葡萄籽原花青素單組分對(duì)PC12細(xì)胞的毒性研究

楊智超，宋麗娟，宋俊麗，姜維佳，王 青

（1.山西中醫(yī)藥大學(xué)國家中醫(yī)藥管理局益氣活血重點(diǎn)研究室，山西晉中030619； 2.山西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，山西太原030001）

關(guān)鍵字 葡萄籽原花青素；PC12；細(xì)胞毒性

葡萄籽提取物（Grape seed extract，GSE）是從葡萄籽中提取到的一類富含多酚類物質(zhì)的混合物，它的有效成分主要是原花青素。葡萄籽原花青素（Grape seed proanthocyanidin，GSP）是由不同數(shù)目的黃烷醇-兒茶素（Catechin，C）和表兒茶素（Epicatechin，EC）聚合而成，根據(jù)聚合度的不同，將二-四聚體稱為原花青素低聚體（oligomeric proanthocyanidin，OPCs），五聚體以上的稱為原花青素高聚體（polymeric proanthocyanidin，PPCs）?，F(xiàn)在已鑒定出3種單體，14種二聚體，11種三聚體［1］。在這些物質(zhì)當(dāng)中，含量最多的是單體、C、EC、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG）以及原花青素二聚體。

葡萄籽原花青素是活性最強(qiáng)的一類天然抗氧化劑，具有抗炎、抗過敏、清除自由基、預(yù)防心血管疾病和中樞退行性疾病、保護(hù)腎臟和神經(jīng)元等生理功能，因此在歐美等發(fā)達(dá)國家的醫(yī)藥、化妝品和保健品市場受到極大的好評(píng)。但是混合物在使用的過程中存在著靶點(diǎn)不明確、毒性不可控等缺點(diǎn)。因此，科研工作者致力于研究葡萄籽原花青素的單組分，發(fā)現(xiàn)C具有抗氧化、抗過敏、抗腫瘤、抗動(dòng)脈粥樣硬化和抗?jié)兊淖饔茫?］；EC可以抗菌、消炎、鎮(zhèn)咳；EGCG 能抗炎、抗氧化、抗過敏［3］；二聚體B1（Procyanidin B1，B1）和原花青素 B2（Procyanidin B2，B2）具有清除自由基、抗氧化、抗腫瘤、抗炎等作用，只是B2的生物活性更強(qiáng)［4-5］。而且這些化合物還能夠通過血腦屏障迅速到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，可以成為治療中樞神經(jīng)疾病的良藥，具有非常大的研究潛力［6-7］。但這些化合物的神經(jīng)毒性尚未被系統(tǒng)評(píng)價(jià)。大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞（Pheochromocytoma，PC12）具有神經(jīng)元細(xì)胞的特性，已廣泛應(yīng)用于神經(jīng)藥理、神經(jīng)毒理和神經(jīng)生化等領(lǐng)域的研究。本研究以PC12細(xì)胞為模型，初步探索了4種葡萄籽原花青素單體對(duì)PC12增殖的影響，為其在神經(jīng)領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

CO2培養(yǎng)箱（Thermo），全波長酶標(biāo)儀（Molecular Devices），小型垂直電泳槽（Bio-Rad），小型半干轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad），小型基礎(chǔ)通用電源（Bio-Rad），凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad），DMEM培養(yǎng)基（Gibco），大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞（PC12細(xì)胞，高分化型，武漢大學(xué)細(xì)胞庫），胎牛血清（HyClone），噻唑藍(lán)（碧云天），PVDF膜（milipore），BCA 試劑盒（康為世紀(jì)），RAPI細(xì)胞裂解液（上海生工），ECL（愛必信），小鼠Bcl-2抗體（Bioworld），小鼠 Bax抗體（Bioworld），辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（中杉金橋）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 MTT實(shí)驗(yàn) 用含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)高分化的PC12細(xì)胞后，取96孔培養(yǎng)板，用密度為5×105/mL的細(xì)胞鋪板，每孔100 μL，隔夜培養(yǎng)后，各孔分別加入濃度為 2.5 μg/mL，5 μg/mL，10 μg/mL，20 μg/mL，30 μg/mL，50 μg/mL 和100 μg/mL 的 C、EC、B1 和 B2，孵育 24 h、48 h 和72 h后，各孔加入5%的 MTT10 μL，37 ℃孵育4 h后，棄去培養(yǎng)液，每 孔 加 入 100μL DMSO溶解，在490 nm處檢測，測定其OD值?？瞻捉M加入等體積的含有10%胎牛血清的高糖DMEM。

1.2.2 Western blot 實(shí)驗(yàn) PC12細(xì)胞用100 μg/mL 的 C、EC、B1 和B2分別孵育72 h后，收集細(xì)胞，使用RAPI裂解液，裂解PC12細(xì)胞，提取總蛋白，采用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。蛋白上樣量為20 μg，12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉后，一抗4℃過夜，二抗孵育后用ECL法曝光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。單因素方差分析（One-Way ANOVA）后，用Dunnett′s test分析方法比較組間差異。兩組間比較采用T-test法。

2 結(jié)果

2.1 PC12 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

葡萄籽原花青素單聚體C和EC（30 μg/mL，50 μg/mL和100 μg/mL）可促進(jìn)PC12細(xì)胞增殖，且具有時(shí)間和濃度的依賴性。而100 μg/mL的B1和B2孵育PC12細(xì)胞24 h，對(duì)細(xì)胞增殖沒有影響，而隨著作用時(shí)間延長，有抑制細(xì)胞增殖的趨勢；30 μg/mL和50 μg/mL的B1和B2隨著作用時(shí)間延長，可促進(jìn)PC12細(xì)胞增殖。結(jié)果見圖1～圖4。

2.2 PC-12細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白的檢測

100 μg/mL葡萄籽原花青素 C、EC、B1和B2孵育PC12細(xì)胞72 h后，發(fā)現(xiàn)B2可顯著抑制抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表達(dá)，對(duì)促凋亡蛋白Bax沒有影響。

3 討 論

圖1 C對(duì)PC12細(xì)胞增殖的影響

圖2 EC對(duì)PC12細(xì)胞增殖的影響

圖3 B1對(duì)PC12細(xì)胞增殖的影響

圖4 B2對(duì)PC12細(xì)胞增殖的影響

圖5 C，EC，B1和B2對(duì)PC12細(xì)胞中Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響

本研究顯示，C和EC可促進(jìn)PC12細(xì)胞增殖，沒有細(xì)胞毒性；高濃度的B1和B2隨著作用時(shí)間延長，表現(xiàn)出了抑制細(xì)胞增殖的趨勢，提示長期大劑量服用B1和B2可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞毒性。為了進(jìn)一步證實(shí)MTT的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們考察了高濃度（100 μg/mL）的C、EC、B1 和 B2 對(duì)PC12細(xì)胞中抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)B2可以抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)。Bcl-2家族是重要的調(diào)控細(xì)胞凋亡基因，其中起主要作用的是抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax，且兩者之間的比例不同對(duì)細(xì)胞凋亡的影響也不同。Bcl-2/Bax升高則細(xì)胞趨于存活，反之則細(xì)胞趨于凋亡［8-9］。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們認(rèn)為B2使PC12細(xì)胞中Bcl-2/Bax降低，從而促使細(xì)胞趨于凋亡。

葡萄籽原花青素中二聚體（OPCs）生物活性最強(qiáng)，研究最為廣泛的OPCs，且他們的抗氧化活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其單體C和EC［10］。因此，認(rèn)為二聚體是更具潛力的抗氧化劑，加之其藥理活性優(yōu)異，使二聚體的單組分研究成為眾多研究者的首選課題［11］，但對(duì)其的毒性研究卻鮮有報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，二聚體B1和B2與單體C和EC相比，表現(xiàn)出了一定的細(xì)胞毒性，說明二聚體在生物活性增加的同時(shí)其毒性也有所增加。綜上所述，原花青素隨著聚合度的增加其細(xì)胞毒性也可能會(huì)增加，因此，在實(shí)際生產(chǎn)過程中應(yīng)盡量富集低聚合度的葡萄籽原花青素組分，去除高聚合度的原花青素，以達(dá)到增效減毒的目的。