脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分泌組對(duì)顱腦創(chuàng)傷后大鼠神經(jīng)功能的影響

徐 超,李曉紅,王 晶,史洪建,王景景,程 軍,陳江龍,孫洪濤,涂 悅,張 賽

(1.武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院 顱腦創(chuàng)傷與神經(jīng)修復(fù)研究所，天津 300162；2.武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院 核磁共振科，天津 300162)

顱腦創(chuàng)傷(Traumatic brain injury，TBI)是現(xiàn)代社會(huì)造成意外死亡和殘疾的重要原因之一，其居高不下的死亡率和致殘率嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量，阻礙社會(huì)發(fā)展[1]。大量在創(chuàng)傷后得以幸存的TBI患者遺留認(rèn)知、情感障礙、社會(huì)心理缺失等遠(yuǎn)期后遺癥，對(duì)家庭和社會(huì)造成嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)[2]。TBI的原發(fā)機(jī)械創(chuàng)傷和繼發(fā)性損傷是造成TBI患者神經(jīng)功能受損，預(yù)后不良的主要原因。由于TBI導(dǎo)致大腦功能區(qū)神經(jīng)元丟失、神經(jīng)纖維脫髓鞘以及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)受損，使記憶、情感和自我認(rèn)知等高級(jí)神經(jīng)功能受到不可逆破壞[3]。此外，由于神經(jīng)細(xì)胞再生困難， TBI造成的高級(jí)神經(jīng)功能損傷難以得到有效恢復(fù)[4]。當(dāng)前臨床上主要應(yīng)用營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)、改善微循環(huán)，甚至是精神類藥品進(jìn)行干預(yù)，但其療效和安全性尚不肯定。

脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(Adipose-derived mesenchymal stem cells，ASCs)是當(dāng)前細(xì)胞生物治療研究的熱點(diǎn)，其在免疫調(diào)節(jié)、組織修復(fù)方面能夠發(fā)揮重要的作用，尤其是在神經(jīng)修復(fù)中具有的廣闊的應(yīng)用前景[5]。研究表明，由ASCs分泌的多種蛋白、多肽成分構(gòu)成的干細(xì)胞分泌組(Secretome，ST)是ASCs發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用、促進(jìn)神經(jīng)再生的主要效應(yīng)成分[6- 7]，能夠有效改善TBI后神經(jīng)功能損傷。由于ASCs對(duì)提取技術(shù)及存儲(chǔ)條件要求較高，以及干細(xì)胞潛在的致瘤效應(yīng)和倫理爭(zhēng)議，ASCs還沒有完全進(jìn)入臨床應(yīng)用。而ASC-ST易于從ASCs中提取，其劑量和成分易于標(biāo)準(zhǔn)化，便于臨床操作，更加符合臨床需求，是ASCs良好的替代產(chǎn)品。本研究通過(guò)向TBI大鼠靜脈注射ASC-ST，評(píng)估ASC-ST對(duì)TBI后大鼠神經(jīng)功能預(yù)后的影響并探討其潛在的作用機(jī)制，為推動(dòng)ASC-ST的臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 雄性SPF級(jí)SD大鼠45只，質(zhì)量為250～280 g，購(gòu)自于中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(軍)2012-0004，飼養(yǎng)于武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。按照隨機(jī)數(shù)字法將大鼠分為3組：假手術(shù)組(Sham組)，TBI+生理鹽水組(TBI組)，TBI后靜脈輸注ASC-ST組(TBI+ST組)，每組各15只。Sham組只打開骨窗，不進(jìn)行皮層打擊；TBI組在創(chuàng)傷后經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水；TBI+ST組在創(chuàng)傷后經(jīng)尾靜脈注射等量ASC-ST。

1.1.2 主要儀器和試劑 主要試劑：人源ASC-ST(由海軍總醫(yī)院兒科實(shí)驗(yàn)室從體外培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞中分離提純)；苯巴比妥鈉、多聚甲醛(索羅門試劑公司，天津)；兔抗小鼠Bcl-2抗體、Bax抗體(Proteintech公司，美國(guó))；兔抗小鼠NeuN抗體(Abcam公司，英國(guó))；山羊抗兔二抗 IgG (Life Technologies公司，美國(guó))；DAPI(Vector Laboratories，美國(guó))。主要儀器：MAGENTOM? Verio磁共振掃描儀(場(chǎng)強(qiáng)：3T，西門子，德國(guó))，倒置熒光顯微鏡(Leica CTR4000，德國(guó))；eCCI顱腦損傷儀(Model6.3,Custom Design & Fabrication,Inc，美國(guó))；震蕩切片機(jī)(Leica VT1000，德國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 TBI造模和分組干預(yù) 大鼠在術(shù)前適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，于術(shù)前12 h禁食、水，腹腔注射6%苯巴比妥鈉(50 mg/kg)進(jìn)行麻醉，俯臥位固定，置于立體定向儀上，術(shù)區(qū)備皮消毒后沿正中線切開頭皮，暴露右側(cè)頂骨，矢狀縫向右旁開1.5 mm，冠狀縫向后1.5～2.0 mm，磨一直徑約5 mm骨窗，暴露硬腦膜且保持硬腦膜完整，使之與經(jīng)酒精消毒的eCCI擊錘接觸。設(shè)定eCCI打擊參數(shù)為：深度2.0 mm，速度5 m/s，擊錘停留時(shí)間120 ms，建立重度TBI模型。打擊完成后，立即充分止血并用酒精消毒液消毒切口，無(wú)菌縫合皮膚切口。在TBI后2 h，經(jīng)尾靜脈向TBI+ST組大鼠注射0.2 mL ASC-ST和0.1 mL生理鹽水(沖管用)；向TBI組大鼠注射生理鹽水0.3 mL，此后按上述劑量每日經(jīng)尾靜脈注射ASC-ST或生理鹽水1次，連續(xù)注射7 d。

1.2.2 Morris水迷宮評(píng)估大鼠學(xué)習(xí)記憶能力 為了減少TBI造成的運(yùn)動(dòng)損傷對(duì)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)的影響，我們?cè)赥BI后7～10 d對(duì)大鼠進(jìn)行水迷宮訓(xùn)練：將大鼠從固定位置放入Morris水迷宮中，大鼠找到平臺(tái)并在平臺(tái)上停留超過(guò)2 s判為登島成功，將入水至登島成功的時(shí)間記作逃避潛伏期；監(jiān)測(cè)時(shí)間為60 s，若大鼠60 s內(nèi)未找到平臺(tái)則潛伏期記為60 s。每次訓(xùn)練完后，用吹風(fēng)機(jī)將大鼠毛發(fā)烘干。從TBI后11～14 d進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)，記錄大鼠尋找平臺(tái)的逃避潛伏期。并在TBI后第14天移走平臺(tái)，對(duì)大鼠進(jìn)行空間搜索實(shí)驗(yàn)，記錄各組大鼠在60 s內(nèi)穿越平臺(tái)所在位置次數(shù)及在目標(biāo)象限活動(dòng)的時(shí)間。使用Morris水迷宮自帶軟件記錄大鼠運(yùn)動(dòng)軌跡，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.3 核磁共振檢查(magnetic resonance imaging，MRI)評(píng)估大鼠神經(jīng)纖維束損傷 在TBI后7和14 d對(duì)TBI大鼠行頭顱MRI檢查。將大鼠麻醉后，俯臥位固定于8通道腕關(guān)節(jié)線圈中行T2加權(quán)成像(T2-weighted images，T2WI)和彌散張量成像(diffusion tensor imaging，DTI)掃描，采用西門子Syngo工作站進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和處理。T2WI用于確定腦組織解剖位置和損傷范圍，其基本參數(shù)：TR時(shí)間3 200 ms，TE時(shí)間83 ms，層厚1.5 mm，F(xiàn)OV 50.0×48 mm，平面分辨率256×230.4。DTI的主要參數(shù)為：TR時(shí)間3 100 ms,TE時(shí)間73 ms,層厚1.5 mm，F(xiàn)OV110 mm×45.87 mm，平面分辨率96×94.08。在DTI圖像上根據(jù)T2WI測(cè)量損傷周圍皮層(Ipsilateral cortex，IC)、胼胝體(Ipsilateral corpus callosum，ICc)、對(duì)側(cè)皮層(Contralateral cortex，CC)以及損傷對(duì)側(cè)胼胝體(Contralateral corpus callosum，CCc)的部分各項(xiàng)異性(fractional anisotropy，F(xiàn)A)值來(lái)評(píng)價(jià)神經(jīng)纖維的損傷情況。FA值由兩名經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的影像技師獨(dú)立測(cè)量得到。

1.2.4 蛋白免疫印記(Western-blotting)法檢測(cè)大鼠損傷皮層Bcl-2和Bax蛋白表達(dá) 在TBI后7、14 d脫頸法處死大鼠，斷頭取材，在冰上快速取出損傷側(cè)大腦，分離大腦皮層，經(jīng)預(yù)冷的4 ℃生理鹽水沖洗后加入細(xì)胞裂解液，經(jīng)組織勻漿儀破碎并過(guò)濾，用BCA法進(jìn)行蛋白定量，10% SDS-PAGE凝膠電泳，30 min后將蛋白轉(zhuǎn)至NC膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h，然后TBST漂洗3次，每次10 min。室溫下與Bcl-2(1∶1 000)、Bax(1∶2 000)、GAPDH(1∶1 000)一抗孵育1 h，TBST漂洗后將NC膜與二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h，最后用TBST漂洗NC膜3次，每次10 min。ECL顯色劑顯色，利用BIO-RAD 凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影。使用ScnImage軟件進(jìn)行灰度值測(cè)定，GAPDH為內(nèi)參蛋白，得出目的蛋白相對(duì)灰度值。

1.2.5 免疫熒光檢測(cè)腦組織中NeuN+神經(jīng)元數(shù)量 在TBI后14 d，腹腔注射苯巴比妥鈉麻醉大鼠，150 mL生理鹽水和150 mL 4%多聚甲醛心尖灌流，斷頭取材，將腦組織置于4%多聚甲醛溶液中浸泡2 h后用震蕩切片機(jī)切片，厚度為25 μm。選取腦組織切片置于0.5%Triton-100-X浸泡20 min，PBS漂洗3次，每次5 min；滴加2%的牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)100 μL封閉，37 ℃孵育15 min，用濾紙吸去BSA后，滴加NeuN(1∶100)，放入濕盒4 ℃冰箱過(guò)夜；次日PBS漂洗后二抗(1∶200)37 ℃溫箱避光孵育1 h，DAPI(1∶100)避光染核10 min，PBS漂洗后甘油封片置于倒置熒光顯微鏡下觀察。取損傷側(cè)皮質(zhì)作為觀察區(qū)域，在200倍視野下隨機(jī)讀取3個(gè)視野，計(jì)數(shù)NeuN+細(xì)胞個(gè)數(shù)，計(jì)算3個(gè)視野的平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 ASC-ST對(duì)TBI大鼠神經(jīng)功能的影響 在TBI后，TBI和TBI+ST組大鼠在水迷宮中的尋找平臺(tái)的潛伏期顯著長(zhǎng)于Sham組；與TBI組相比，TBI+ST組大鼠在TBI后14d找到平臺(tái)的潛伏期顯著縮短，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖1A)。在TBI后14 d取出平臺(tái)后，3組大鼠在60s內(nèi)經(jīng)過(guò)平臺(tái)所在位置的次數(shù)具有顯著差異。TBI組大鼠穿越平臺(tái)位置的次數(shù)顯著低于Sham組和TBI+ST組，而TBI+ST組與Sham組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05，見圖1B)。

A:3組大鼠的逃避潛伏期； B:3組大鼠的探索實(shí)驗(yàn)次數(shù)；與Sham組相比，**P<0.01；與TBI組相比，#P<0.05。

2.2 ASC-ST對(duì)TBI大鼠神經(jīng)纖維的影響 通過(guò)DTI掃描獲取TBI后大鼠腦組織中皮層和胼胝體的FA值來(lái)評(píng)價(jià)神經(jīng)纖維的損傷情況。在TBI后7d，TBI+ST組大鼠損傷周圍皮層的FA值顯著高于TBI組大鼠；而在TBI后14d，TBI+ST組大鼠損傷對(duì)側(cè)皮層、雙側(cè)胼胝體FA值顯著高于TBI組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表1)。

表1 TBI后7 d和14 d時(shí)TBI組和TBI+ST組大鼠大腦不同區(qū)域FA值

2.3 ASC-ST對(duì)TBI大鼠神經(jīng)細(xì)胞的影響 在TBI后7d，TBI和TBI+ST組大鼠損傷周圍皮層Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)均有所升高(P<0.05，見圖2、表2)。TBI+ST組大鼠損傷周圍腦組織中Bcl-2的含量顯著高于TBI組，而Bax的含量則低于TBI組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。在TBI后14 d，各組間Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)差異不明顯(P>0.05)；與TBI組相比，TBI+ST組大鼠損傷周圍腦組織中僅Bax的含量較低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在TBI后14 d，TBI組大鼠損傷周圍皮層中，NeuN+細(xì)胞的數(shù)量顯著低于TBI+ST組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(107.2±7.5 vs 156.5±7.25，n=10，t=-2.02，P=0.035 7，見圖3)。

圖2 TBI后7 d和14 d，3組大鼠損傷區(qū)域周圍Bcl-2和Bax蛋白水平

表2 TBI后不同時(shí)間3組大鼠損傷區(qū)域周圍Bcl-2和Bax蛋白水平

3 討論

生物細(xì)胞治療是當(dāng)前臨床前研究的熱點(diǎn)，MSCs和骨髓單個(gè)核細(xì)胞分別在缺血性卒中和TBI的臨床實(shí)驗(yàn)中取得了良好的治療效果[8-9]。但是由于生物治療在細(xì)胞來(lái)源和安全性方面尚存爭(zhēng)議，干細(xì)胞治療在臨床推廣還存在一定困難。近年來(lái)，對(duì)ASC-ST、干細(xì)胞外泌體和細(xì)胞外微囊泡(Extracellular micro-vesicles，EV)的研究為干細(xì)胞相關(guān)治療提供了新的思路。研究人員發(fā)現(xiàn)ASC-ST、外泌體和EV能夠發(fā)揮與MSCs相似的免疫調(diào)節(jié)作用和促進(jìn)組織再生的作用[10]。ASC-ST是干細(xì)胞分泌的多種細(xì)胞因子的集合，包含200多種重要的生長(zhǎng)因子和免疫介質(zhì)[11]。雖然ASC-ST的成分和劑量不能根據(jù)特定的組織微環(huán)境進(jìn)行調(diào)節(jié)，但是能夠在TBI后缺血、缺氧和有害物質(zhì)堆積的惡劣微環(huán)境中發(fā)揮功能[12]，是理想的CNS治療藥物。此外，盡管許多研究認(rèn)為在TBI早期血腦屏障(blood brain barrier，BBB)的破壞是MSCs經(jīng)由外周血循環(huán)進(jìn)入CNS的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[13]，但MSCs也可以通過(guò)釋放細(xì)胞因子進(jìn)行CNS損傷微環(huán)境的調(diào)節(jié)。本研究中采用靜脈注射來(lái)源于人脂肪干細(xì)胞的ASC-ST來(lái)探討ASC-ST對(duì)TBI大鼠高級(jí)神經(jīng)功能的保護(hù)作用。根據(jù)海軍總醫(yī)院兒科實(shí)驗(yàn)室的研究結(jié)果[14]，按照體重?fù)Q算每只大鼠注射ASC-ST的劑量為233.3～277.8 μL?？紤]到藥物容量對(duì)大鼠血流動(dòng)力學(xué)的影響，我們采用200 μL ASC-ST進(jìn)行靜脈注射。

TBI造成的高級(jí)神經(jīng)功能損傷是影響TBI患者遠(yuǎn)期預(yù)后的重要因素。TBI后，原發(fā)創(chuàng)傷導(dǎo)致?lián)p傷區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞壞死、聯(lián)絡(luò)纖維破壞和軸索損傷[15]；BBB破壞造成中樞和外周免疫成分聚集，激活繼發(fā)性炎癥反應(yīng)，大量氧自由基和興奮性毒素堆積，腦水腫加劇、顱內(nèi)壓(intracranial pressure，ICP)持續(xù)增高，腦組織灌注不足，進(jìn)一步導(dǎo)致神經(jīng)功能惡化[16]，形成惡性循環(huán)。當(dāng)前的治療手段主要著眼于TBI后的ICP和CPP管理，在維持生命體征的基礎(chǔ)上盡可能恢復(fù)腦組織灌注，減輕神經(jīng)功能破壞。但是缺少有效的手段來(lái)減輕神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)纖維損傷，促進(jìn)組織修復(fù)。在本研究中，通過(guò)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)估大鼠TBI后的高級(jí)神經(jīng)功能，發(fā)現(xiàn)在TBI后連續(xù)7 d靜脈輸注ASC-ST顯著改善了大鼠的認(rèn)知和空間記憶力，這與Nichols等[17]關(guān)于MSCs改善TBI后神經(jīng)功能損傷的研究結(jié)果相似，提示ASC-ST具有與MSCs相似的神經(jīng)功能保護(hù)作用，能夠顯著改善TBI后的高級(jí)神經(jīng)功能損害。這可能是由于ASCs主要依靠旁分泌效應(yīng)發(fā)揮多種調(diào)節(jié)作用[7]，ASC-ST的早期輸注能夠替代ASCs對(duì)神經(jīng)損傷起到保護(hù)作用。DTI結(jié)果提示TBI大鼠損傷周圍皮層、對(duì)側(cè)皮層、損傷側(cè)胼胝體和對(duì)側(cè)胼胝體FA值明顯下降，反映了神經(jīng)纖維走行紊亂，功能破壞。同時(shí)，該結(jié)果提示雖然從大體結(jié)構(gòu)上看，eCCI造成局部TBI模型，但從功能上看，eCCI造成了彌漫性的神經(jīng)纖維功能損害，形成神經(jīng)功能障礙。與TBI組大鼠相比，在TBI后7 d，TBI+ST組大鼠損傷周圍皮層FA值較高；而在TBI后14 d，TBI+ST組大鼠損傷對(duì)側(cè)皮層、雙側(cè)胼胝體的FA值顯著高于TBI組大鼠，提示早期的神經(jīng)纖維受損與原發(fā)損傷相關(guān)，而隨著繼發(fā)性損傷加重，彌漫性損傷也逐步加劇，神經(jīng)纖維損傷、退行性變也逐漸發(fā)生和加重。有研究報(bào)道ASCs能夠改善TBI后神經(jīng)退行性變，修復(fù)神經(jīng)功能[16]，提示在本研究中，ASC-ST作用位點(diǎn)較為廣泛，能夠通過(guò)不同的途徑保護(hù)TBI后的神經(jīng)功能。

研究結(jié)果同時(shí)顯示，TBI后7 d和14 d，與TBI組大鼠比較，經(jīng)ASC-ST干預(yù)的TBI大鼠損傷周圍皮層Bcl-2表達(dá)量增高而Bax表達(dá)量減低。Bcl-2/Bax是凋亡相關(guān)通路的核心基因，Bax促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生而Bcl-2抑制凋亡。在TBI后，神經(jīng)細(xì)胞在惡劣的環(huán)境和繼發(fā)性炎癥反應(yīng)中發(fā)生凋亡和抗凋亡的相互作用，Bcl-2基因表達(dá)對(duì)于減少神經(jīng)細(xì)胞壞死和凋亡具有重要作用[18]，是避免神經(jīng)功能受損的重要環(huán)節(jié)。免疫熒光結(jié)果顯示在TBI后14 d，TBI+ST組大鼠大腦皮層NeuN+神經(jīng)元明顯多于TBI組，這提示ASC-ST對(duì)Bax/Bcl-2平衡的干預(yù)取得了一定的效果。然而，由于神經(jīng)再生主要是由室管膜下區(qū)(subventricular zone，SVZ)和海馬齒狀回(dentate gyrus，DG)的神經(jīng)祖細(xì)胞(neural progenitor cells，NPCs)和神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)分化成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，神經(jīng)元數(shù)目的差異可能是凋亡和再生動(dòng)態(tài)變化的結(jié)果。研究表明，在TBI發(fā)生后的短時(shí)間內(nèi)，NSCs和NPCs就受到激活，開始增殖并向多種神經(jīng)細(xì)胞分化[19]。由于NeuN只在成熟神經(jīng)元中表達(dá)，我們認(rèn)為TBI組和TBI+ST組間神經(jīng)元之間的差異主要是由ASC-ST減少了TBI后的神經(jīng)元的凋亡和壞死造成的，新生的神經(jīng)元所占比例較小。同時(shí)，新生的神經(jīng)元能否形成纖維聯(lián)系、發(fā)揮完整的神經(jīng)功能尚不明確，需要更加深入的研究進(jìn)行探索。

綜合以上結(jié)果，我們認(rèn)為ASC-ST能夠通過(guò)減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡、維持神經(jīng)元數(shù)量及減輕神經(jīng)纖維損傷改善大鼠TBI后的神經(jīng)功能，為未來(lái)ASC-ST在治療TBI后的神經(jīng)功能損傷當(dāng)中的應(yīng)用提供了一定的依據(jù)。