with flow rate of 1.0 mL/min，The detection wavelength was set at 280 nm，column temperature was at 30℃.The inulin content was measured with the difference between total carbohydrate and reducing sugars.Reducing sugar was determined by the 3，5-dinitrosalicylic acid（DNS）.The total carbohydrate was determined by H2SO4-minophenol method.HPLC method was used to determine the nystose，fructose and glucose，the chromatographic conditions：Agilent zorbax NH2column（5 μm，4.6×150 mm）；acetonitrile-water（70∶30）as the mobile phase with flow rate 1.0 mL/min with evaporative light scattering detector（ELSD），a drift tube temperature of 80 °C and a nitrogen volume flow rate of 3.5 L/min.Pressure 3.5bar，gain value of 5.Results：（1.40±0.36）mg/g of chlorogenic acid was determined in the root of Arctiumlappa and the arctiin and arctigenin could not be detected in the root of Arctiumlappa.Total sugar was determined to be（0.93±0.05）g/g；Reducing sugar was determined to be（0.73±0.07）g/g；Inulin was determined to be（199±21.40）mg/g，the content of nystose was（2.87±0.10）%，the content of fructose was（8.68±0.23）%；the glucose in the root of Arctiumlappa was（3.56±0.20）%.Conclusion：The root of Arctiumlappa contains higher levels of chlorogenic acid，total sugar，reducing sugar，inulin，Nystose，fructose and glucose，indicating that it possessed higher research value.

Key wordsroots of Arctiumlappa；chlorogenic acid；arctiin and arctigenin，total sugar；reducing sugar；inulin；nystose；fructose；glucose