NF-κB對肺癌細胞生長、細胞周期及腫瘤壞死因子-α分泌的影響

趙 旭 王曉寒 廣 東 張 銘

(河南護理職業(yè)學院，河南 安陽 455000)

TheeffectofNF-κBonthegrowth,cellcycleandTNF-αsecretionoflungcancercells

ZHAOXu,WANGXiao-Han,GUANGDong,etal.

HenanVocationalCollegeofNursing,Anyang455000,Henan,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of NF-κB on the growth, cell cycle and secretion of TNF-α in lung cancer cells.MethodsNF-κB inhibitor SN50 was used to treat lung cancer cells, the cell proliferation was tested by MTT, cell cycle and apoptosis were measured by flow cytometry. The content of TNF-α in supernatant of culture liquid was determined by ELISA. Western blot was used to determine the levels of CyclinB1, CyclinD1, cleaved Caspase-3, Bax, NF-κBp65 proteins.ResultsSN50 inhibited the proliferation of lung cancer cells, and with the increasing of SN50 concentration and time.The apoptosis rate of lung cancer cells after SN50 treatment was significantly higher than that of normal lung cancer cells(P<0.05).The proportion of G2/M in lung cancer cells after SN50 treatment was significantly higher than that of normal lung cancer cells (P<0.05). The level of TNF-α in lung cancer cell culture solution after SN50 treatment was significantly higher than that of normal lung cancer cells (P<0.05). The levels of CyclinB1, CyclinD1 and NF-κBp65 in lung cancer cells treated with SN50 were significantly lower than those of normal lung cancer cells. The levels of cleaved Caspase-3 and Bax were significantly higher than those of normal cultured lung cancer cells(P<0.05).ConclusionsInhibition of NF-κB signaling pathway could inhibit the proliferation of lung cancer cells, block cell cycle at G2/M stage, induce apoptosis, promote the expressions of cleaved Caspase-3 and Bax, down-regulate the levels of CyclinB1 and CyclinD1 protein.

【Keywords】 NF-κB; Lung cancer; Cell cycle; TNF-α

肺癌的死亡率和發(fā)病率均處于惡性腫瘤的首位，早期臨床癥狀不明顯，多數(shù)患者在確診時已是晚期。分子靶向治療、手術(shù)治療等常見的肺癌治療手段取得了一定進步，但其綜合治療效果仍然不能完全滿足需求〔1〕。核因子(NF)-κB是最早發(fā)現(xiàn)于成熟B細胞中的轉(zhuǎn)錄因子，具有淋巴細胞特異性，其在各種細胞中均有表達，能夠調(diào)控腫瘤、心血管系統(tǒng)等多種疾病的發(fā)生，其在腫瘤中過度激活，其激活后可以促進抗凋亡蛋白的產(chǎn)生發(fā)揮腫瘤促進作用〔2,3〕。研究顯示，NF-κB和腫瘤壞死因子(TNF)相互作用，共同調(diào)控腫瘤的發(fā)生，NF-κBp65是NF-κB的一個亞單位，在肺癌中過度表達〔4,5〕。本研究用NF-κB信號通路抑制劑處理肺癌細胞，通過MTT、流式細胞術(shù)等方法測定NF-κB對肺癌細胞增殖、凋亡、細胞周期及分泌TNF-α的影響。

1 材料與方法

1.1材料 肺癌細胞LAC購自上海和序生物；NF-κB抑制劑SN50購自美國MedChemExpress；電化學發(fā)光(ECL)試劑購自于碧云天；聚偏氟乙烯(PVDF)膜購自于美國Millipore；細胞周期測定試劑盒購自美國BD；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度試劑盒購自美國Thermo；NF-κBp65抗體購自美國Cell sigaling Technology；細胞周期蛋白(Cyclin)B1抗體、CyclinD1抗體購自美國Santa Cruz；剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(酶切Caspase)-3抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體購自美國Abacm；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體購自美國R&D Systems；TNF-α含量測定試劑盒購自上?？道噬?；膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-FITC/碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒購自上海Bogoo。

1.2MTT檢測細胞增殖 LAC細胞濃度調(diào)整為5×104個/ml，種植到96孔板中，每孔中約有4 000個細胞。觀察細胞貼壁后，提前設(shè)置每個濃度梯度4個重復(fù)孔，把原來的細胞培養(yǎng)液吸除后，添加含有SN50的培養(yǎng)液，濃度依次為：0、3、6、12、24、48 μmol/L，分別培養(yǎng)24、48、72 h后取出培養(yǎng)板，在每個孔中依次加入20 μl MTT，繼續(xù)放在培養(yǎng)箱中孵育4 h。傾斜培養(yǎng)板，把上清液吸除以后，每孔中再加入150 μl二甲基亞砜，低速搖床孵育5 min。把培養(yǎng)板放置于酶標儀上檢測490 nm的OD值。

1.3細胞分組處理 LAC細胞分為對照組和SN50組，對照組在實驗開始時在培養(yǎng)液中添加0 μmol/L SN50，SN50組添加12 μmol/L SN50。

1.4流式細胞術(shù)測定細胞周期 對照組、SN50組細胞分別培養(yǎng)48 h，收集細胞，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)將細胞沉淀洗滌2次，在細胞中加入1 ml、70%的乙醇固定，1 000 r/min離心5 min，用移液槍把上清吸除后，每管中添加0.5 ml PI，充分混合，37℃，避光反應(yīng)30 min。用流式細胞儀測定各組細胞周期。

1.5Annexin V-FITC/PI法測定肺癌細胞凋亡 對照組、SN50組細胞分別培養(yǎng)48 h，胰蛋白酶消化后，收集細胞，加入500 μl緩沖液，完全混合后，再添加Annexin V-FITC、PI各5 μl，在室溫中孵育結(jié)合15 min。立即用流式細胞儀測定各組細胞凋亡水平。

1.6酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定肺癌細胞分泌的TNF-α含量 對照組、SN50組細胞分別培養(yǎng)48 h，收集各組培養(yǎng)液上清，用ELISA測定TNF-α水平，操作步驟參照TNF-α含量測定試劑盒。

1.7Western印跡測定肺癌細胞中CyclinB1、CyclinD1、酶切Caspase-3、Bax、NF-κBp65蛋白水平 對照組、SN50組細胞分別培養(yǎng)48 h，用冰預(yù)冷后的PBS洗滌后，用移液槍把PBS去除，按照每個6 cm的培養(yǎng)皿中添加200 μl裂解液裂解細胞(冰上30 min)，把細胞刮下并收集，4℃，12 000 r/min離心10 min。BCA測定各組蛋白濃度。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳：每個蛋白樣品上樣60 μg約20 μl，在100℃與上樣緩沖液混合煮沸5 min，在積層膠中用80 V電壓電泳，在分離膠中用120 V恒壓電泳，溴酚藍染料進入凝膠的最底部時停止電泳。轉(zhuǎn)膜：90 V恒壓、轉(zhuǎn)膜90 min，把蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。把膜放在5%脫脂奶粉中孵育1 h，再用TBST洗2次后，放在稀釋好的一抗(CyclinB1按1∶800稀釋、CyclinD1按1∶800稀釋、酶切Caspase-3按1∶1 000稀釋、Bax按1∶800稀釋、NF-κBp65按1∶800稀釋)中在4℃反應(yīng)過夜，再用TBST洗2次后，再把膜放在稀釋好的二抗(1∶2 000稀釋)中室溫結(jié)合2 h。用ECL發(fā)光以后，曝光儀曝光，Quantity One定量分析蛋白，GAPDH為內(nèi)參。

1.8統(tǒng)計分析 應(yīng)用SPSS21.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1NF-κB抑制劑降低肺癌細胞增殖能力 0、3、6、12、24、48 μmol/L NF-κB抑制劑SN50作用后肺癌細胞24 h的OD值依次為：0.46±0.02、0.39±0.04、0.33±0.02、0.27±0.01、0.22±0.02、0.15±0.01，48 h的OD值依次為：0.84±0.09、0.65±0.05、0.58±0.06、0.44±0.04、0.36±0.03、0.23±0.04，72 h的OD值依次為：1.17±0.08、1.02±0.06、0.85±0.07、0.72±0.05、0.62±0.04、0.41±0.03；3、6、12、24、48 μmol/L的SN50作用后細胞OD值明顯低于0 μmol/L，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。6、12、24、48 μmol/L作用后細胞OD值明顯低于3 μmol/L，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。12、24、48 μmol/L作用后細胞OD值明顯低于6 μmol/L，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。24、48 μmol/L作用后細胞OD值明顯低于12 μmol/L，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。48 μmol/L SN50作用后細胞OD值明顯低于24 μmol/L，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 NF-κB抑制劑在24、48、72 h均能夠抑制肺癌細胞的增殖，后續(xù)選用作用時間為48 h繼續(xù)研究。計算SN50在48 h的半數(shù)抑制濃度約為12 μmol/L，選用12 μmol/L的SN50作用肺癌細胞48 h做后續(xù)研究。

2.2NF-κB抑制劑誘導(dǎo)肺癌細胞凋亡 SN50組細胞凋亡率〔(35.49±4.61)%〕明顯高于對照組〔(9.17±0.82)%，t=9.736,P<0.05〕。見圖1。

2.3NF-κB抑制劑阻滯肺癌細胞周期 對照組、SN50組細胞G0/G1比例為(63.50±4.15)%、(41.28±3.85)%，G2/M比例為(14.83±1.32)%、(35.88±3.64)%，S期比例為(21.67±1.86)%、(22.84±2.40)%。SN50組細胞G0/G1比例明顯低于對照組，G2/M比例明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(t=6.799,9.416；均P<0.05)，而S期比例差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.4NF-κB抑制劑誘導(dǎo)肺癌細胞分泌TNF-α SN50組細胞分泌的TNF-α水平〔(6.47±0.52)μg/ml〕明顯高于對照組〔(3.15±0.30)μg/ml〕，差異有統(tǒng)計學意義(t=9.579,P<0.05)。

圖1 抑制NF-κB后肺癌細胞凋亡情況

2.5NF-κB抑制劑減少CyclinB1、CyclinD1表達并促進酶切Caspase-3、Bax表達 SN50組細胞中CyclinB1、CyclinD1、NF-κBp65水平明顯低于對照組，酶切Caspase-3、Bax水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2，表1。

圖2 Western印跡檢測細胞中CyclinB1、CyclinD1、酶切Caspase-3、Bax、NF-κBp65水平

組別CyclinB1CyclinD1酶切Caspase-3BaxNF-κBp65對照組0.84±0.091.23±0.110.45±0.050.59±0.080.64±0.05SN50組0.36±0.050.42±0.061.10±0.091.45±0.160.21±0.03t/P值8.075/<0.0511.197/<0.0510.935/<0.058.327/<0.0512.773/<0.05

3 討 論

正常情況下，NF-κB以二聚體的形式存在于細胞質(zhì)內(nèi)，NF-κBp65是NF-κB作用最為重要、分布最為廣泛的亞單位〔6,7〕。NF-κB與人類腫瘤發(fā)生有關(guān)，并且與腫瘤的臨床分期、發(fā)展、預(yù)后等具有相關(guān)性，其誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生的作用機制主要與抗腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞生長、影響細胞內(nèi)DNA復(fù)制等有關(guān)，另外，腫瘤微環(huán)境對腫瘤組織中NF-κB的激活也具有重要作用〔8,9〕。在淋巴系腫瘤中發(fā)現(xiàn)NF-κB過度激活，而降低NF-κB激活后可以抑制癌細胞的惡性增殖〔10〕。裸鼠基因敲除NF-κB后，肝臟細胞過度凋亡，出現(xiàn)退行性病變〔11〕。在Hela和Jurkat細胞中發(fā)現(xiàn)，激活NF-κB后可以降低TNF-α誘導(dǎo)的腫瘤細胞凋亡〔12〕。厚銀環(huán)等〔13〕研究表明，NF-κB在肺癌中的陽性率超過60%，而在非肺癌組織中的陽性率只有15%左右。本研究用NF-κB信號通路抑制劑處理肺癌細胞，肺癌細胞的增殖能力下降，說明抑制NF-κB可以抑制肺癌細胞增殖。進一步用流式細胞術(shù)測定細胞周期和細胞凋亡情況，結(jié)果說明NF-κB抑制后可以阻滯肺癌細胞周期，誘導(dǎo)肺癌細胞凋亡，這些與上述實驗報道相符合，均說明NF-κB抑制以后可以阻礙腫瘤的發(fā)展。

NF-κB還具有調(diào)控腫瘤細胞生長的作用，可以通過作用于周期蛋白，影響腫瘤細胞周期，促進腫瘤細胞的增殖〔14〕。CyclinD1、CyclinB1是NF-κB的靶基因，NF-κB激活后可以促進CyclinD1、CyclinB1的表達，影響腫瘤細胞周期〔15,16〕。有研究顯示，NF-κB可以調(diào)控胰腺癌、甲狀腺癌、乳腺癌等多種癌細胞的細胞周期，影響癌細胞中周期相關(guān)蛋白的表達〔17～19〕。Caspase級聯(lián)反應(yīng)與多種細胞的凋亡有關(guān)，幾乎參與所有細胞的凋亡過程，細胞凋亡信號發(fā)出后，Caspase被激活，發(fā)生類似于“瀑布”的級聯(lián)反應(yīng)，Caspase-3位于Caspase凋亡反應(yīng)的最末端，其被剪切后形成具有活性的酶切Caspase-3，最終誘導(dǎo)細胞凋亡的發(fā)生〔20〕。Bax是除了Caspase蛋白家族之外的另一個與細胞凋亡密切相關(guān)的Bcl-2蛋白家族成員之一，可以與Caspase共同作用誘導(dǎo)細胞凋亡發(fā)生〔21〕。本實驗結(jié)果表明，NF-κB抑制后肺癌細胞中酶切Caspase-3、Bax蛋白水平升高，而細胞中CyclinD1、CyclinB1蛋白水平降低，與NF-κB抑制劑誘導(dǎo)肺癌細胞凋亡和阻滯細胞周期結(jié)果相符合。

TNF-α在血管生成、細胞遷移、免疫激活等方面具有重要作用，在腫瘤細胞的生長、凋亡等過程中也具有調(diào)控作用〔22〕。研究顯示，TNF-α可以誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，阻礙腫瘤細胞生長，具有抗腫瘤作用〔23〕。夏啟松等〔24〕研究顯示，大黃素抑制肺癌細胞體外增殖能力的同時誘導(dǎo)肺癌細胞分泌TNF-α。葉小衛(wèi)等〔25〕研究顯示，亞砷酸在誘導(dǎo)肺癌細胞凋亡的同時促進肺癌細胞表達TNF-α。本研究結(jié)果顯示，NF-κB抑制劑可以誘導(dǎo)肺癌細胞分泌TNF-α。

綜上，下調(diào)NF-κB激活可以抑制肺癌細胞生長，誘導(dǎo)Caspase-3、Bax介導(dǎo)的細胞凋亡，下調(diào)CyclinD1、CyclinB1蛋白表達阻滯細胞周期，促進細胞分泌TNF-α，這明確了抑制NF-κB對肺癌細胞生長、凋亡及細胞周期的作用，為以后研究NF-κB在腫瘤發(fā)病機制中的作用提供了參考依據(jù)。