堿性電解水耦合酶提取茶渣蛋白工藝優(yōu)化

譚曉妍,孫君社,寧慧娟,裴海生,曾文慧,胡 靜,張秀清,*

(1.中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院,北京 100083;2.北京農業(yè)部規(guī)劃設計研究院,北京 100125)

中國擁有世界上最豐富的茶葉資源和龐大的茶葉消費市場,并且隨著我國茶葉消費量的逐年增加以及茶葉產業(yè)初、深加工技術的不斷發(fā)展,不可避免地產生大量茶渣[1-2],不僅造成資源的巨大浪費,也會對環(huán)境造成極大的污染,茶渣的處理成了一個急需解決的問題[3]。研究表明,茶渣中的蛋白質不僅具有營養(yǎng)保健作用,還具有清除體內超氧陰離子、降血脂、抗突變、預防心血管疾病和癌癥的功效[4-6]。但茶渣蛋白基本為水不溶性蛋白,其結構復雜、提取較為困難。因此通過有效途徑提取茶渣蛋白,提高茶渣蛋白提取率,從而提高茶葉的經濟附加值以及實現茶渣副產物資源的綜合利用具有重要意義[7]。

目前,茶渣蛋白提取方法多采用NaOH浸提法,同時輔以超聲、微波及蛋白酶等復合提取[8-10]。但NaOH具有強腐蝕性,且該法存在提取率低、所得蛋白水溶性不強等缺點[11]。堿性電解水是電解水制備過程中陰極生成的含有NaOH等物質的堿性水,一直被作為電解水制備過程中的副產物,目前的相關研究較少。與傳統(tǒng)的NaOH水溶液相比,強堿性電解水在制備過程中氧化還原電位(ORP)值可達-1000 mV以下,具有強還原性,可以防止鐵水管中產生赤鐵銹,使水的表面張力降低,從而提高水的洗滌能力。且其含有的活性成分性質不穩(wěn)定,易逐漸恢復為普通水,因而不易對環(huán)境造成污染,較NaOH使用安全可靠。同時,電解水制取裝置結構比較簡單,僅需一個有隔膜的電解槽,在制取過程中無需大量的化學原料以及復雜的單元操作,與生產傳統(tǒng)化學試劑相比成本低廉,有利于其在食品加工等各項事業(yè)中推廣應用[12-14]。

本研究選用堿性電解水用于茶渣蛋白的提取,利用單因素實驗對堿性電解水pH、提取溫度、液固比、提取時間四個因素進行優(yōu)化,確定各因素最佳水平,進行正交實驗優(yōu)化堿性電解水提取茶渣蛋白的最佳工藝。研究進一步添加堿性蛋白酶進行復合提取,有效提高蛋白質提取率,并優(yōu)化了蛋白酶水解條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

龍井綠茶茶渣(粉碎過60目篩) 天津天士力公司;堿性電解水 實驗室自制;堿性蛋白酶(1.0×105U/mL) 上海楷洋生物技術有限公司;總抗氧化能力(T-AOC)測定試劑盒 南京建成生物工程研究所;其他試劑 均為國產分析純。

電解槽 為常規(guī)雙槽隔膜式電解槽(自制),隔膜采用陽離子交換膜(異相膜,上?；S),極板為純鈦板(北京中北鈦業(yè)有限公司),極板距離為14 cm;SPD50半自動凱氏定氮儀及SPT20紅外高溫消解爐 北京三品科創(chuàng)儀器有限公司;PB-10酸度計 德國Startorious公司;SHB-Ⅲ循環(huán)水式多樣真空泵 鄭州長城科工貿有限公司;BS200S電子天平 德國Startorious公司;Agilent1200高效液相色譜儀 美國Agilent公司;HH-S數顯溫控油浴鍋 江蘇金壇榮華儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 茶渣組分分析

1.2.1.1 茶渣中蛋白含量的測定 采用國家標準方法,凱氏定氮法,GB5009.5-2010。

1.2.1.2 茶渣中木質素、纖維素、半纖維素含量測定 采用美國可再生能源實驗室的兩步酸性電解水水解法進行分析[15]。第一步:準確稱取干燥后的茶渣樣品0.300 g放入15 mL試管中,加入3.0 mL 72%的硫酸,漩渦混合,將試管放入30 ℃水浴鍋中保持60 min,期間每隔15 min漩渦混合一次。第二步:將試管從水浴鍋中取出,準確加入去離子水84 mL,將濃硫酸的濃度由72%稀釋至4%,放入高壓滅菌鍋中120 ℃保持1 h。反應結束后,待液體冷卻至室溫,將液體在砂芯漏斗上抽真空進行過濾,濾渣烘干稱重即為酸不溶性木質素含量,酸溶性木質素含量由兩步酸水解的濾液在320 nm下的吸光度測得。將兩步酸水解的濾液過0.22 μm濾膜,HPLC法測定其中木糖與葡萄糖含量,由此計算樣品中纖維素、半纖維素含量。

1.2.1.3 茶渣中水分及干物質含量的測定 采用國家標準方法,105 ℃恒重法,GB5009.3-2010。

1.2.1.4 茶渣中灰分含量的測定 采用國家標準方法,GB5009.4-2010。

1.2.2 堿性電解水的制備 電解電壓:25～35 V;電解電流:0.6 A(定時監(jiān)測,手動調節(jié)變壓器電壓使其穩(wěn)定在此值);電解質濃度:陽極0.1%(NaCl,w/v),陰極1%(NaCl,w/v);定時測定陰極室中堿性電解水的pH,達到所需pH時即可停止電解,收集電解水,密封保存在4 ℃冰箱備用。

1.2.3 堿性電解水提取茶渣蛋白單因素實驗

1.2.3.1 堿性電解水pH對茶渣蛋白提取率的影響 取2 g茶渣于管式反應器中,量取40 mL(液固比20∶1 mL/g)pH分別為10、10.5、11、11.5、12、12.5的堿性電解水至管中,振蕩混勻,封上管蓋,放入溫度為120 ℃的油浴鍋中反應20 min,檢測不同條件下茶渣蛋白的提取率。

1.2.3.2 提取溫度對茶渣蛋白提取率的影響 稱取2 g干燥茶渣于管式反應器中,量取40 mL(液固比為20∶1 mL/g)pH為12.5的堿性電解水加入管式反應器,振蕩混勻,封上管蓋,放入油浴鍋中,處理溫度為90、100、110、120、130 ℃,提取時間為20 min,檢測不同條件下茶渣蛋白的提取率。

1.2.3.3 液固比對茶渣蛋白提取率的影響 稱取2 g干燥茶渣于管式反應器中,按液固比分別為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1 mL/g的添加量,加入pH為12.5的堿性電解水至管式反應器中,振蕩搖勻,封上管蓋,提取溫度和時間分別為120 ℃、20 min,檢測不同條件下茶渣蛋白的提取率。

1.2.3.4 提取時間對茶渣蛋白提取率的影響 取2 g干燥茶渣于管式反應器中,量取80 mL(液固比為40∶1 mL/g)pH12.5的堿性電解水至反應器中,振蕩混勻,封上管蓋,放入溫度為120 ℃的油浴鍋中,提取時間分別為10、20、30、40、50、60 min,檢測不同條件下茶渣蛋白的提取率。

1.2.4 正交實驗確定最佳堿性電解水提取工藝 在單因素優(yōu)化結果的基礎上,選取合適因素及水平進行L9(34)正交實驗,如表1,以茶渣蛋白提取率為指標,優(yōu)化預處理工藝條件,得到最優(yōu)參數組合。

表1 正交實驗因素與水平表

1.2.5 茶渣蛋白初提液蛋白酶酶解條件優(yōu)化 經堿性電解水優(yōu)化工藝提取后的茶渣初提液,加入堿性蛋白酶進一步提取茶渣蛋白。采用單因素實驗優(yōu)化堿性蛋白酶對茶渣初提液蛋白提取率的影響。

1.2.5.1 酶解pH對茶渣蛋白提取率的影響 鑒于堿性蛋白酶酶活力只在堿性條件下較高,選定不同的酶解pH為7.0、7.5、8、8.5、9、9.5、10(用0.1 mol/L HCl或0.1 mol/L NaOH調節(jié)pH)。其他參數水平保持一致:酶解溫度50 ℃,酶添加量1000 IU/g茶渣,酶解時間4 h。酶解反應在恒溫水浴搖床中進行。酶解反應結束時,在100 ℃水浴鍋中保持10 min達到滅酶的目的。

1.2.5.2 酶解時間對茶渣蛋白提取率的影響 設定不同酶解時間分別為2、4、16、32、64 h。其他參數水平保持一致:酶解溫度50 ℃,酶解pH9,酶添加量1000 IU/g茶渣。酶解反應在恒溫水浴搖床中進行。酶解反應結束時,在100 ℃水浴鍋中保持10 min達到滅酶的目的。

1.2.5.3 酶添加量對茶渣蛋白提取率的影響 設定不同的酶添加量:500、1000、1500、2000、2500、3000 IU/g茶渣。其他參數水平保持一致:酶解溫度50 ℃,酶解pH9.0,酶解時間32 h。酶解反應在恒溫水浴搖床中進行。酶解反應結束時,在100 ℃水浴鍋中保持10 min達到滅酶的目的。

1.2.5.4 酶解液總抗氧化能力測定 按照總抗氧化能力(T-AOC)測定試劑盒說明書檢測?？偪寡趸芰τ嬎愎饺缦?

總抗氧化能力(單位/OD樣品)=(測定OD值-對照OD值/0.01)+30×(反應液總量/取樣量)×樣品測試前稀釋倍數

1.2.6 蛋白質提取率 蛋白質含量計算公式如下:

式中,V是處理液總體積,mL;C是鹽酸標準滴定液的濃度,mol/L;6.25是氮換算為蛋白質的系數,一般食物為6.25;20是量取的處理液體積,mL;0.014是1.0 mL鹽酸[c(HCl)=1.000 mol/L]標準滴定液相當的氮的質量,g;m是稱取的茶渣質量,g;0.27是茶渣中蛋白質含量保留兩位小數時的數值。

2 結果與分析

2.1 茶渣組分分析

首先對茶渣主要成分進行分析,結果如表2所示:蛋白質含量為27.78%,與其它研究報道相近,如張曉暉等[16]所報道的茶葉蛋白含量為25.1%;李娟等[17]報道了浙江安吉茶廠提供的茶葉加工廢末中蛋白質含量為23.21%。由表2可知,茶渣中半纖維素、纖維素和木質素含量總和為49.05%,木質素含量較高,達到了30.72%。在植物細胞壁中,木質纖維素包裹著蛋白質,木質纖維素的存在限制了蛋白質的溶出,如何去除木質纖維素是提高茶渣蛋白提取率的有效方法之一[18-19]。已有研究報道表明，堿性電解水可有效去除生物質材料中的木質纖維素成分,能提高秸稈的酶解效率[20]。鑒于此,本研究選擇堿性電解水提取茶渣蛋白,以期提高茶渣中堿溶性蛋白的提取率。

表2 茶渣的基本組成成分

2.2 堿性電解水提取茶渣蛋白工藝條件優(yōu)化

2.2.1 電解水pH對茶渣蛋白提取率的影響 不同電解水pH下蛋白質提取率如圖1。當pH在10～11.5之間時,蛋白質提取率無明顯變化,均在20%左右;當pH>11.5時,隨著pH的增加,茶渣蛋白提取率不斷提高,在pH為12.5時,茶渣蛋白的提取率最高達到38%。而pH12.5是目前實驗室制備的堿性電解水的極限?？梢?茶渣蛋白在強堿性條件下更易被提取。原因可能是在強堿性電解水中(pH>11.5),木質纖維素更易被降解,從而有效提高了茶渣蛋白的溶出率[22]。同時,增強電解水強度也更利于破壞蛋白質分子的次級鍵(特別是氫鍵),使部分極性基團發(fā)生解離,進而增加茶渣蛋白的溶解性[7]。因此隨著堿性電解水的pH升高,茶渣蛋白提取率逐漸升高,但由于pH12.5以上的堿性電解水制備比較困難,綜合考慮,最佳的堿性電解水pH確定為12.5。

圖1 提取pH對蛋白提取率的影響

2.2.2 提取溫度對茶渣蛋白提取率的影響 不同提取溫度下蛋白質提取率如圖2。隨著溫度的升高,茶渣蛋白提取率逐漸提高,其原因可能是不同的提取溫度對茶渣細胞壁的生物質分子結構破壞力不同,隨著溫度的升高,越來越多的半纖維素、纖維素以及木質素結構被破壞以致水解,細胞壁破裂,使得包裹其中的或細胞內的蛋白質等功能性成分被釋放[21],蛋白質溶出量增加,從而起到提高茶渣蛋白提取率的作用。由圖2可見,90～120 ℃之間處理時茶渣蛋白提取率的增長率高于120～130 ℃,同時考慮到過高溫度需要更多能耗,且木質纖維素等糖類更易與蛋白發(fā)生美拉德反應而產生有毒有害物質(醛、酮等)[6],綜合考慮后選擇120 ℃為最佳提取溫度。

圖2 提取溫度對蛋白提取率的影響

2.2.3 液固比對茶渣蛋白提取率的影響 不同液固比下蛋白質提取率如圖3。隨著液固比的增大,茶渣蛋白提取率不斷增大,在液固比為40∶1 mL/g時,茶渣蛋白的提取率達到33%。液固比是影響蛋白質提取率的一個重要因素,堿性電解水的添加量不僅直接影響其與蛋白質相互作用的幾率,還影響互相作用的傳質及傳熱速度,液固比較低時,雖利于蛋白質和堿性電解水的相互接觸,但卻增大了溶液的粘度,影響反應過程傳質和傳熱,導致茶渣蛋白提取率降低;液固比較高時,可降低反應體系的粘度,加快傳質傳熱,利于茶渣蛋白浸出[2]。但液固比過高又會降低蛋白樣品濃度,增加提取難度,造成水資源和能源的浪費,綜合考慮,最佳預處理液固比為40∶1 mL/g。

圖3 液固比對蛋白提取率的影響

2.2.4 提取時間對茶渣蛋白提取率的影響 不同提取時間下蛋白質提取率如圖4。隨著反應時間的延長,茶渣蛋白質提取率逐漸升高。從10～30 min時,蛋白質提取率增長較快,30 min后繼續(xù)反應蛋白質提取率緩慢增長,當提取時間為40 min時，茶渣蛋白提取率可達46%。茶渣中含有的粗蛋白80%以上均為谷蛋白[7],反應初期這些顆粒外層表面的谷蛋白和醇溶谷蛋白比較容易溶出,提取相對簡單。但之后要溶出更多的蛋白質,溶劑必須進入顆粒內部,這樣增加了提取的難度,所以時間的延長對蛋白質提取率的影響不大[2]。由于40 min后蛋白質提取率幾乎不再增長,而且考慮到時間的延長直接影響著生產周期,會造成能耗增加。因此初步確定提取時間為40 min。

圖4 提取時間對蛋白提取率的影響

2.2.5 正交優(yōu)化堿性電解水處理工藝 由單因素實驗可知,堿性電解水的pH、提取溫度、液固比、提取時間四個因素對茶渣蛋白提取率有明顯影響,在此基礎上,對影響茶渣蛋白提取率的四個因素選擇合適的水平,進行L9(34)的正交實驗對提取條件進一步優(yōu)化,以蛋白提取率為指標進行極差分析,正交實驗結果及極差分析見表3,方差分析見表4。

表4 方差分析表

由表4可知,提取溫度、液固比對茶渣蛋白提取率有極顯著作用(p<0.01),堿性電解水的pH對茶渣蛋白提取率有顯著作用(p<0.05);采用直觀分析法,比較極差分析表3中四因素的極差R值,液固比的極差R值為9.5、提取溫度為3.84、提取時間為1.33、堿性電解水pH為2.87,由此可知液固比是影響蛋白質提取率的最主要因素,影響茶渣蛋白提取率的主次因素從大到小順序依次為:液固比>提取溫度>堿性電解水的pH>提取時間。根據極差分析結果,四因素的最優(yōu)水平組合為A3B1C2D3,結合方差分析結果即采用堿性電解水pH為12.5,提取溫度為120 ℃,液固比為40∶1 mL/g,提取時間為40 min。驗證實驗結果表明,在該最佳提取工藝條件下,得到茶渣蛋白提取率為48.3%。

表3 正交實驗結果和極差分析表

本研究直接利用堿性電解水提取茶渣蛋白,替代了傳統(tǒng)的堿法提取。堿性電解水提取條件優(yōu)化后,茶渣蛋白提取率最高達48%,略低于傳統(tǒng)堿法提取的蛋白得率[7,16-17],但也高于部分報道中的蛋白提取率,如蔡志寧等[23]優(yōu)化了茶渣蛋白堿法提取的工藝條件,優(yōu)化后蛋白提取率為36.8%。經過電解的堿性還原水為6個或7個(H2O)的小分子水(自來水為14～16個),由于分子團小,體積小,滲透力強,所以容易進入細胞與細胞之間,導致堿性電解水的滲透力增強。自然界中的大分子團水被迫解離成小分子團水,由于不是自然產生,小分子團水必須還原成大分子團水,此時水分子與水分子在結合過程中快速運動,形成高溶解力,所以導致堿性電解水具有較高的溶解力[14]。而傳統(tǒng)堿提是利用細胞在堿液中會吸水溶脹以致破裂,使細胞中的活性物質釋放出來的原理提高提取率,若堿液濃度過高則會破壞物質結構。因此,堿性電解水提取法較傳統(tǒng)堿提法溫和、破壞力小,且堿性電解水提取可有效減少堿法提取引起的污染性問題,同時堿性電解水作為功能性電解水制備過程中的副產物,它的利用也增加了電解水的附加值。

2.3 茶渣蛋白初提液蛋白酶酶解條件優(yōu)化

茶渣蛋白的酶法提取是近年來的熱點,酶法提取不僅可以有效提高蛋白質的提取率,同時還能改善蛋白質的營養(yǎng)學特性[24]。本研究為進一步提高茶渣蛋白的提取率,嘗試了在堿性電解水的初提液中繼續(xù)添加堿性蛋白酶酶解的復合提取法,同時測定了酶解液的總抗氧化能力,以保證提取出的蛋白質為活性蛋白。

2.3.1 酶解pH對茶渣蛋白提取率和總抗氧化能力的影響 不同酶解pH下蛋白質提取率和總抗氧化能力如圖5。結果表明,pH為7.0～9.0時，隨著pH的增大,茶渣蛋白的提取率逐漸增高;當酶解pH達到9時,蛋白提取率最大(提取率為62%),此結果與鄒小明[11]、李圓圓等[24]的研究結果相同;繼續(xù)提高pH時,蛋白提取率略微降低,說明當pH為9時,堿性蛋白酶的酶活最高,酶對底物作用效果明顯,這與堿性蛋白酶的最適pH相符(最適pH在9～11范圍內),pH過高過低都會對蛋白酶活造成影響。因此,選定堿性蛋白酶酶解pH為9.0。此外,總抗氧化能力變化趨勢與蛋白提取率一致,均在pH9時達到最高。

圖5 酶解pH對蛋白提取率(A)和總抗氧化能力(B)的影響

2.3.2 酶解時間對茶渣蛋白提取率和總抗氧化能力的影響 不同酶解時間下蛋白質提取率和總抗氧化能力如圖6。隨著反應時間的延長,蛋白提取率逐漸提高,酶解時間達到32 h時,提取率最高(提取率為73%),但當酶解時間繼續(xù)延長時,蛋白提取率變化趨于平緩。這是因為隨著時間的延長,底物不斷減少,酶解充分,因此確定最適酶解時間為32 h,且32 h后酶解液總抗氧化能力不再提高。

圖6 酶解時間對蛋白提取率(A)和總抗氧化能力(B)的影響

2.3.3 酶添加量對茶渣蛋白提取率和總抗氧化能力的影響 不同酶添加量下蛋白質提取率和總抗氧化能力如圖7。結果表明，隨酶添加量的增長,蛋白質提取率逐漸提高,加酶量至2500 IU/g茶渣后提取率最高(蛋白提取率為83%),之后再增加酶使用量提取率增長緩慢。一般而言,當底物濃度一定,增加的酶量未使底物濃度飽和時,則酶/底物值越大,反應速度越大,蛋白質的水解率越大。但酶/底物值過大,可能導致酶自身相互水解,酶活力降低,水解度降低[25]。酶的過量使用還會大幅度增加生產成本,綜合考慮后確定酶添加量為2500 IU/g茶渣,該添加量顯著低于趙立娜等[25]水解茶渣蛋白時添加的蛋白酶量(6000 U/g茶渣)。同時,該加酶量下蛋白質的抗氧化活性較高,達到668單位/mL。

圖7 加酶量對蛋白提取率(A)和總抗氧化能力(B)的影響

茶渣蛋白經過堿性電解水及酶兩步提取后,蛋白提取率高達83%,較單一堿性電解水提取提高了34.7%,高于絕大多數已報導的研究結果[7,17,26]。鄒小明等[11]同樣采用復合法提取茶梗中的蛋白,用堿溶液初提后再添加蛋白酶進行提取,提取率達到81.83%,提取水平與本研究相當。同時,該工藝條件下提取出的蛋白質仍具有較高的總抗氧化能力,表明方法可行?；诒狙芯康慕Y果,可進一步考慮結合其他處理技術,如超聲輔助和微波輔助法,以期更加高效地提取茶渣蛋白。如陸晨等[8]采用超聲波技術輔助堿法提取蛋白,提取條件優(yōu)化后蛋白得率增高至86.5%;文靜等[14]采用微波輔助堿法提取茶渣蛋白,最高提取率可達89.01%。但傳統(tǒng)的氫氧化鈉堿提法存在一定弊端,如設備腐蝕、環(huán)境污染和安全隱患,選擇一種安全高效的新型處理方法具有重要意義。因此,堿性電解水以其易制備、無污染、安全性高的特點，在茶渣蛋白提取中具有顯著優(yōu)勢。

3 結論

堿性電解水提取后再添加堿性蛋白酶提取茶渣蛋白的方法效果較好,優(yōu)化后最佳工藝條件為:堿性電解水pH為12.5,提取溫度120 ℃,液固比為40∶1 (mL/g),提取時間40 min,堿性蛋白酶酶解pH9.0,酶解時間32 h,酶添加量2500 IU/g茶渣。在該條件下,蛋白質提取率為83%,總抗氧化能力為668單位/mL。該復合提取法提取率高,且充分利用作為功能水制備過程中副產物的堿性電解水,為擴大再生產提供了良好的理論依據。