枸櫞酸鉀對(duì)大鼠腎草酸鈣結(jié)石形成的影響

劉 英 王志勇 楊德慧 劉曉偉 高旭紅 徐 輝

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿外科，河北 承德 067000)

泌尿系結(jié)石復(fù)發(fā)率高，成因和機(jī)制尚不十分清楚，草酸鈣結(jié)石是泌尿系結(jié)石的最常見成分，腎小管上皮細(xì)胞損傷可能為腎草酸鈣結(jié)石形成的基礎(chǔ)病變，在某些因素的作用下，腎小管上皮受到損傷，有利于結(jié)石成分附著，且變性壞死細(xì)胞調(diào)入腎小管管腔內(nèi)有利于晶體的異相成核。枸櫞酸是尿石癥形成的抑制物質(zhì)，升高尿中枸櫞酸濃度對(duì)尿石癥具有防治作用〔1〕。Tamm-Horsfall蛋白是一種大分子有機(jī)物，和尿石癥的形成關(guān)系密切〔2〕。本文對(duì)枸櫞酸鉀對(duì)大鼠腎草酸鈣結(jié)石形成的影響進(jìn)行研究，并觀察其對(duì)腎組織Tamm-Horsfall蛋白表達(dá)強(qiáng)度的影響，探討枸櫞酸鉀防治腎草酸鈣結(jié)石形成的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)、雄性、成年SD大鼠27只，體重190～240 g，購(gòu)自北京隆安實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心，許可證號(hào)：SYXK(京)2014-0040。

主要藥品和試劑：乙二醇、氯化銨(湖南匯虹試劑有限公司)，枸櫞酸鉀(上?；瘜W(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)站)，羊抗兔ABC染色系統(tǒng)試劑盒、Tamm-Horsfall多克隆抗體(美國(guó)Sigma公司)等。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1分組 27只大鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字法隨機(jī)分為枸櫞酸鉀組、腎結(jié)石組和對(duì)照組，每組9只。對(duì)照組大鼠喂普通飲用水，腎結(jié)石組喂0.5%氯化銨和0.5%乙二醇混合液致石劑，枸櫞酸鉀組喂上述致石劑的同時(shí)給予25%枸櫞酸鉀液(1 ml/100 g灌胃，1次/d)，腎結(jié)石組和對(duì)照組給予等量飲用水灌胃，共14 d。14 d后留取24 h尿液進(jìn)行尿鈣離子和尿草酸濃度測(cè)定。下肢靜脈采血5 ml進(jìn)行血生化指標(biāo)檢測(cè)，然后麻醉大鼠打開腹腔，暴露腎臟，取雙側(cè)腎臟進(jìn)行HE染色和免疫組化染色檢驗(yàn)。

1.2.224 h尿鈣離子和尿草酸濃度測(cè)定 24 h尿鈣離子濃度采用全自動(dòng)生化儀測(cè)定；24 h尿草酸濃度采用鉻酸鉀氧化甲基紅催化光度法測(cè)定。

1.2.3血生化指標(biāo)測(cè)定 血肌酐、血尿酸、血尿素氮均采用全自動(dòng)生化儀進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4草酸鈣結(jié)晶分級(jí)評(píng)分及腎組織HE染色 光鏡下觀察腎小管草酸鈣結(jié)晶情況并進(jìn)行評(píng)分；將腎臟組織切片后進(jìn)行常規(guī)HE染色，觀察腎小管草酸鈣結(jié)晶形成情況，并在光鏡下對(duì)腎小管草酸鈣結(jié)晶沉積進(jìn)行分級(jí)：0級(jí)沒有草酸鈣結(jié)晶；Ⅰ級(jí)有細(xì)小結(jié)晶但不成堆；Ⅱ級(jí)草酸鈣結(jié)晶變大成堆，但相互之間不連接；Ⅲ級(jí)草酸鈣結(jié)晶之間相互連接；Ⅳ級(jí)草酸鈣結(jié)晶廣泛成堆，連接成片。

1.2.5腎組織Tamm-Horsfall蛋白表達(dá)測(cè)定 采用免疫組化法測(cè)定大鼠腎組織Tamm-Horsfall蛋白表達(dá)，以腎組織Tamm-Horsfall多克隆抗體為一抗，設(shè)立陰性對(duì)照組〔以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗〕，顯微鏡下觀察腎組織Tamm-Horsfall蛋白表達(dá)強(qiáng)度，其中淡黃色(輕度染色)為“+”，棕黃色(中度染色)為“”，棕褐色(深度染色)為“”。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件，正態(tài)分布多組均數(shù)比較采用方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，腎內(nèi)結(jié)晶評(píng)分采用非參數(shù)Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；三組腎組織Tamm-Horsfall蛋白表達(dá)強(qiáng)度比較采用非參數(shù)Kruskal-Walls檢驗(yàn)，組內(nèi)兩兩比較采用非參數(shù)Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，Tamm-Horsfall蛋白表達(dá)等級(jí)與腎結(jié)石相關(guān)性采用kendall tau-b等級(jí)相關(guān)系數(shù)分析。

2 結(jié) 果

2.1三組大鼠24 h尿鈣離子和尿草酸濃度比較 三組大鼠24 h尿鈣離子和尿草酸濃度比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中枸櫞酸鉀組和腎結(jié)石組24 h尿鈣離子和尿草酸濃度均高于對(duì)照組(P<0.05)，腎結(jié)石組24 h尿鈣離子和尿草酸濃度高于枸櫞酸鉀組(P<0.05)。見表1。

表1 三組24 h尿鈣離子和尿草酸濃度比較

與枸櫞酸鉀組比較：1)P<0.05；與腎結(jié)石組比較：2)P<0.05；下表同

2.2三組血生化指標(biāo)比較 三組血肌酐、血尿酸、血尿素氮比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中腎結(jié)石組血肌酐、血尿酸、血尿素氮水平均高于枸櫞酸鉀組和對(duì)照組(P<0.05)，枸櫞酸鉀組血尿酸高于對(duì)照組(P<0.05)，枸櫞酸鉀組血肌酐和血尿素氮與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 三組血生化指標(biāo)比較

2.3三組大鼠腎草酸鈣結(jié)石HE染色 對(duì)照組大鼠腎小管未見草酸鈣結(jié)晶，腎小管結(jié)構(gòu)正常；腎結(jié)石組大鼠多數(shù)腎小管內(nèi)見草酸鈣結(jié)晶，腎小管擴(kuò)張；枸櫞酸鉀組部分腎小管內(nèi)見草酸鈣結(jié)晶，腎小管擴(kuò)張，但均較腎結(jié)石組輕。

2.4枸櫞酸鉀組和對(duì)照組草酸鈣結(jié)晶分級(jí)評(píng)分比較 對(duì)照組腎小管無(wú)草酸鈣結(jié)晶形成，枸櫞酸鉀組草酸鈣結(jié)晶分級(jí)得分(0.61±0.43)顯著低于腎結(jié)石組(1.52±0.94，Z=15.253，P<0.05)。

2.5三組腎組織Tamm-Horsfall蛋白表達(dá)強(qiáng)度比較 三組Tamm-Horsfall蛋白均在腎小管亨氏攀和遠(yuǎn)曲小管表達(dá)，三組之間Tamm-Horsfall蛋白表達(dá)強(qiáng)度比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中枸櫞酸鉀組平均秩次為14.11，腎結(jié)石組平均秩次5.89，對(duì)照組平均秩次為22.00，腎結(jié)石組Tamm-Horsfall蛋白表達(dá)強(qiáng)度低于枸櫞酸鉀組和對(duì)照組(P<0.05)，枸櫞酸鉀組Tamm-Horsfall蛋白表達(dá)強(qiáng)度顯著高于腎結(jié)石組(P<0.05)。見表3。

表3 三組腎組織Tamm-Horsfall蛋白表達(dá)強(qiáng)度比較(n,n=9)

2.6Tamm-Horsfall蛋白表達(dá)與腎結(jié)石形成的關(guān)系 Tamm-Horsfall蛋白表達(dá)等級(jí)與腎結(jié)石形成呈負(fù)相關(guān)(r=-0.827，P=0.000)。

3 討 論

大鼠草酸鈣結(jié)石模型的建立有多種方法，包括乙二醇法、草酸鹽法、乙醇酸法、葡萄糖酸鈣法等，這些方法均可增加尿中草酸鹽濃度〔3～5〕，而草酸鈣結(jié)石形成的最危險(xiǎn)因素即為草酸鹽，乙二醇為草酸前體，重復(fù)性好，形成結(jié)石穩(wěn)定，且價(jià)格低廉。本文表明乙二醇能夠成功建立大鼠草酸鈣結(jié)石模型。

枸櫞酸鹽是結(jié)晶抑制劑和絡(luò)合劑，能夠增加尿液pH值，是尿液堿化劑，使尿酸溶解度增加，促進(jìn)尿結(jié)石排除，對(duì)于泌尿系統(tǒng)酸性結(jié)石的治療效果更佳，是常用的泌尿系統(tǒng)結(jié)石治療藥物〔6,7〕。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，枸櫞酸鉀對(duì)腎草酸鈣結(jié)石的形成有抑制作用。高草酸尿和高鈣尿是草酸鈣結(jié)石的主要誘發(fā)因素，高鈣尿可以造成草酸鈣過飽和形成泌尿系結(jié)石；高草酸尿?qū)δI細(xì)胞有毒性作用，當(dāng)腎上皮細(xì)胞在草酸中暴露時(shí)，腎上皮細(xì)胞的活性受到影響，草酸還可引起細(xì)胞線粒體功能變化，從而引起上皮細(xì)胞壞死和凋亡，促進(jìn)結(jié)晶黏附，并促進(jìn)結(jié)晶的核化和生長(zhǎng)〔8〕。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：枸櫞酸鉀能夠降低尿中鈣離子和尿草酸濃度，考慮枸櫞酸和尿中的鈣離子結(jié)合形成枸櫞酸鈣，降低尿中鈣離子濃度和草酸鈣飽和度，從而抑制了草酸鈣結(jié)晶的形成。

腎臟具有多種功能，血肌酐、血尿酸、血尿素氮是反映腎臟功能的重要指標(biāo)，肌酐為肌酸的終末產(chǎn)物，肌酸量和肌肉量關(guān)系密切，兩者呈正比，正常情況下，肌酐的產(chǎn)生速度比較穩(wěn)定，并釋放入血；尿素為蛋白質(zhì)的代謝產(chǎn)物，腎臟為尿素的主要排泄器官。當(dāng)腎臟受到損害時(shí)，血清肌酐、尿酸、尿素氮水平升高〔9～11〕。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腎草酸鈣結(jié)石大鼠的腎臟功能明顯受到損害，而枸櫞酸鉀灌胃可以降低血肌酐、血尿酸、血尿素氮水平，有利于腎臟功能的恢復(fù)。

Tamm-Horsfall蛋白是泌尿系統(tǒng)結(jié)石形成的重要抑制因子，是尿液中含量最多的蛋白質(zhì)之一，和泌尿系結(jié)石的形成關(guān)系密切〔12,13〕。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常大鼠腎組織中Tamm-Horsfall蛋白表達(dá)等級(jí)比較高，腎結(jié)石組大鼠腎組織Tamm-Horsfall蛋白表達(dá)等級(jí)比較低，枸櫞酸鉀可以升高腎草酸鈣結(jié)石大鼠腎組織中Tamm-Horsfall蛋白表達(dá)等級(jí)。Tamm-Horsfall蛋白在枸櫞酸離子的作用下聚集傾向減弱，抑制結(jié)晶聚集、生長(zhǎng)、成核作用增強(qiáng)。Tamm-Horsfall蛋白表達(dá)等級(jí)越高，腎草酸鈣結(jié)石的形成越少；Tamm-Horsfall蛋白表達(dá)等級(jí)越低，腎草酸鈣結(jié)石形成越多。因此，考慮枸櫞酸鉀抑制腎草酸鈣結(jié)石形成的機(jī)制可能和枸櫞酸鉀能夠增加Tamm-Horsfall蛋白表達(dá)量有關(guān)。