白芨水提物對(duì)小鼠黑色素瘤B16F10細(xì)胞增殖與遷移的影響

令狐浪，李成龍，姚曉東

(遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院藥學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，貴州 遵義 563099)

惡性黑色素瘤(malignant melanoma，MM)簡(jiǎn)稱惡黑，是一種來(lái)源于黑色素細(xì)胞，且惡性程度極高的腫瘤，轉(zhuǎn)移早，預(yù)后差，死亡率高，晚期和有遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的患者平均生存期僅有6～10個(gè)月[1-2]。黑色素瘤增殖能力較強(qiáng)，微環(huán)境血供豐富，易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移，擴(kuò)散迅速，轉(zhuǎn)移部位多見(jiàn)于肺部和腦部[3-4]。白細(xì)胞介素-2、干擾素α-2b和達(dá)卡巴嗪等黑色素瘤輔助治療藥物毒副作用大，價(jià)格貴，并且臨床治療效果欠佳。因此，尋求有效的新型治療藥物變得至關(guān)重要。在近30年間，已上市的抗腫瘤藥物中有62.9%來(lái)自天然產(chǎn)物或其衍生物[5]。中藥作為我國(guó)特色資源寶庫(kù)，種類繁多，在藥物研發(fā)中具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。

白芨是一種珍稀名貴中藥材，為蘭科植物白芨(Bletillastriata)的干燥塊莖，具有收斂止血和消腫生肌的功效[6]，其野生品資源越來(lái)越少，主要產(chǎn)于貴州、四川和湖南等地，已被國(guó)家列為瀕危珍稀保護(hù)植物名錄[7]。據(jù)《本草綱目》記載：白芨別名連及草、白給等，其根白色，連及而生，故曰白芨[8]?！败浮焙汀凹啊蓖ㄓ谩，F(xiàn)代藥理研究表明，白芨具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌和促進(jìn)傷口愈合等作用。近年來(lái)，白芨在抗腫瘤方面時(shí)有報(bào)道[9-11]，但對(duì)黑色素瘤的相關(guān)研究卻鮮見(jiàn)報(bào)道。白芨的主要活性物質(zhì)為大量含有的多糖類成分，本研究對(duì)白芨進(jìn)行水提醇沉提取白芨粗多糖，同時(shí)保留有機(jī)小分子物質(zhì)部分，使用小鼠黑色素瘤B16F10細(xì)胞對(duì)其進(jìn)行體外抗腫瘤活性研究，以期能為白芨的后續(xù)研究和臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥材 白芨購(gòu)買于遵義市百姓人大藥房，經(jīng)遵義醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院生藥學(xué)教研室吳發(fā)明博士鑒定為蘭科植物白芨屬白芨的干燥塊莖。

1.2 細(xì)胞 小鼠黑色素瘤B16F10細(xì)胞由四川大學(xué)華西醫(yī)院生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。

1.3 主要試劑 胎牛血清、DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基、胰蛋白酶和青霉素/鏈霉素溶液購(gòu)買于美國(guó)Gibco公司；二甲基亞砜購(gòu)買于美國(guó)Sigma公司；PBS緩沖液粉末購(gòu)買于北京鼎國(guó)生物科技有限公司；CCK8試劑購(gòu)于江蘇碧云天生物科技有限公司；ELISA試劑盒購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司；無(wú)水乙醇、氯仿和正丁醇等均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.4 主要儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司,型號(hào):Heracell 240i)；倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司,型號(hào):IX73)；酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司,型號(hào):Spectra max plus 384)；超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司,型號(hào):SW-CJ-2FD)；離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司,型號(hào):TD5M)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠,型號(hào)：RE-2000A)。

1.5 主要方法

1.5.1 白芨水提物的制備 取白芨藥材粉末50 g，蒸餾水加熱提取3次后，合并提取液，減壓濃縮至粘稠，緩慢加入無(wú)水乙醇使體系乙醇終濃度達(dá)80%。4 ℃靜置過(guò)夜，離心，分別收集沉淀和上清液。沉淀減壓干燥即得白芨粗多糖，經(jīng)計(jì)算，1 g白芨藥材可提取粗多糖0.32 g，多糖提取率為32%。上清液減壓濃縮得其他物質(zhì)部分(主要為有機(jī)小分子物質(zhì))，4 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?。將白芨多糖和有機(jī)小分子物質(zhì)配制成較大濃度的母液濃度，臨用時(shí)使用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋至作用濃度。

1.5.2 CCK8測(cè)定細(xì)胞存活率 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的B16F10細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，分為空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，其中實(shí)驗(yàn)組分別給予不同濃度(10、20、40、80、160 μg/mL)的白芨多糖和有機(jī)小分子物質(zhì)。待細(xì)胞穩(wěn)定貼壁后，按分組情況作用48 h，各孔加入CCK8試劑20 μL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h后終止顯色，并于450 nm檢測(cè)波長(zhǎng)測(cè)定其吸光度值。

1.5.3 CCK8測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的B16F10細(xì)胞，以1 000個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，根據(jù)細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn)所測(cè)得的IC50值，選用20、40、80 μg/mL作為低、中和高濃度。待細(xì)胞生長(zhǎng)至貼壁后，分別給予不同濃度的白芨水提物進(jìn)行處理，培養(yǎng)1、2、3、4、5、6、7 d。于每天定時(shí)取出培養(yǎng)板，每孔加入20 μL CCK8溶液，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2 h后取出，酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)定各孔吸光度值，以各組吸光度值表示細(xì)胞增殖能力大小，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.5.4 顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài) 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的B16F10細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞穩(wěn)定貼壁后，使用20、40、80 μg/mL濃度的白芨水提物繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.5.5 細(xì)胞劃痕檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的B16F10細(xì)胞接種到6孔板中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，當(dāng)細(xì)胞以單細(xì)胞層鋪滿約80%～90%左右時(shí)，使用200 μL槍頭在每孔的中軸線做一劃痕。用PBS洗去劃落不貼壁的細(xì)胞后，在顯微鏡下拍照，測(cè)出0小時(shí)劃痕線的寬度。分別加入含20、40、80 μg/mL濃度提取物的無(wú)血清培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h后取出，拍照并檢測(cè)新的劃痕寬度，將劃痕寬度的差值作為遷移距離進(jìn)行比較。

1.5.6 ELISA檢測(cè)遷移相關(guān)蛋白的表達(dá)情況 收集空白對(duì)照組及20、40、80 μg/mL濃度提取物培養(yǎng)處理后的細(xì)胞上清液，每組6個(gè)復(fù)孔，1 500 rpm，離心5 min，按ELISA試劑盒要求測(cè)定基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的表達(dá)情況。使用試劑盒中的樣品稀釋液稀釋MMP-2和MMP-9標(biāo)準(zhǔn)品，將稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品和各組樣品上清液加入酶標(biāo)板中，加上封板膜，37 ℃反應(yīng)90 min；吸去板內(nèi)液體后，加入生物素抗體工作液，37 ℃反應(yīng)60 min；洗滌緩沖液洗滌3次，加入親和素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物工作液(ABC)，37 ℃反應(yīng)30 min；洗滌后加TMB顯色液于37 ℃反應(yīng)20 min，TMB終止液加入后，于450 nm測(cè)定吸光度值。

2 結(jié)果

2.1 白芨水提物對(duì)小鼠黑色素瘤B16F10細(xì)胞存活率的影響 使用CCK8法測(cè)定白芨水提物在濃度為10、20、40、80、160 μg/mL時(shí)，作用B16F10細(xì)胞48 h后對(duì)其存活力的影響。圖1中顯示，經(jīng)不同濃度的水提物作用后，B16F10細(xì)胞的存活率基本呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，并呈現(xiàn)濃度效應(yīng)關(guān)系。與對(duì)照組相比，多糖濃度為10 μg/mL時(shí)，對(duì)細(xì)胞存活存在微弱的促進(jìn)作用；當(dāng)濃度為20 μg/mL時(shí)，存活細(xì)胞下降至83.50%；隨著作用濃度升高，當(dāng)濃度達(dá)到40、80、160 μg/mL時(shí)，細(xì)胞的存活率分別為40.44%、29.42%和25.60%。此外，白芨水提物中的有機(jī)小分子物質(zhì)部分對(duì)B16F10細(xì)胞的存活率顯示出更好的抑制作用，當(dāng)作用濃度為160 μg/mL，B16F10細(xì)胞的存活率下降至18.57%。經(jīng)計(jì)算，多糖和有機(jī)小分子物質(zhì)作用B16F10細(xì)胞48 h的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為51.14、40.61 μg/mL?；诖?，本研究選用20、40、80 μg/mL作為低、中和高濃度進(jìn)一步研究白芨水提物對(duì)B16F10細(xì)胞增殖和遷移的影響。

*：vs對(duì)照組，P<0.05。

2.2 白芨水提物對(duì)小鼠黑色素瘤B16F10細(xì)胞增殖的影響 圖2顯示，在對(duì)照組中，隨著培養(yǎng)天數(shù)的延長(zhǎng)，測(cè)得的OD值呈升高趨勢(shì)，表示其孔中細(xì)胞數(shù)目在不斷增多，細(xì)胞生長(zhǎng)在持續(xù)進(jìn)行。在經(jīng)不同濃度的白芨水提物處理后，細(xì)胞的生長(zhǎng)受到了明顯抑制，其測(cè)定的OD值呈下降趨勢(shì)，作用時(shí)間越長(zhǎng)，生長(zhǎng)的細(xì)胞數(shù)目越少，提示白芨水提物在體外顯著抑制了小鼠黑色素瘤B16F10細(xì)胞的增殖作用。

A：多糖；B：有機(jī)小分子。

2.3 白芨水提物對(duì)小鼠黑色素瘤B16F10細(xì)胞形態(tài)的影響 使用倒置顯微鏡觀察白芨水提物作用B16F10后細(xì)胞形態(tài)的改變。如圖3所示，對(duì)照組細(xì)胞貼壁狀態(tài)良好，形態(tài)正常，為不規(guī)則的梭形，呈現(xiàn)特有的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。隨著白芨水提物作用濃度的增大，細(xì)胞數(shù)目逐漸減少；低濃度的白芨水提物組(20 μg/mL)，大部分細(xì)胞為長(zhǎng)梭形，仍然呈現(xiàn)樹(shù)突網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。而使用中、高濃度的白芨水提物進(jìn)行孵育后(40、80 μg/mL)，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，細(xì)胞松散，體積縮小，呈現(xiàn)固縮的圓形結(jié)構(gòu)，且細(xì)胞周圍變亮，細(xì)胞貼壁疏松，并有部分細(xì)胞漂浮。

圖3 白芨水提物對(duì)小鼠黑色素瘤B16F10細(xì)胞形態(tài)的影響(×100)

2.4 白芨水提物對(duì)小鼠黑色素瘤B16F10細(xì)胞遷移的影響 細(xì)胞劃痕法是測(cè)定腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)特性的方法之一，其借鑒體外細(xì)胞致傷愈合實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，在體外培養(yǎng)的單層細(xì)胞上，劃痕致傷，然后加入藥物觀察其抑制腫瘤細(xì)胞遷移的能力。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(見(jiàn)圖4)，相比對(duì)照組，在加入不同濃度的白芨水提物干預(yù)后，B16F10細(xì)胞遷移減少，并與濃度呈正相關(guān)。細(xì)胞在劃痕損傷0 h未有明顯差異，培養(yǎng)48 h后，對(duì)照組劃痕面內(nèi)細(xì)胞明顯增多。而白芨水提物處理后，除低濃度的白芨水提物組(20 μg/mL)有部分細(xì)胞發(fā)生遷移，中、高濃度的白芨水提物組(40 、80 μg/mL)邊緣較整齊，未見(jiàn)明顯細(xì)胞遷移。ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦顯示，相比對(duì)照組，在經(jīng)白芨水提物處理后，MMP-2和MMP-9的表達(dá)均發(fā)生下調(diào)，在低濃度的白芨水提物組(20 μg/mL)雖有下調(diào)，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)表1)，而中、高濃度的白芨水提物組(40、80 μg/mL)與對(duì)照組相比，下調(diào)具有顯著性差異(P<0.05，見(jiàn)表1)。細(xì)胞劃痕和ELISA結(jié)果提示白芨水提物可抑制B16F10細(xì)胞的遷移作用。

圖4 白芨水提物對(duì)小鼠黑色素瘤B16F10細(xì)胞遷移的影響(×100)

表1 白芨水提物對(duì)小鼠黑色素瘤B16F10細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

中藥治療癌癥具有多靶點(diǎn)、毒副作用小等特點(diǎn)，白芨作為我國(guó)傳統(tǒng)中藥，藥用歷史悠久，藥用價(jià)值高。Park等[9]從白芨中分離得到2個(gè)新的甾體皂苷化合物，并對(duì)四種腫瘤細(xì)胞A549，SK-OV-3，SK-MEL-2和HCT15均具有細(xì)胞毒性。蔣瑞彬等[10]發(fā)現(xiàn)白芨須根醇提物能夠抑制A549細(xì)胞的生長(zhǎng)，并可促進(jìn)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移。孫愛(ài)靜等[11]從白芨中分離得到5個(gè)化合物，其中一糖苷類化合物能夠誘導(dǎo)A549細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期。李浩宇等[12]發(fā)現(xiàn)白芨多糖對(duì)矽肺大鼠機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)均具有良好的調(diào)節(jié)作用。多糖作為白芨的主要藥效成分，不但能參與細(xì)胞生命代謝，在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)、損傷修復(fù)和抗腫瘤等方面都發(fā)揮一定作用[13]。

侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤細(xì)胞的一個(gè)重要特征，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的天然屏障?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一類重要的蛋白水解酶，可有效降解ECM及基膜，在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用[14]。MMP-2和MMP-9是MMPs中降解ECM的重要蛋白水解酶，其表達(dá)增加與腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移極為相關(guān)[15-17]。雖然白芨中多糖含量極高，是其主要藥效成分，但白芨中相對(duì)含量較低但活性較高的有機(jī)小分子組分是否也具有較好的抗腫瘤活性，且目前鮮見(jiàn)有關(guān)白芨在抗黑色素瘤方面的研究報(bào)道。因此，本研究對(duì)白芨進(jìn)行水提醇沉制備白芨多糖，同時(shí)保留有機(jī)小分子物質(zhì)部分，選用小鼠黑色素瘤B16F10細(xì)胞，研究其對(duì)B16F10細(xì)胞增殖與遷移的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，白芨水提物中的多糖和有機(jī)小分子物質(zhì)均可抑制B16F10細(xì)胞的增殖與遷移作用，并能下調(diào)MMP-2和MMP-9的表達(dá)，且與濃度呈正相關(guān)。此外，白芨多糖與其有機(jī)小分子組分是否對(duì)腫瘤治療具有協(xié)同效應(yīng)，以及有機(jī)小分子組分中是哪類物質(zhì)發(fā)揮作用，也值得進(jìn)一步研究與探討。