彩虹竹芋轉(zhuǎn)基因體系的建立研究

丁云峰　馬艷麗　朱禎煜　韋金蘭

摘 要 觀賞竹芋是重要的彩葉草本植物，因葉上具有美麗的花紋和鮮艷的色彩而深受大家喜愛。但竹芋屬的花雄蕊退化，無種實形成，繁殖后代主要依賴分根繁殖，繁殖系數(shù)低、周期長，既不能滿足生產(chǎn)需求，也無法進行品種改良和優(yōu)良品種培育[1]?；诖?，利用植物生物技術(shù)，以竹芋莖、葉等營養(yǎng)器官為外植體，探討彩虹竹芋轉(zhuǎn)基因體系的建立方法。

關(guān)鍵詞 彩虹竹芋；轉(zhuǎn)基因；培養(yǎng)基

中圖分類號：S667.1 文獻標志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2018.15.019

1 試驗方法

1.1 外植體選擇

實驗前將從花卉基地購買的試驗材料，在實驗室進行前期植株滅菌處理。處理方法是用自來水將竹芋根部土壤沖洗干凈，然后用30%的多菌靈1 000倍液浸泡+吐溫20浸泡24 h后進行室溫下水培。大約15 d后在根莖處會長出新芽，切取新芽做外植體[2]。

1.2 外植體滅菌

將剪切下來的新芽在500倍多菌靈溶液中浸泡5 h，用自來水沖洗干凈。放在密封玻璃容器中，用高錳酸鉀∶甲醛=1∶2 熏蒸10 min。之后將材料放在超凈工作臺上，用75%的酒精浸泡10 s，0.1%的汞溶液浸泡10 min，并分別用無菌蒸餾水沖洗3～5次。

1.3 啟動培養(yǎng)

將配制好的MS培養(yǎng)基分裝于150 mL培養(yǎng)瓶中，用封口膜和耐高溫皮筋封口，放入高壓滅菌鍋內(nèi)121 ℃滅菌20 min。將滅菌后的外植體接種到加有6-BA、NAA的MS培養(yǎng)基上，10 d后觀察統(tǒng)計外植體脫分化（啟動）時間，不定芽分化率，選出適合竹芋再生體系建立的最佳外植體類型和培養(yǎng)基配方。每次處理20瓶，每瓶接種外植體3個，重復(fù)3次。

1.4 增殖培養(yǎng)

將分化不定芽的愈傷組織分切成0.5 cm×0.5 cm小塊和直接誘導(dǎo)出的不定芽接種于不同6-BA、NAA濃度配比的增殖培養(yǎng)基上，每次處理10瓶，每瓶3叢，3次重復(fù)。28 d后統(tǒng)計不定芽的增殖系數(shù)，篩選出最適增殖培養(yǎng)基。

1.5 培養(yǎng)條件

基本培養(yǎng)基采用MS培養(yǎng)基+蔗糖30 g·L-1+瓊脂

6.5 g·L-1，pH值5.8。因為竹芋科植物屬陰性植物，喜高溫、高濕、弱光的生長環(huán)境，所以在組織培養(yǎng)中，采用弱光照變溫培養(yǎng)，高溫27 ℃，光照1 500 lx培養(yǎng)14 h，低溫22 ℃暗培養(yǎng)10 h[3]。

愈傷組織誘導(dǎo)率=（形成愈傷組織的外植體數(shù)/接種的無污染外植體數(shù)）×100%；

不定芽分化率=（愈傷組織分化不定芽的外植體數(shù)/形成愈傷組織的外植體數(shù)）×100%

增殖系數(shù)=增殖外植體數(shù)/接種外植體數(shù)

生根率=（生根的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)量）×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基的再生體系效果

6-BA與NAA濃度對彩虹竹芋外植體啟動和愈傷組織誘導(dǎo)率有較大影響（見表1）。在相同濃度的6-BA中，NAA濃度越大，外植體脫分化時間越短；6-BA濃度對脫分化并無顯著影響，但當6-BA與NAA濃度同時增大時，外植體脫分化時間亦縮短。

NAA對愈傷組織的形成具有明顯的促進作用，NAA濃度越大，愈傷組織誘導(dǎo)率越高，最高可達99.0%。但接種50 h后觀察，較高的NAA濃度雖然愈傷組織分化多，但愈傷組織生長過旺，抑制了不定芽分化，最適的6-BA與NAA濃度比是MS+6-BA 2 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1和MS+6-BA 3 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1。

2.2 不同培養(yǎng)基的不定芽分化率和增殖系數(shù)

6-BA濃度對彩虹竹芋外植體不定芽分化率和增殖系數(shù)有較大影響。不定芽分化率與6-BA濃度呈正相關(guān)，隨著6-BA濃度增加，不定芽分化率和增殖系數(shù)明顯增大，配方MS+6-BA 3 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1不定芽分化率最高可達93.5%，增殖系數(shù)29.9。但增殖系數(shù)過大，單株苗長勢較弱，因此，綜合來看配方MS+6-BA 2 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1、MS+6-BA 3 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1、MS+6-BA 3 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1更適于彩虹竹芋的增殖培養(yǎng)。

2.3 不同部位外植體再生效果

以3年生彩虹竹芋為例，發(fā)現(xiàn)花莖和莖尖生長點再生頻率最高，分別為83.2%和89%。但彩虹竹芋較少開花，所以，在母本較少的情況下常常不易獲得花莖外植體。用莖尖生長點做外植體可獲得脫毒苗，但滅菌時操作難度較大，成功率較低，需做大量試驗；用葉片和葉柄做外植體，脫分化時間長，脫分化率極低，愈傷組織誘導(dǎo)率僅為30%左右，且所需時間較長。所以，綜合衡量，在彩虹竹芋組培中，新葉芽具有取材方便、脫分化快、愈傷組織發(fā)生率高、不定芽分化和增殖系數(shù)較大的優(yōu)點，是組織培養(yǎng)較好的外植體。

3 試驗結(jié)論

彩虹竹芋試管苗根系非常幼嫩、脆性大，在從培養(yǎng)瓶取苗到移栽的過程中容易損傷根系，影響移栽成活率。因此，實驗中采取了瓶外生根的方法，即外植體不經(jīng)過生根培養(yǎng)基，直接將增殖后的外植體切下用生根粉2 000 mg·L-1速蘸處理后直接扦插于基質(zhì)中，生根率可達85%，生根所需時間大約20 d左右。

本試驗采用彩虹竹芋芽尖、花莖為外植體，以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度6-BA和NAA成功再生了彩虹竹芋植株。外植體在9種培養(yǎng)基上均可以誘導(dǎo)愈傷組織和不定芽。但綜合考慮，配方MS+6-BA 2 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1和MS+6-BA 3 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1再生效果更好，同時，MS+6-BA 3 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1也較適于彩虹竹芋的增殖培養(yǎng)。

參考文獻：

[1] 張平.彩虹竹芋的組織培養(yǎng)與快速繁殖技術(shù)初探[J].上海農(nóng)業(yè)科技，2017（6）：91，106.

[2] 張平.‘彩虹竹芋組培苗溫室煉苗[J].中國花卉園藝，2013（2）：24-25.

[3] 丁云峰，馬艷麗.培養(yǎng)基及6BA與蔗糖濃度對白樺莖葉去分化率的影響[J].長春大學(xué)學(xué)報，2005（4）：69-70.

（責任編輯：趙中正）