秋水仙素處理白掌組培苗的效應(yīng)與多倍體誘導(dǎo)

鄭云飛，徐維杰，廖飛雄

（1江西省九江市林業(yè)科學(xué)研究所 332001；2江西農(nóng)業(yè)大學(xué)園林與藝術(shù)學(xué)院；3華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院/廣東省森林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實驗室）

白掌是天南星科（Araceae）白鶴芋屬（Spathiphyllum）的一種多年生草本植物，又名白鶴芋、苞葉芋、匙葉芋。白掌叢生、短莖或無莖；葉長圓形或近披針形，有長尖，葉長 20～30cm、寬 6～8cm；基部圓形，葉柄細(xì)長，花梗特長，佛焰苞呈葉狀，大而顯著，高出葉叢，初開時潔白色，后轉(zhuǎn)為微綠色；花期較長，可達(dá)5～6周，通常春季或夏季開花[1,2]。由于花形酷似鶴翹首，色澤潔白無瑕，被人們視為“清白之花”[1]，葉寬大，又取名“一帆風(fēng)順”寓意事事順利，平平安安。然而，白掌抗病性較弱，影響其觀賞價值。因此，有必要充分開發(fā)、利用現(xiàn)有的資源進(jìn)行遺傳改良。通過組織培養(yǎng)與秋水仙素誘導(dǎo)相結(jié)合選育植物多倍體技術(shù)在國內(nèi)外被育種學(xué)家廣泛應(yīng)用。本試驗利用秋水仙素對白掌不同品種進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)，通過流式細(xì)胞儀技術(shù)加以鑒定。

1 試驗材料

1.1 植物材料

Spathiphyllum floribundum、Spathiphyllum‘Coddy color’、Spathiphyllum‘Parrish’、Spathiphyllum‘Bright’組培苗的莖尖。

材料均來自于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境園藝研究所觀賞植物中心組培室。

1.2 誘導(dǎo)劑

秋水仙素（colchicine），德國 Sinus公司進(jìn)口,純度為99.9%。

2 試驗方法

2.1 秋水仙素溶液的配置

取1g秋水仙素置于無菌玻璃瓶中，加100mL無菌蒸餾水，攪拌使其充分溶解，配制成濃度為1%的母液，將配置好的母液過濾滅菌后，用無菌蒸餾水稀釋配制成所需濃度的秋水仙素溶液，整個過程要求處于無菌條件下，配置好的溶液在4℃下避光保存。

2.2 秋水仙素處理不同品種

選取生長旺盛，體型較一致的Spathiphyllum‘Bright’、Spathiphyllumfloribundum、Spathiphyllum‘Coddy color’、Spathiphyllum‘Parrish’組培苗，切取莖尖0.5cm左右，放入濃度為0.1%的秋水仙素的瓶中，每瓶裝有25mL溶液，90r/min旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)96h，處理后接種于培養(yǎng)基MS+30g/L蔗糖+7g/L卡拉膠+6-BA 1mg/L+NAA 0.1mg/L中，暗培養(yǎng)7d，轉(zhuǎn)到培養(yǎng)基MS+6-BA 4mg/L+LNAA 0.2mg，光照培養(yǎng)7d，記錄其萌芽數(shù)和存活數(shù)，繼續(xù)光照培養(yǎng)20d后，記錄其增殖數(shù)和存活數(shù)。繼代3次，繼代培養(yǎng)基為MS+6-BA 2mg/L+NAA 0.2mg/L，每瓶5個，每處理6瓶，不加秋水仙素為對照重復(fù)2次。

2.3 流式細(xì)胞儀鑒定

取實驗材料葉片，每個處理選取10株，蒸餾水洗凈表面培養(yǎng)基并濾紙擦干，放入在冰箱進(jìn)行預(yù)冷后的培養(yǎng)皿里，加入預(yù)冷的約裂解液500μL，刀片快速切碎，整個過程，材料須浸沒在解離液里，以便更好地游離細(xì)胞核,吸取培養(yǎng)皿內(nèi)的解離液，用260～560目的尼龍網(wǎng)過濾到離心管中，然后置于冰中，孵育5 min，加入PI染色液（約100μL），置于冰上避光染色12min左右，染色后移至上樣管，進(jìn)行上機(jī)檢測，每個樣品收集至少10000個顆粒。

2.4 數(shù)據(jù)處理

主要運(yùn)用EXCEL（WPS版）軟件和SPSS17.2軟件分析和整理。

3 結(jié)果與分析

經(jīng)過方差分析發(fā)現(xiàn)不同白掌品種間其萌芽率和增殖率都存在顯著性差異（P均為0.02＜0.05），而成活率并未存在顯著性差異（P=0.18＞0.05）。從表1中得出Spathiphyllum‘Bright’品種處理組與對照組的萌芽率都最高，分別為59%，77%；其中Spathiphyllum‘Coddy color’和Spathiphyllum‘Bright’2 個品種對照組萌芽率顯著高于處理組；Spathiphyllum floribundum與Spathiphyllum‘Parrish’’2品種略高于處理組，這有可能是秋水仙素對這4個品種莖尖的萌芽有抑制作用以及不同品種對秋水仙素的敏感度不同所導(dǎo)致的。不同白掌品種的莖尖經(jīng)過秋水仙素處理后，其成活率也有差異，其中Spathiphyllum floribundum和Spathiphyllum‘Parrish’2品種經(jīng)過秋水仙素處理后存活率相對于對照組來說有所降低，Spathiphyllum‘Parrish’’差異尤為顯著，存活率僅為53%，秋水仙素對Spathiphyllum‘Bright’和Spathiphyllum‘Coddy color’2 品種無明顯作用。不同白掌品種經(jīng)秋水仙素處理后，莖尖增殖率有所差異，然而，秋水仙素處理對4個品種的增殖率都明顯低于對照組。

表1 不同品種經(jīng)秋水仙素處理后的生長效果

表2 不同品種經(jīng)秋水仙素處理后的多倍體誘導(dǎo)效果

表2表明，同一秋水仙素濃度處理相同時間，不同品種的誘變率不同,其中Spathiphyllum.‘Bright’品種誘導(dǎo)率最高，達(dá) 67%，Spathiphyllum‘Coddy color’最低，為10%；Spathiphyllum floribundum和Spathiphyllum‘Parrish’品種誘變率分別為38%、30%；“Spathiphyllum floribundum”、Spathiphyllum‘Coddy color’、Spathiphyllum‘Bright’、Spathiphyllum‘Parrish’4 個品種分別獲得2株、1株、2株、3株純四倍體植株。

通過流式細(xì)胞儀對細(xì)胞DNA含量進(jìn)行測定和分析，結(jié)果表明染色體加倍的植株其DNA含量也相應(yīng)增加了1倍，四倍體植株峰值位置約為二倍體植株2倍；而在2個位置同時各出現(xiàn)1個峰即有2個峰的植株則為嵌合體植株，這表明該植株同時存在二倍體和四倍體2個倍性水品的細(xì)胞。然而，不同品種白掌測定時相對熒光強(qiáng)度值的位置有所不同（圖1-4），其中Spathiphyllu‘Bright’、Spathiphyllumfloribundum、Spathiphyllum‘Coddy color’、Spathiphyllum‘Parrish’品種作為對照的二倍體植株的相對熒光強(qiáng)度值分別僅在約 0.70、0.85、0.65、0.60位置出現(xiàn) 1個單峰（圖 B、C、D、E），四倍體植株分別僅在約 1.40、1.70、1.30、1.30 位置出現(xiàn)單峰（圖b、c、d、e）。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)各嵌合體的峰值比例也有所差異，有些植株四倍體的細(xì)胞數(shù)量多于二倍體細(xì)胞（圖Bb），而又有部分植株二倍體細(xì)胞較多（圖Cc），這有可能是因為植株本身細(xì)胞所占比例的差異性。

圖1 Spathiphyll um.‘Bright’品種二倍體、四倍體、嵌合體植株DNA相對含量分布圖

圖2 Spathiphyllum floribundum品種二倍體、四倍體植株DNA相對含量分布圖

圖3 Spathiphyllum‘Coddy color’品種二倍體、四倍體植株DNA相對含量分布圖

圖4 Spathiphyllum‘Parrish’品種二倍體、四倍體植株DNA相對含量分布圖

4 討論

人工誘導(dǎo)多倍體是育種研究中的一大突破，此技術(shù)不僅克服了自然發(fā)生多倍體時間漫長，變異頻率極低等困難，還大大解決了遠(yuǎn)緣雜交不孕等諸多瓶頸問題。其在作物育種上具有十分重要的意義，白掌在自然狀態(tài)下以二倍體或三倍體形式存在，采用傳統(tǒng)育種手段培育白掌新品種較費(fèi)時、費(fèi)力。目前，白掌的組織培養(yǎng)體系已經(jīng)較為成熟，大量研究者對白掌離體快繁技術(shù)的各個方面進(jìn)行了詳細(xì)的研究。朱根發(fā)、吳麗君、陳碧華、毛紅俊、陳漢鑫、謝云、林加根、王蓮輝等對綠巨人、神燈白掌、香水白掌、維克、皇后白掌、嬌小白掌、女神白掌的組織培養(yǎng)進(jìn)行了一系列研究[3-11]，建立了一套完整的白掌離體快繁體系。白掌主要以葉片、葉柄、腋芽、莖尖、肉穗花序、根尖為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，并都成功獲得了大量的植株[12-17]。以不同白掌品種為材料，用秋水仙素處理進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)，試驗結(jié)果表明，不同品種間其萌芽率和增殖率都存在極顯著性差異，多倍體誘導(dǎo)率也存在差異，這很有可能是因為品種的差異性對秋水仙素溶液處理產(chǎn)生的敏感度有所不同。目前,白掌品種較為單一，抗病性較弱，極大地影響了其觀賞價值和經(jīng)濟(jì)效益，對于新品種的選育已是勢在必行。