淫羊藿次苷Ⅱ通過下調(diào)ERK1/2-NF-κB信號通路抗野百合堿所致大鼠肺動脈重構(gòu)

李葉麗，吳紅丹，付 舒，吳雨婷，岳 云，楊丹莉

(遵義醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)藥理教育部重點實驗室暨特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實驗室，貴州 遵義 563099)

肺動脈重構(gòu)是肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞、中膜平滑肌細(xì)胞及外膜成纖維細(xì)胞的增殖與凋亡失衡所致，主要表現(xiàn)為肺動脈壁內(nèi)皮細(xì)胞減少、中膜血管平滑肌細(xì)胞增殖、外膜膠原和彈性蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)異常沉積，其中肺動脈平滑肌細(xì)胞的異常分化、增殖和遷移在肺動脈重構(gòu)中起重要作用[1-2]。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2,ERK1/2)是絲裂原活化蛋白激酶家族中的一個重要亞族，在調(diào)節(jié)細(xì)胞分化及增殖中起重要作用[3]。已有研究發(fā)現(xiàn)，ERK1/2的活化可引起肺動脈平滑肌細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致肺動脈重構(gòu)和右心重構(gòu)的發(fā)生[4]?；罨腅RK1/2通過級聯(lián)反應(yīng)作用于核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)，并激活NF-κB使其磷酸化，進而激活抑制性核因子κB激酶(inhibitor of nuclear factor kappa B kinase,IKK)，最終參與多種炎癥反應(yīng)的發(fā)生。研究表明，NF-κB信號通路可通過促進炎癥反應(yīng)的發(fā)生，引起肺血管收縮及血栓形成，誘發(fā)肺動脈重構(gòu)，最終導(dǎo)致肺動脈高壓的發(fā)生[5-8]。因此，通過抑制ERK1/2-NF-κB信號通路，減輕炎癥反應(yīng)是抑制肺動脈重構(gòu)的關(guān)鍵。

淫羊藿次苷Ⅱ(Icariside Ⅱ,ICSⅡ)是小檗科植物淫羊藿的主要活性成分之一，具有抗炎、抗氧化、抗癌等作用[9-11]。已有研究表明，ICS Ⅱ可抑制黑色素瘤細(xì)胞的增殖[10]，也可通過抑制炎癥反應(yīng)逆轉(zhuǎn)β淀粉樣蛋白引起的認(rèn)知功能障礙[11]。故本課題組推測ICSⅡ可能通過抑制肺動脈平滑肌細(xì)胞的增殖、減輕炎癥反應(yīng)，進而產(chǎn)生抗肺動脈重構(gòu)的作用。因此，本研究以野百合堿(monocrotaline,MCT)誘導(dǎo)的肺動脈重構(gòu)大鼠為研究對象，觀察ICSⅡ?qū)Ψ蝿用}重構(gòu)的作用，并初步探討其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠，體重200～220 g，清潔級，購自第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，許可證號：SCXK-(軍)2017-0011。

1.2 主要儀器設(shè)備 BX43+DP2b光學(xué)顯微鏡(奧林巴斯)；Leica RM2245輪轉(zhuǎn)式切片機(Leica公司)；TKY-TKA攤片烤片機(湖北泰康)；GZX-9070MBE電恒溫?zé)峁娘L(fēng)干燥機(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；Elix-15 MiNi QA 純水處理器(Millipo Trading 有限公司)。

1.3 主要試劑 淫羊藿次苷Ⅱ(≥98%)購自南京澤朗醫(yī)藥有限公司；野百合堿購自Sigma公司；DAB顯色試劑盒(ZLI-9018)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；免疫組化染色試劑盒(SP-0023)購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；兔抗p-NF-κB多克隆抗體(D155004)購自生工生物工程(上海)有限公司；兔抗PCNA多克隆抗體(D120014)購自生工生物工程(上海)有限公司；兔抗p-ERK1/2抗體(4370S)購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 實驗動物分組與造模 36只SD大鼠隨機分為對照組(Control)、ICS II單純給藥組(Control + ICSⅡ-H，16 mg/kg)、模型組(Model)、ICS II 低中高劑量組(ICS II-L、ICS II-M、ICS II-H，4、8、16 mg/kg)，每組6只。Control和Control + ICSⅡ-H組經(jīng)頸背部一次性皮下注射生理鹽水5 mL/kg，其余4組注射MCT 50 mg/kg誘導(dǎo)肺動脈重構(gòu)模型。ICSⅡ各給藥組于造模后當(dāng)天開始給藥至第28天結(jié)束(ig，qd)。對照組和模型組給予等量溶媒(ig，qd)。

1.4.2 H&E染色 取遠(yuǎn)離肺門處5 mm左右的肺組織，于4%甲醛溶液中固定48 h后，脫水、包埋、切片、進行H&E染色，光鏡下觀察肺小動脈形態(tài)學(xué)變化并拍照記錄。采用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析軟件測量肺小動脈中膜厚度，計算肺小動脈中膜相對厚度：中膜相對厚度/% =(2×中膜厚度)/外徑×100。每組分別取6只動物的石蠟包埋組織，每個組織進行連續(xù)切片，每隔10片取一片，每只動物共取5張切片進行H&E染色，分別測量每張切片中的5個肺小動脈，取其平均值。將對照組的中膜相對厚度設(shè)定為100，計算各組中膜相對厚度的相對值。

1.4.3 免疫組織化學(xué)法檢測肺小動脈PCNA、p-ERK1/2、p-NF-κB蛋白的表達(dá) 石蠟切片脫蠟，0.3% Triton X-100于37 ℃孵育15 min，PBS浸洗5 min × 3次；3% H2O2避光37 ℃孵育15 min，PBS浸洗5 min × 3次；抗原修復(fù)后滴加山羊血清于37 ℃孵育30 min；分別滴加一抗PCNA(1∶50)、p-ERK1/2(1∶50)、p-NF-κB(1∶50)于切片上并置于濕盒中4 ℃過夜；37 ℃復(fù)溫30 min，PBS浸洗5 min × 3次；滴加二抗，于37℃孵育30 min，PBS浸洗5 min × 3次；DAB顯色，鏡下控制顯色時間，自來水沖洗10 min；蘇木素復(fù)染數(shù)秒，鹽酸乙醇分化，自來水沖洗5 min；脫水、封片。每組隨機選取5只動物的石蠟包埋組織，每個組織進行連續(xù)切片，每隔10片取1片，每只動物共取5張切片進行免疫組織化學(xué)法染色，每張切片中分別拍取5個400倍視野下的肺小動脈，用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分別統(tǒng)計陽性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，求出陽性細(xì)胞百分比，即陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%，取其平均值。將對照組的陽性細(xì)胞百分比設(shè)定為100，計算各組陽性細(xì)胞百分比的相對值。

2 結(jié)果

2.1 ICSⅡ?qū)Υ笫蠓涡用}形態(tài)學(xué)的影響 H&E染色結(jié)果顯示，Control組和Control + ICSⅡ-H組肺小動脈中膜較薄、官腔較大。與Control組比較，Model組大鼠肺小動脈中膜及管壁明顯增厚、管腔變窄，血管周圍及肺間質(zhì)炎癥明顯；與Model組比較，ICSⅡ-M、ICSⅡ-H組肺小動脈中膜增厚及肺部炎癥情況均有所改善(見圖1)。

A：Control；B：Control+ICSⅡ-H；C：Model；D：ICSⅡ-L；E：ICSⅡ-M；F：ICSⅡ-H；G：中膜相對厚度。黑色箭頭所指為肺小動脈，紅色箭頭所指為炎癥細(xì)胞。#：vs Control，P<0.05；*：vs Model， P<0.05。

2.2 ICSⅡ?qū)Ψ涡用}PCNA蛋白表達(dá)的影響 PCNA表達(dá)于胞核，棕黃和(或)褐色為陽性表達(dá)。Control組和Control + ICSⅡ-H組肺小動脈平滑肌上PCNA的表達(dá)較少。與Control組比較，Model組肺小動脈平滑肌上PCNA表達(dá)明顯增多(P<0.05)；與Model組比較，ICSⅡ-M、ICSⅡ-H組PCNA表達(dá)減少(P<0.05，見圖2)。

A：Control；B：Control+ICSⅡ-H；C：Model；D：ICSⅡ-L；E：ICSⅡ-M；F：ICSⅡ-H；G：PCNA陽性細(xì)胞百分比。#：vs Control，P<0.05；*：vs Model，P<0.05。

2.3 ICSⅡ?qū)Ψ涡用}p-ERK1/2蛋白表達(dá)的影響 p-ERK1/2表達(dá)于胞核，棕褐色為陽性表達(dá)。Control組和Control + ICSⅡ-H組肺小動脈平滑肌上p-ERK1/2幾乎不表達(dá)。與Control組比較，Model組肺小動脈平滑肌上p-ERK1/2表達(dá)明顯增多(P<0.05)；與Model組比較，ICSⅡ-M、ICSⅡ-H組p-ERK1/2表達(dá)減少(P<0.05，見圖3)。

2.4 ICSⅡ?qū)Ψ涡用}p-NF-κB(p65)蛋白表達(dá)的影響 p-NF-κB(p65)表達(dá)于胞核，其陽性表達(dá)為棕褐色。Control組和Control + ICSⅡ-H組肺小動脈平滑肌上p-NF-κB(p65)的表達(dá)較少。與Control組比較，Model組肺小動脈平滑肌上p-NF-κB(p65)表達(dá)明顯增多(P<0.05)；與Model組比較，ICSⅡ-M、ICSⅡ-H組p-NF-κB表達(dá)減少(P<0.05，見圖4)。

A：Control；B：Control+ICSⅡ-H；C：Model；D：ICSⅡ-L；E：ICSⅡ-M；F：ICSⅡ-H；G：p-ERK1/2陽性細(xì)胞百分比。#：vs Control，P<0.05；*：vs Model，P<0.05。

A：Control；B：Control+ICSⅡ-H；C：Model；D：ICSⅡ-L；E：ICSⅡ-M；F：ICSⅡ-H；G：p-NF-κB(p65)陽性細(xì)胞百分比。#：vs Control，P<0.05；*：vs Model，P<0.05。

3 討論

野百合堿(MCT)經(jīng)肝代謝后選擇性作用于肺血管床，損傷肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞，使血管屏障功能受損，血液中彈性蛋白酶、凝血酶等外滲，觸發(fā)單核細(xì)胞等炎癥細(xì)胞在受累動脈周圍浸潤，繼發(fā)肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖，從而誘發(fā)肺動脈重構(gòu)，并伴有明顯的炎癥反應(yīng)[12-13]。本研究結(jié)果顯示，與Control組相比，Control + ICSⅡ-H組各項指標(biāo)均無明顯變化，提示給予最大劑量的ICSⅡ?qū)φ４笫鬅o明顯影響；而Model組大鼠肺小動脈中膜明顯肥厚、管腔狹窄，血管周圍及肺間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤明顯，提示造模成功，與文獻報道一致[14]。與Model組相比，ICSⅡ-M、ICSⅡ-H組大鼠肺小動脈中膜變薄、肺部炎癥情況減輕，提示ICSⅡ具有抗肺動脈重構(gòu)的作用。

肺動脈平滑肌細(xì)胞的異常增殖是肺動脈腔變窄、肺血管阻力增加、誘發(fā)或加重肺動脈重構(gòu)的重要因素[15]。增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)是反映細(xì)胞增殖的重要指標(biāo)，在細(xì)胞增殖的啟動上起重要作用[14]。已有研究表明，在MCT誘導(dǎo)的肺動脈重構(gòu)模型中，PCNA蛋白的表達(dá)明顯升高[14-15]。本研究結(jié)果顯示，與Control組相比，Model組大鼠肺小動脈中膜PCNA蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)，而中膜主要由血管平滑肌細(xì)胞組成[16]，說明在MCT誘導(dǎo)的肺動脈重構(gòu)中肺動脈平滑肌細(xì)胞發(fā)生了明顯的增殖。與Model組相比，ICSⅡ-M、ICSⅡ-H組大鼠肺小動脈中膜PCNA蛋白的表達(dá)下調(diào)，提示ICSⅡ可能通過抑制肺動脈平滑肌細(xì)胞的增殖發(fā)揮抗肺動脈重構(gòu)的作用。

已有研究發(fā)現(xiàn)，ERK1/2信號通路的激活可引起肺動脈平滑肌細(xì)胞的增殖，加重肺動脈高壓的發(fā)生與發(fā)展[4]?；罨腅RK1/2可通過級聯(lián)反應(yīng)調(diào)控其下游基因NF-кB、AP-1等的表達(dá)[17]。NF-κB是真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Rel家族成員之一，被認(rèn)為是調(diào)控炎癥的關(guān)鍵因子。靜息狀態(tài)下，NF-κB與其抑制蛋白IκB以三聚體的形式結(jié)合存在于胞漿，當(dāng)受到多種因素刺激時，IκB在IKK的調(diào)節(jié)下被降解，NF-кB被激活并移位到核內(nèi)，促進炎癥因子的釋放及肺動脈平滑肌細(xì)胞的增殖，引發(fā)肺動脈重構(gòu)[7]。提示抑制ERK1/2-NF-κB信號通路的激活可抑制肺動脈重構(gòu)。本研究結(jié)果顯示，與Control組相比，Model組大鼠肺小動脈中膜p-ERK1/2、p-NF-κB蛋白的表達(dá)均明顯上調(diào)，說明在MCT誘導(dǎo)的肺動脈重構(gòu)中ERK1/2-NF-κB信號通路被激活。與Model組相比，ICSⅡ-M、ICSⅡ-H組大鼠肺小動脈中膜p-ERK1/2、p-NF-κB蛋白的表達(dá)均下調(diào)，提示ICSⅡ可能通過抑制ERK1/2-NF-κB信號通路的激活發(fā)揮抗肺動脈重構(gòu)的作用。